一種姜花花部特異和傷害、蟲(chóng)害誘導(dǎo)的tps2啟動(dòng)子及其應(yīng)用的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明屬于基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】，具體公開(kāi)了一種姜花花部特異和受傷害、蟲(chóng)害誘導(dǎo)的TPS2啟動(dòng)子及其應(yīng)用。所述啟動(dòng)子的核苷酸序列如SEQIDNO:2所示。本發(fā)明所述TPS2啟動(dòng)子調(diào)控的目的基因在轉(zhuǎn)基因煙草中僅在花組織表達(dá)，其表達(dá)與花發(fā)育進(jìn)程有關(guān)，且表達(dá)受傷害和蟲(chóng)害的誘導(dǎo)。而且本發(fā)明所述TPS2啟動(dòng)子可以連接到任意一種植物轉(zhuǎn)化載體，然后導(dǎo)入姜花或其它植物細(xì)胞中，可獲得含有所述啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)基因花香和抗性，從而用于生產(chǎn)；也可以根據(jù)本發(fā)明所述啟動(dòng)子序列信息產(chǎn)生特異性的分子標(biāo)記，用于鑒定姜花或其它植物的花香和抗性基因型，用于分子標(biāo)記輔助選擇育種，從而提高育種的選擇效率。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種姜花花部特異和傷害、蟲(chóng)害誘導(dǎo)的TPS2啟動(dòng)子及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】，具體地，涉及一種姜花花部特異和傷害、蟲(chóng)害誘導(dǎo)的TPS2啟動(dòng)子及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]啟動(dòng)子是位于結(jié)構(gòu)基因5'端上游區(qū)的一段能識(shí)別并活化RNA聚合酶，使之與模板DNA準(zhǔn)確地結(jié)合，確保轉(zhuǎn)錄精確而有效地起始的DNA序列。它是植物基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的中心，是理解基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制和表達(dá)模式的關(guān)鍵。
[0003]根據(jù)啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄模式可將其分為:組成型啟動(dòng)子、組織或器官特異性啟動(dòng)子和誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。其中，組織特異型啟動(dòng)子亦稱(chēng)為器官特異啟動(dòng)子，包括果實(shí)特異啟動(dòng)子、根特異啟動(dòng)子、葉特異啟動(dòng)子及花器官特異啟動(dòng)子等。在這類(lèi)啟動(dòng)子的調(diào)控下，基因的表達(dá)往往只限于某些特定的器官或組織部位，并往往表現(xiàn)發(fā)育調(diào)控的特性。
[0004]花器官特異表達(dá)啟動(dòng)子可使目的基因在花中特異性表達(dá)，可有效控制目的基因在花中特異表達(dá)且與花發(fā)育進(jìn)程密切相關(guān)，此外，花器官基因作用時(shí)還會(huì)受到許多誘導(dǎo)型等調(diào)控元件的協(xié)同作用。矮牽牛CHS的調(diào)控元件發(fā)現(xiàn)其中的一個(gè)G-box，是相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合域，是光、厭氧生活和ABA應(yīng)答元件，受光和紫外線誘導(dǎo)調(diào)控，與花特異表達(dá)有關(guān)(洪亞輝等，2003)。當(dāng)植物受到人為的創(chuàng)傷或害蟲(chóng)造成的機(jī)械損傷后，會(huì)產(chǎn)生一些小分子物質(zhì)和多糖，它們作為信號(hào)物質(zhì)誘導(dǎo)一系列防御基因的表達(dá)。土豆損傷基因蛋白酶抑制劑基因Pin II啟動(dòng)子傷誘導(dǎo)區(qū)域在啟動(dòng)子的近端區(qū)域，將-700~-195區(qū)段與_90CaMV35S啟動(dòng)子融合，發(fā)現(xiàn)嵌合啟動(dòng)子具有傷誘導(dǎo)的活性，因此認(rèn)為該區(qū)段控制該基因的傷誘導(dǎo)表達(dá)。
[0005]花器官特異啟動(dòng)子不僅含有所必須的保守性順式元件外，還含有一些組織特異型和誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的特有序列。并且這種的組織特異性通常以特定的組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)和化學(xué)物理信號(hào)為基礎(chǔ)，由這類(lèi)啟動(dòng)子中同時(shí)存在幾種控制組織特異性表達(dá)的元件的種類(lèi)、數(shù)目及相對(duì)位置等共同決定。 [0006]目前對(duì)轉(zhuǎn)基因技術(shù)中啟動(dòng)子的選擇主要采用組成型啟動(dòng)子，在組成型表達(dá)啟動(dòng)子的控制下，外源基因在轉(zhuǎn)基因植物的所有部位和不同的發(fā)育階段都會(huì)表達(dá)，且持續(xù)、高效的表達(dá)，沒(méi)有時(shí)空特異性，造成了能量的損耗，影響陽(yáng)性植株的成活率，引起植株生理和形態(tài)發(fā)生異常改變，從而影響植物的正常生長(zhǎng)發(fā)育。由于組織特異和誘導(dǎo)型啟動(dòng)子能夠有效地調(diào)控下游基因的表達(dá)，最大限度地減少由于外源蛋白在轉(zhuǎn)基因植物體內(nèi)的積累對(duì)其自身造成的傷害。Kasuga 等將 rd29A::DREBlA 和 35S::DREBlA 轉(zhuǎn)化煙草，與 rd29A::DREBlA 轉(zhuǎn)基因植株相比，35S::DREBlA轉(zhuǎn)基因煙草明顯出現(xiàn)生長(zhǎng)滯后現(xiàn)象；rd29A::DREBlA轉(zhuǎn)基因植株的脅迫耐性也明顯高于35S::DREBlA轉(zhuǎn)基因植株。Pellegrineschi用脅迫誘導(dǎo)型啟動(dòng)子rd29A驅(qū)動(dòng)DREB1A/CBF3的表達(dá)，提高了轉(zhuǎn)基因小麥對(duì)干旱脅迫的耐性，而且沒(méi)有引起明顯的畸形。
[0007]花作為植物重要的生殖器官，在利用植物雜種優(yōu)勢(shì)人工創(chuàng)建不育系、以花器官的表達(dá)元件研究一些基因特別是轉(zhuǎn)錄因子的功能等基因工程研究中起重要作用。其中花藥特異表達(dá)啟動(dòng)子和花粉啟動(dòng)子起到了十分重要的作用。利用花藥絨氈層特異啟動(dòng)子TA29、A9等構(gòu)建雄性不育基因，創(chuàng)造雄性不育性植株已在煙草、油菜等獲得成功。常小麗(2009)將從百合中克隆到的花部特異的CHS基因啟動(dòng)子轉(zhuǎn)入擬南芥中發(fā)現(xiàn)，在轉(zhuǎn)化植株的花序部位具有特異性表達(dá)。Kobayashi等發(fā)現(xiàn),從三花龍膽(Getiana triflora)中克隆得到的CHS基因啟動(dòng)子可在矮牽牛的花瓣唇部特異性表達(dá)。Lewinsohn等采用E8啟動(dòng)子,將仙女扇的LIS基因?qū)敕瑺敚墒斓墓麑?shí)合成并釋放香氣明顯的S-芳樟醇和8-羥基芳樟醇。Davidovich等(2007)采用PG啟動(dòng)子，將檸檬羅烯香葉醇合成酶(GES)基因轉(zhuǎn)入番茄，該基因在轉(zhuǎn)基因番茄果實(shí)中過(guò)量表達(dá)導(dǎo)致香葉醇的積累量增加，成功的改變番茄果實(shí)風(fēng)味。
[0008]隨著植物基因工程技術(shù)的發(fā)展，組織特異和誘導(dǎo)型啟動(dòng)子可用于人為控制目標(biāo)基因在植株的特定發(fā)育時(shí)期、特殊組織器官和相關(guān)逆境條件下精確表達(dá)，在改良作物的抗性、提高花卉的觀賞狀、改善果實(shí)和蔬菜的風(fēng)味等方面具有重要的應(yīng)用前景。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]本發(fā)明的目的為了克服現(xiàn)有技術(shù)中對(duì)姜花花部特異和傷害、蟲(chóng)害誘導(dǎo)啟動(dòng)子的研究鮮見(jiàn)報(bào)道的缺陷，提供一種姜花花部特異和傷害、蟲(chóng)害誘導(dǎo)的TPS2啟動(dòng)子。
[0010]本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種姜花花部特異和傷害、蟲(chóng)害誘導(dǎo)的TPS2啟動(dòng)子在培育改變花色、花香和育性等花部特有性狀及提高抗蟲(chóng)能力的植物新品種的應(yīng)用。
[0011]本發(fā)明通過(guò)以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)上述目的:
[0012]一種姜花花部特異和傷害、蟲(chóng)害誘導(dǎo)的TPS2啟動(dòng)子，其核苷酸序列如SEQIDN0:2所示。該啟動(dòng)子總長(zhǎng)度為1922bp，分段長(zhǎng)度分別為782bp和321bp。TPS2啟動(dòng)子賦予姜花花香基因HcTPS2花部特異和傷害、蟲(chóng)害誘導(dǎo)表達(dá)特征。本發(fā)明所述的TPS2啟動(dòng)子序列與⑶S基因融合表達(dá)轉(zhuǎn)化煙草后`，目標(biāo)基因在煙草僅花組織表達(dá)，其表達(dá)與花發(fā)育進(jìn)程有關(guān)，并且在葉片中表達(dá)受傷害、蟲(chóng)害和茉莉酸甲酯誘導(dǎo)。
[0013]經(jīng)過(guò)軟件分析得到所述TPS2啟動(dòng)子含有3個(gè)5'端系列缺失的目的片段p_320、p-780 和 p-1928, p-320、p-780 和 p-1928 的序列如 SEQIDN0:2 ~4 所示。
[0014]一種重組載體，所述重組載體為在出發(fā)載體的多克隆位點(diǎn)插入如上所述TPS2啟動(dòng)子序列(SEQIDN0:2)。所述出發(fā)載體可以是本【技術(shù)領(lǐng)域】中經(jīng)常用到的所有類(lèi)型的植物表達(dá)載體，優(yōu)選地，本發(fā)明所用的植物表達(dá)載體為PCAMBIA1300G植物表達(dá)載體。
[0015]一種重組載體，所述重組載體為在出發(fā)載體的多克隆位點(diǎn)插入如上所述TPS2啟動(dòng)子的5'端系列缺失的目的片段p-320、p-780或p-1928序列。所述出發(fā)載體可以是本【技術(shù)領(lǐng)域】中經(jīng)常用到的所有類(lèi)型的植物表達(dá)載體，優(yōu)選地，本發(fā)明所用的植物表達(dá)載體為PCAMBIA1300G植物表達(dá)載體。
[0016]一種包含如上所述重組載體的重組菌。
[0017]一種包含如上所述重組載體的細(xì)胞系。
[0018]TPS2啟動(dòng)子在培育改變花色、花香和育性等花部特有性狀及提高抗蟲(chóng)能力的轉(zhuǎn)基因植物新品種的應(yīng)用。
[0019]一種培育轉(zhuǎn)基因花香或抗性植物的方法，具體步驟為:將含有如上所述的重組載體導(dǎo)入出發(fā)植物細(xì)胞，從而得到TPS2啟動(dòng)子啟動(dòng)目的基因表達(dá)的轉(zhuǎn)基因花香或抗性植物。[0020]優(yōu)選地，所述目的基因?yàn)棰荢基因。
[0021]本發(fā)明同樣包括將三種長(zhǎng)度的啟動(dòng)子片段作為主要結(jié)構(gòu)部分有效地連接上合適的目標(biāo)功能基因所形成的嵌合基因，以及在基因組中包含這種啟動(dòng)子片段的植物和這種植物的種子。
[0022]根據(jù)本發(fā)明提供的啟動(dòng)子DNA序列信息，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以通過(guò)以下方法容易地獲得等同的啟動(dòng)子DNA序列:(I)通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索獲得；(2)以啟動(dòng)子DNA片段為探針篩選姜花或其它植物的基因組文庫(kù)獲得；(3)根據(jù)啟動(dòng)子DNA序列信息設(shè)計(jì)寡核苷酸引物，用PCR擴(kuò)增的方法從姜花或其它植物的基因組中獲取；(4)在啟動(dòng)子DNA序列的基礎(chǔ)上用基因工程方法改造獲得；(5)用化學(xué)合成的方法獲得。
[0023]本發(fā)明提供的啟動(dòng)子DNA序列具有重要的應(yīng)用價(jià)值。應(yīng)用之一是將所述的啟動(dòng)子DNA序列連接到任何一種植物轉(zhuǎn)化載體，用任何一種轉(zhuǎn)化方法將啟動(dòng)子DNA序列導(dǎo)入植物細(xì)胞，可獲得表達(dá)所述花部特異和傷害、蟲(chóng)害誘導(dǎo)表達(dá)特征，從而應(yīng)用于生產(chǎn)。本發(fā)明所述的啟動(dòng)子DNA序列構(gòu)建到植物轉(zhuǎn)化載體中，可以對(duì)融合表達(dá)的下游基因進(jìn)行調(diào)控，從而增強(qiáng)植物產(chǎn)生花香和增強(qiáng)抗性等能力。
[0024]本發(fā)明提供的啟動(dòng)子DNA序列的另一個(gè)應(yīng)用是根據(jù)所述基因序列信息產(chǎn)生特異性的分子標(biāo)記，包括但不限于SNP (單核苷酸多態(tài))、SSR (簡(jiǎn)單序列重復(fù)多態(tài))、RFLP (限制性?xún)?nèi)切酶長(zhǎng)度多態(tài))、CAP (切割擴(kuò)增片段多態(tài))。用這些標(biāo)記可鑒定姜花或其它植物的花香基因型，用于分子標(biāo)記輔助選擇育種，從而提高育種的選擇效率。
[0025]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果:
[0026]本發(fā)明將克隆的TPS2啟動(dòng)子DNA序列與控制花色、花香和抗性目標(biāo)功能基因結(jié)合，有助于產(chǎn)生新的花色、花香和抗 性植物，而且不會(huì)產(chǎn)生傳統(tǒng)育種技術(shù)中伴隨出現(xiàn)的基因組中不良基因的連鎖問(wèn)題，并且可以縮短育種時(shí)間。另外，本發(fā)明能夠進(jìn)一步提供或應(yīng)用上述TPS2啟動(dòng)子DNA片段獲得的新花色、花香和抗性的轉(zhuǎn)基因植株和相應(yīng)的種子，以及用本發(fā)明的重組體轉(zhuǎn)化的植株或由這類(lèi)植株獲得的種子。可以用有性雜交的方式將本發(fā)明的啟動(dòng)子轉(zhuǎn)入其他的植株。
[0027]說(shuō)明書(shū)附圖
[0028]圖1.TPS2啟動(dòng)子與⑶S融合表達(dá)的轉(zhuǎn)基因煙草⑶S在不同組織表達(dá)特異性；a:不同組織⑶S染色情況；b:不同組織⑶S酶活力情況。
[0029]圖2.TPS2啟動(dòng)子與⑶S融合表達(dá)的轉(zhuǎn)基因煙草⑶S在花器官不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá);A:不同發(fā)育時(shí)期GUS染色情況，其中圖示I為未開(kāi)放的花苞；2為半開(kāi)狀態(tài)的花瓣；3為盛開(kāi)狀態(tài)下的花瓣；4為衰老的花瓣；B:不同發(fā)育時(shí)期GUS酶活力情況，其中圖示I~4同A。
[0030]圖3.不同長(zhǎng)度片段TPS2啟動(dòng)子與GUS融合表達(dá)的轉(zhuǎn)基因煙草GUS在花瓣中茉莉酸甲酯處理，傷害處理后的表達(dá)；A:不同處理后花瓣中GUS染色情況；B:不同處理后花瓣中GUS酶活力情況；圖示I為未處理的花瓣，2為茉莉酸甲酯處理的花瓣，3為傷害處理的花瓣。
[0031]圖4.TPS2啟動(dòng)子與GUS融合表達(dá)的轉(zhuǎn)基因煙草GUS在葉片中茉莉酸甲酯，傷害和蟲(chóng)害的誘導(dǎo)表達(dá)；A:不同處理后葉片中GUS染色情況；B:不同處理后葉片中GUS酶活力情況，圖示I為未處理，2為茉莉酸甲酯處理，3為傷害處理，4為蟲(chóng)害處理。[0032]圖5.不同長(zhǎng)度片段TPS2啟動(dòng)子與GUS融合表達(dá)的轉(zhuǎn)基因煙草植株的PCR檢測(cè)圖；A:P-1928轉(zhuǎn)基因植株P(guān)CR檢測(cè)；B:P_780轉(zhuǎn)基因植株P(guān)CR檢測(cè)；C:P_320轉(zhuǎn)基因植株P(guān)CR檢測(cè)。
[0033]圖6.TPS2啟動(dòng)子p-780片段與花香基因HcTPSl融合表達(dá)的轉(zhuǎn)基因煙草植株的PCR檢測(cè)圖；A:轉(zhuǎn)基因煙草用HcTPS2啟動(dòng)子特異引物擴(kuò)增；B:轉(zhuǎn)基因煙草用潮霉素引物特異引物擴(kuò)增；C:轉(zhuǎn)基因煙草用HcTPSl基因特異引物擴(kuò)增。
【具體實(shí)施方式】
[0034]下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明。除非特別說(shuō)明，實(shí)施例中采用的試劑和方法均為本領(lǐng)域常規(guī)使用的試劑和方法。
[0035]實(shí)施例1
[0036]TPS2啟動(dòng)子序列的獲得
[0037]S1.姜花葉片總DNA的提取:將經(jīng)液氮研磨的0.1~0.2g姜花植物葉片粉末轉(zhuǎn)移至1.5mL離心管中。加入ImLCTAB溶液，65°C水浴30分鐘；每隔10分鐘，顛倒一次。然后，向離心管中加入ImL酚:氯仿(I: I)，顛倒幾次，1000Orpm離心10分鐘，轉(zhuǎn)移上清至一新的離心管，加等體積的氯仿:異戊醇(24: I)，混勻，1000Orpm離心10分鐘。轉(zhuǎn)移上清至一新的離心管。加等體積的異丙醇，顛倒混勻，1000Orpm離心10分鐘，除去上清，70%乙醇洗一次，真空抽干，溶于30yL的無(wú)菌水中，用于PCR擴(kuò)增。所述CTAB溶液的組成為:TrislOOmM, NaCll.4M, 20mMEDTA, CTAB2%，巰基乙醇 0.1%。
[0038]S2.采用hiTAIL-PCR技術(shù)克隆HcTPS2基因的5'端上游調(diào)控序列:根據(jù)發(fā)明人之前獲得的姜花HcTPS2 基因的序列(見(jiàn) Li 和 Fan, 2011，Molecular Cloning and ExpressionAnalysis of a Terpene Synthase Gene, HcTPS2, in Hedychium coronarium.PlantMolecular Biology Reporter29 (I): 35-42),在其5'端設(shè)計(jì)3個(gè)向外的特異性巢式引物spl、sp2、sp3,隨機(jī)簡(jiǎn)并引物設(shè)計(jì)參照Liu等(2007)文獻(xiàn)中設(shè)計(jì)的5個(gè)隨機(jī)簡(jiǎn)并引物(Liu,2007, BioTechniques,43 (5):649_656)。具體序列如下:
[0039]spl:5’-CGGATATCATGGGAGCACAGATAGTAGTGC-3’ (SEQID NO:6)
[0040]sp2:5’-CTACACGATCACTACTTTGGAGCCTTGTCCTTC-3’ (SEQID NO:7)
[0041]sp3:5’-ATGAGGTCAGAGTTGTCGTGTGGATTTGGGCGTAG-3’ (SEQIDN0:8)
[0042]LAD-1:5’-ACGATGGACTCCAGAGCGGCCGCVNVNNNGGAA-3，(SEQIDN0:9)
[0043]LAD-2:5’-ACGATGGACTCCAGAGCGGCCGCBNBNNNGGTT-3’ (SEQIDN0:10)
[0044]LAD-3: 5，-ACGATGGACTCCAGAGCGGCCGCWNVNNNCCAA-3，( SEQIDN0:11)
[0045]LAD-4:5’-ACGATGGACTCCAGAGCGGCCGCBDNBNNNCGGT-3’ (SEQIDN0:12)
[0046]ACl:5，-ACGATGGACTCCAGAG-3’ (SEQIDN0:13)
[0047]擴(kuò)增的體系和程序參照Liu等(2007)文獻(xiàn)中的進(jìn)行。把擴(kuò)增出DNA片段從瓊脂糖膠中回收并連接到pMD-lOTvector，轉(zhuǎn)化E.col1.DH5 α，酶切鑒定后測(cè)序。測(cè)序序列如SEQIDN0:1所示；SEQIDN0:1所示序列包括啟動(dòng)子TPS2序列和起始密碼子之后的基因的部分ORF序列。起始密碼子之前的序列就是啟動(dòng)子TPS2的核苷酸序列，序列長(zhǎng)1922bp，如SEQIDN0:2 所示。
[0048]將啟動(dòng)子TPS2的核苷酸序列(SEQIDN0:2所示)提交在線啟動(dòng)子分析軟件，預(yù)測(cè)啟動(dòng)子中包含的順式調(diào)控元件，結(jié)果發(fā)現(xiàn):啟動(dòng)子TPS2的核苷酸序列分成3個(gè)5'端系列缺失的目的片段;3個(gè)5'端缺失序列分別為p-320、p-780和p-1928。p-320長(zhǎng)度約為320bp(SEQIDNO: 3 所示);p-780 約 78Ibp (SEQIDN0:4 所示);p_1928 約 192Ibp (SEQIDN0:5 所示)。
[0049]TPS2啟動(dòng)子調(diào)控元件分析
【權(quán)利要求】
1.一種姜花花部特異和傷害、蟲(chóng)害誘導(dǎo)的TPS2啟動(dòng)子，其特征在于，核苷酸序列如SEQID NO:2 所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述TPS2啟動(dòng)子，其特征在于，所述TPS2啟動(dòng)子含有3個(gè)5'端系列缺失的目的片段p-320、p-780和p-1928，p_320、p-780和p-1928的序列如SEQ IDNO:3~5所示。
3.—種重組載體，其特征在于，所述重組載體為在出發(fā)載體的多克隆位點(diǎn)插入權(quán)利要求I所述TPS2啟動(dòng)子序列。
4.一種重組載體，其特征在于，所述重組載體為在出發(fā)載體的多克隆位點(diǎn)插入權(quán)利要求2所述TPS2啟動(dòng)子的5'端系列缺失的目的片段p-320、p-780或p-1928序列。
5.一種包含權(quán)利要求3或4所述重組載體的重組菌。
6.一種包含權(quán)利要求3或4所述重組載體的細(xì)胞系。
7.權(quán)利要求1所述TPS2啟動(dòng)子在培育轉(zhuǎn)基因花香或抗性植物品種中的應(yīng)用。
8.一種培育轉(zhuǎn)基因花香或抗性植物的方法，其特征在于，將含有權(quán)利要求3或4所述的重組載體導(dǎo)入出發(fā)植物細(xì)胞，從而得到TPS2啟動(dòng)子啟動(dòng)目的基因表達(dá)的轉(zhuǎn)基因花香或抗性植物。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述 方法，其特征在于:所述目的基因?yàn)镚US基因。
【文檔編號(hào)】C12N15/113GK103525816SQ201310370871
【公開(kāi)日】2014年1月22日 申請(qǐng)日期:2013年8月22日 優(yōu)先權(quán)日:2013年8月22日
【發(fā)明者】范燕萍, 李昕悅, 余讓才, 吳永瓊, 岳躍沖, 玉云祎 申請(qǐng)人:華南農(nóng)業(yè)大學(xué)