一種應用ssr分子標記技術鑒定商品卷煙的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種應用SSR分子標記技術鑒定商品卷煙的方法，屬于分子生物學領域。本發(fā)明運用SSR技術對單品種煙草進行遺傳圖譜分析，從中篩選出變異率適中、具有品種特異性的SSR位點。提取商品卷煙煙絲的總DNA，用篩選出的特異性引物進行擴增，將獲得的遺傳變異式樣與單品種的式樣進行對比，根據(jù)品種特異性位點的有無可分辨出商品卷煙煙絲中所含煙葉品種，對照相應的卷煙配方中煙葉品種的使用情況，便能鑒定卷煙的真?zhèn)?。同時該方法也適用于單品種煙葉、葉組絲及混合品種煙絲樣品的鑒定。
【專利說明】—種應用SSR分子標記技術鑒定商品卷煙的方法
【技術領域】:
[0001]本發(fā)明屬于分子生物學【技術領域】，具體地說，本發(fā)明涉及應用一種分子生物學技術方法進行商品卷煙的鑒定。同時，本發(fā)明還涉及所述方法對單品種煙葉和混合煙絲樣品的鑒定。
【背景技術】:
[0002]煙草作為人類最重要的經(jīng)濟作物之一，其遺傳學特征一直都是研究的熱點，目前，煙草的基因組全序列圖譜已完成，這使人們能夠從基因組的層面上更深入地對煙草進行研究。其中，關于煙草品種的遺傳多樣性研究不在少數(shù)，但從葉組配方和商品煙的角度研究還未見報道。原料品質(zhì)的穩(wěn)定和杜絕假冒偽劣產(chǎn)品是卷煙品牌生命力的重要保障。分子生物學技術在目前來說是最精確的品種鑒定手段，將其應用到商品卷煙真?zhèn)魏驮掀贩N的鑒定中，可更精確地了解原料組成，達到防偽的目的。
[0003]DNA簡單重復序列(SSR)也稱為微衛(wèi)星DNA，是真核生物基因組中廣泛分布的短串聯(lián)DNA序列，由串聯(lián)重復的核心序列和兩側(cè)較保守的側(cè)翼序列構成。通常每個重復單位僅I-8個堿基，重復數(shù)為10-20次。在特定位點上按孟得爾方式分離的微衛(wèi)星DNA提供了變異豐富、選擇中性、共顯性的分子標記，可用于植物種間、種內(nèi)居群間以及個體間的多態(tài)性分析，在遺傳作圖、群體遺傳研究、個體間親緣關系以及品種鑒定等方面得到了廣泛應用。成品煙絲由于生產(chǎn)和加工過程中DNA降解較為嚴重，通?？商崛〉腄NA長度較短，因此限制了對于DNA質(zhì)量要求較高的遺傳標記技術(如AFLP等)的應用。而SSR標記目標DNA片段長度通常在100-400bp，因此，SSR技術為DNA質(zhì)`量較差的植物產(chǎn)品的分子鑒定提供了可能。對不同煙草品種進行遺傳圖譜分析，建立煙草品種DNA指紋，篩選品種特異性SSR多態(tài)性變異式樣，通過比對成品煙絲SSR多態(tài)性特征，可能對成品煙原料品種及其來源進行鑒定。并且，SSR技術識別靈敏度高，可鑒別出混合樣品中含量較少的目標樣品。以往商品卷煙真?zhèn)闻卸ㄒ罁?jù)產(chǎn)品商標、包裝和抽吸感官，而采用分子生物學的方法根據(jù)卷煙原料品種進行鑒定目前還未有報道。

【發(fā)明內(nèi)容】
:
[0004]本發(fā)明根據(jù)煙草全基因組序列設計煙草SSR引物，用所設計的引物對單品種的煙草DNA進行擴增，篩選有品種特異性的位點。提取需要檢測的商品卷煙煙絲或混合品種煙絲的總DNA，用篩選出的具有品種特異性的引物對其進行擴增，根據(jù)擴增所得的片段判斷樣品中品種的組成，從而鑒定商品卷煙或混合煙絲的真?zhèn)?。此方法可直觀從電泳圖譜上進行煙草品種的鑒定，鑒別結果準確可靠，靈敏度高，具有較好的應用前景，豐富了卷煙鑒定的手段。
[0005]基于上述認識，本發(fā)明的目的在于提供一種直觀、準確的鑒定商品卷煙或混合煙絲樣品的方法。
[0006]本發(fā)明的目的是通過下述技術方案予以實現(xiàn)的:[0007]—種應用SSR分子標記技術鑒定商品卷煙的方法，將SSR分子標記技術應用于商品卷煙的鑒定中，通過識別單品種或混合品種的特征條帶，掌握所鑒定樣品的原料品種組成，達到辨別真?zhèn)蔚哪康?，方法如?
[0008](I)從煙草基因組序列中隨機選擇具有SSR序列的區(qū)間設計引物，目標片段長度在 110 — 250bp ；
[0009](2)提取單品種煙草DNA ；
[0010](3)品種特異性引物的篩選，將所設計的全部SSR引物在所收集的煙草單品種樣品中進行擴增，篩選多態(tài)性僅存在于品種間的具有品種特異性的SSR標記；
[0011](4)鑒定，提取需要鑒定樣品的總DNA，用篩選出的品種特異性引物進行擴增，根據(jù)電泳圖譜顯示的品種特異性條帶，判斷樣品中品種組成，通過與正品配方進行對比，鑒定卷煙真?zhèn)巍?br> [0012]所述的方法適用的鑒定范圍為單品種煙葉、葉組絲及混合品種煙絲。
[0013]品種特異性引物的設計和篩選采用:
[0014](I) SSR多態(tài)性引物設計
[0015]從煙草基因組序列中隨機選擇具有SSR序列的區(qū)間設計引物。從GENBANK數(shù)據(jù)庫中下載煙草全基因組序列，通過SSR Hunter軟件搜索包含SSR位點的序列，通過01igo6.0在其兩側(cè)設計引物，目標片段長度在110 - 250bp。
[0016](2)單品種煙草DNA提取
[0017]取新鮮或干燥不同年份、產(chǎn)地紅花大金元、NC102、K326等單品種煙草葉片，分別將其組織研磨成細粉末，放入2mL離心管中，加入0.4-lmL65°C預熱的CTAB提取緩沖液和I-2 μ L0.2% V/V的巰基乙醇，震蕩混勻；65°C水浴40min，每隔8min混勻一次，水浴結束后每管樣品加入等體積的24:1氯仿/異戊醇混合液，混勻，12000r/min離心IOmin后，將上清液轉(zhuǎn)入新的2mL離心管中，重復此步驟一次；離心管中加入70%體積已在4°C冰箱中放置預冷的異丙醇，混勻液體，放置_20°C冰箱Ih ;再用12000r/min離心lOmin，棄上清，沉淀用20-40mL70%乙醇和無水乙醇各洗兩次，倒出管中乙醇后，將管子敞口放置40°C恒溫箱中干燥；待管子完全干燥后，置于_20°C冰箱中儲存。
[0018](3)品種特異性引物篩選
[0019]全部SSR引物在所收集的煙草單品種樣品中進行PCR擴增，篩選多態(tài)性僅存在于品種間的具有品種特異性的SSR標記，引物篩選中PCR產(chǎn)物均用8%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，銀染顯色。用品種特異性的標記引物擴增全部樣品，PCR產(chǎn)物通過QIAxcel進行毛細管電泳，讀取片段長度。保留所篩選出的具有品種特異性的引物。
[0020]PCR反應在PTC-200PCR儀上按以下程序進行:93 °C預熱3min，40-44個循環(huán)(930C 30s，52-56°C 30s，72°C 15s)，72°C 7min。由于成品煙絲中DNA質(zhì)量較差，反應中退火溫度比引物理論退火溫度相應降低5-10°C。反應體系25 μ L(包括IOXPCR緩沖液2.5 μ L，dNTP (2.5 μ mo I each) 0.5 μ L，引物各 0.5 μ L (5 μ mol/L)和 Taq DNA0.3 μ L (TaKaRa))。
[0021]以紅花大金元、NC102和Κ326為例，篩選出的具紅花大金元品種特異性引物ΝΤ5在紅花大金元品種中擴增片段長度為209bp，在NC102和K326品種中擴增片段長度為213bp ；篩選出的具NC102品種特異性引物NTlO在NC102品種中擴增片段長度為156bp，在紅花大金元和K326品種中擴增片段長度為159bp ;篩選出的具K326品種特異性的引物NTl在K326品種中擴增片段長度為149bp，在紅花大金元和NC102品種中擴增長度為152。
[0022]混合品種煙絲和商品卷煙的鑒定按下述方法進行:
[0023]按前述步驟提取需要鑒定的樣品總DNA，應用篩選出的品種特異性引物對其進行PCR擴增，并與相應引物擴增的單品種煙草樣品PCR產(chǎn)物同時電泳，對比電泳圖譜，便可知樣品中所含煙草品種，對比商品卷煙的配方，樣品中所含品種是否與配方一致，若不一致便能判斷其是偽品。
[0024]于云煙(紫)和云煙(軟珍品)兩個牌號和混合品種的葉組絲中驗證該方法，結果表明該方法對商品卷煙和混合品種煙絲中所含煙草品種判斷準確，可以應用于商品卷煙真?zhèn)蔚蔫b定。
[0025]本發(fā)明針對商品卷煙的特點，選用SSR分子標記技術進行對其進行鑒定。與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)勢:
[0026](1)針對卷煙配方中煙草品種進行鑒定，可在多個品種混合的樣品中找到目標品種的條帶，鑒定結果準確、可靠?？捎糜谏唐肪頍?、混合煙絲、煙草品種的鑒定，有較好的應用價值。以往商品卷煙真?zhèn)闻卸ㄒ罁?jù)產(chǎn)品商標、包裝和抽吸感官，而采用分子生物學的方法根據(jù)卷煙原料品種進行鑒定，結果準確可靠，豐富了卷煙鑒定的手段。
[0027](2)根據(jù)文獻報道，我國煙草各類型間遺傳一致性較高，遺傳多樣性低，因此要選擇在煙草品種間分辨率較高的分子生物學手段進行鑒定。經(jīng)過文獻查閱和前期研究，SSR分子標記在煙草品種間有較好的分辨率，能準確定位目標品種，適合用于煙草品種的區(qū)分。
[0028](3)商品卷煙和烘烤、陳化過的煙絲經(jīng)過多道工序加工及較長時間的存放，其中所含DNA往往降解嚴重。經(jīng)對比，新鮮葉片經(jīng)硅膠干燥后提取的DNA長度約20kb，而商品卷煙煙絲中提取的總DNA長度在600-800bp，說明商品卷煙煙絲中DNA存在嚴重降解。因此，商品卷煙的鑒定不適宜采用對DNA質(zhì)量要求較高的遺傳標記技術。而SSR分子標記技術分析的目標DNA片段長度通常在在100-400bp，相對其他技術來說受DNA降解的影響較小，因此，此方法適用性較廣。
[0029](4)卷煙配方中往往含有多個品種的煙絲，有的品種的煙絲在配方中所占的比例較小，實驗表明，本發(fā)明中所采用的分析方法可識別混合品種樣品中含量很低的組分，具有較高的靈敏度，因此此方法在商品卷煙的鑒定中有較高的應用價值。
【專利附圖】

【附圖說明】:
[0030]圖1為不同品種煙葉與云煙(紫)煙絲SSR分析毛細管電泳圖，[D01-09分別為NTl, NT5, NTlO三對引物在NC102，K326和紅花大金元三個品種中變異式樣的毛細管電泳圖；D10-12依次為NTl在云煙(印象)，云煙(軟珍品)和云煙(紫)中的式樣];
[0031]圖 2 為 NT5 在 NKl，NK2, NK3, HKl，HK2, HK3, HNl，HN2, HN3, CYl，CY2, CY3 (從左至右)中式樣的毛細管電泳圖；
[0032]圖 3 為 NTlO 在 NKl，NK2, NK3, HKl，HK2, HK3, HNl，HN2, HN3, CYl，CY2, CY3 (從左
至右)中式樣的毛細管電泳圖。
【具體實施方式】:
[0033]為了使本發(fā)明的目的、技術方案及優(yōu)點更加清楚明白，以下結合附圖，通過實施例對本發(fā)明作進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明的保護范圍。
[0034]實施例1:
[0035](I)SSR多態(tài)性引物設計
[0036]從煙草基因組序列中隨機選擇具有SSR序列的區(qū)間設計引物。從GENBANK數(shù)據(jù)庫中下載煙草全基因組序列，通過SSR Hunter軟件搜索包含SSR位點的序列，通過01igo6.0在其兩側(cè)設計引物，目標片段長度在110 - 250bp。
[0037](2)單品種煙草DNA提取
[0038]取新鮮或干燥不同年份、產(chǎn)地的紅花大金元、NC102、K326等單品種煙草葉片，分別將其組織研磨成細粉末，放入2mL離心管中，加入0.4-lmL65°C預熱的CTAB提取緩沖液和I-2 μ L0.2% V/V的巰基乙醇，震蕩混勻；65°C水浴40min，每隔8min混勻一次，水浴結束后每管樣品加入等體積的24:1氯仿/異戊醇混合液，混勻，12000r/min離心IOmin后，將上清液轉(zhuǎn)入新的2mL離心管中，重復此步驟一次；離心管中加入70%體積已在4°C冰箱中放置預冷的異丙醇，混勻液體，放置_20°C冰箱Ih ;再用12000r/min離心lOmin，棄上清，沉淀用20-40mL70%乙醇和無水乙醇各洗兩次，倒出管中乙醇后，將管子敞口放置40°C恒溫箱中干燥；待管子完全干燥后，置于_20°C冰箱中儲存。
[0039](3)品種特異性引物篩選
[0040]全部SSR引物在所收集的煙草單品種樣品中進行PCR擴增，篩選多態(tài)性僅存在于品種間的具有品種特異性的SSR標記，引物篩選中PCR產(chǎn)物均用8%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，銀染顯色。用品種特異性的標記引物擴增全部樣品，PCR產(chǎn)物通過QIAxcel進行毛細管電泳，讀取片段長度。保留所篩選出的具`有品種特異性的引物。
[0041 ] PCR反應在PTC-200PCR儀上按以下程序進行:93 °C預熱3min，40-44個循環(huán)(930C 30s，52-56°C 30s, 72°C 15s)，72°C 7min。由于成品煙絲中DNA質(zhì)量較差，反應中退火溫度比引物理論退火溫度相應降低5-10°C。反應體系25 μ L(包括IOXPCR緩沖液2.5 μ L，dNTP (2.5 μ mo I each) 0.5 μ L，引物各 0.5 μ L (5 μ mol/L)和 Taq DNA0.3 μ L (TaKaRa))。
[0042]以紅花大金元、NC102和Κ326為例，篩選出的具紅花大金元品種特異性引物ΝΤ5在紅花大金元品種中擴增片段長度為209bp，在NC102和K326品種中擴增片段長度為213bp ；篩選出的具NC102品種特異性引物NTlO在NC102品種中擴增片段長度為156bp，在紅花大金元和K326品種中擴增片段長度為159bp ;篩選出的具K326品種特異性的引物NTl在K326品種中擴增片段長度為149bp，在紅花大金元和NC102品種中擴增長度為152。
[0043](4)市售云煙(紫)的鑒定
[0044]卷煙專賣店中購買一包云煙(紫)進行真?zhèn)舞b定。
[0045]取出卷煙樣品中的煙絲，按前述步驟提取總DNA，應用篩選出的品種特異性引物對其進行PCR擴增(步驟、反應條件同前)。與相應引物擴增的單品種煙草樣品的PCR產(chǎn)物同時通過QIAxcel儀器進行毛細管電泳，電泳圖譜如圖1所示。
[0046]圖1中，DOl-09分別為NT1，NT5, NTlO三對引物在NC102，K326和紅花大金元三個品種中變異式樣的毛細管電泳圖；D10-12依次為NTl在云煙(印象)，云煙(軟珍品)和云煙(紫)中的式樣。
[0047]DO 1-D03為NTI在NC102，K326和紅花大金元中的變異式樣，假如樣品中存在K326，圖譜中將顯示有K326的變異式樣。D10-D12分別為NTl在云煙(印象)，云煙(軟珍品)和中的式樣，從圖上可知云煙(紫)樣品中沒有顯示K326的式樣，從而可推斷云煙(紫)樣品中可能不含有K326，對照紅云紅河集團葉組配方表，可知2011年7月一 2012年I月生產(chǎn)的云煙(紫)配方中沒有K326，所購買的云煙(紫)為2011年底生產(chǎn)，其配方中應不含有K326組分。證明所購買的卷煙為正品。
[0048]實施例2:
[0049](I) SSR多態(tài)性引物設計、單品種煙草DNA提取、品種特異性引物篩選步驟同實施例I。
[0050](2)混合樣品中目標品種的鑒定
[0051]將三個品種的煙葉按不同比例兩兩混合，混合品種和比例如表I所示。
[0052]表I混合樣品組成
【權利要求】
1.一種應用SSR分子標記技術鑒定商品卷煙的方法，其特征在于將SSR分子標記技術應用于商品卷煙的鑒定中，通過識別單品種或混合品種的特征條帶，掌握所鑒定樣品的原料品種組成，達到辨別真?zhèn)蔚哪康?，方法如? (1)從煙草基因組序列中隨機選擇具有SSR序列的區(qū)間設計引物，目標片段長度在110 — 250bp ； (2)提取單品種煙草DNA; (3)品種特異性引物的篩選，將所設計的全部SSR引物在所收集的煙草單品種樣品中進行擴增，篩選多態(tài)性僅存在于品種間的具有品種特異性的SSR標記； (4)鑒定，提取需要鑒定樣品的總DNA，用篩選出的品種特異性引物進行擴增，根據(jù)電泳圖譜顯示的品種特異性條帶，判斷樣品中品種組成，通過與正品配方進行對比，鑒定卷煙真?zhèn)巍?br> 2.如權利要求 1所述的方法，其特征在所鑒定的煙葉為單品種煙葉、葉組絲或商品卷煙中的煙絲。
3.如權利要求1所述的方法，其特征在于所述的品種特異性SSR多態(tài)性引物設計是從煙草基因組序列中隨機選擇具有SSR序列的區(qū)間設計引物，從GENBANK數(shù)據(jù)庫中下載煙草全基因組序列，通過SSR Hunter軟件搜索包含SSR位點的序列，通過Ol igo6.0在其兩側(cè)設計引物，目標片段長度在110 - 250bp。
4.如權利要求1所述的方法，其特征在于所述的單品種煙草為紅花大金元、NC102、K326，或其他煙草品種。
5.如權利要求1所述的方法，其特征在于所述的品種特異性引物篩選是全部SSR引物在所收集的煙草單品種樣品中進行PCR擴增，篩選多態(tài)性僅存在于品種間的具有品種特異性的SSR標記，引物篩選中PCR產(chǎn)物均用8%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，銀染顯色；用品種特異性的標記引物擴增全部樣品，PCR產(chǎn)物通過QIAxcel進行毛細管電泳，讀取片段長度；保留所篩選出的具有品種特異性的引物。
6.如權利要求1所述的方法，其特征在于所述的混合品種煙絲和商品卷煙的鑒定是按所述步驟提取需要鑒定的樣品總DNA，應用篩選出的品種特異性引物對其進行PCR擴增，并與相應引物擴增的單品種煙草樣品PCR產(chǎn)物同時電泳，對比電泳圖譜，便可知樣品中所含煙草品種，對比商品卷煙的配方，樣品中所含品種是否與配方一致，若不一致便能判斷其是偽品。
【文檔編號】C12Q1/68GK103451296SQ201310403350
【公開日】2013年12月18日 申請日期:2013年9月6日 優(yōu)先權日:2013年9月6日
【發(fā)明者】楊瑩, 張?zhí)鞐? 周博, 付磊, 王欣林, 趙英良, 湯丹瑜, 張玲, 雷聲, 陳紹田 申請人:紅云紅河煙草(集團)有限責任公司