專利名稱：檢測豬薩佩羅病毒的引物、Taqman-MGB探針及試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及動物病原微生物檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種檢測豬薩佩羅病毒的引物、Taqman-MGB探針及試劑盒。
背景技術(shù)：
豬薩佩羅病毒(Porcine sapelovirus, PSV)是單股正鏈RNA病毒，屬于小RNA病毒科，腸道病毒屬。豬薩佩羅病毒以前被歸類為豬腸道病毒A,并曾被命名為PEV-8,但是Krumbholz等2002年在《Journal of Virology》第11期上5813-5821頁發(fā)表了題為((Sequencing of Porcine Enterovirus Groups II and III Reveals Unique Featuresof Both Virus Groups》的文章，該文章根據(jù)其L和2A基因能將其與其它的豬腸道病毒區(qū)分開，因此歸類為一個新的屬?！恫《痉诸?國際病毒分類委員會(ICTV)第八次報告》最終將PEV-8稱為薩佩羅病毒屬，該屬包含豬薩佩羅病毒、禽薩佩羅病毒和猿薩佩羅病毒。豬薩佩羅病毒粒子為球形，無囊膜，直徑25_30nm。首例豬腸病毒感染的報道出現(xiàn)在20世紀30年代，發(fā)生在捷克斯洛伐克的捷申病，是一種高死亡率的腦脊髓灰質(zhì)炎。豬薩佩羅病毒能引起中度或嚴重的神經(jīng)系統(tǒng)紊亂、繁殖障礙、肺炎和腹瀉。感染豬只康復(fù)后依然會繼續(xù)排毒，成為重要的病毒傳播源。經(jīng)對現(xiàn)有的技術(shù)文獻檢索分析發(fā)現(xiàn)，Knowles等在《Arch Virol)) 1979年第62期 201-208 頁發(fā)表了題為〈〈Classification of porcine enteroviruses by antigenicanalysis and cytopathic effects in tissue culture: description of 3 newserotype》文章，文中介紹了鑒定該類病毒的方法主要依靠抗原分析和豬腎細胞類型方法。Roland Zell 等 在《Journal of Virological Methods》2000 年第 88 期 205 - 218 頁發(fā)表了題為〈〈Detection of porcine enteroviruses by nRT - PCR: differentiation of CPEgroups 1-1II with specific primer sets))一文，文中介紹了 RT-PCR檢測方法檢測薩佩羅病毒。但這些方法費時費力，操作過程繁瑣且不易鑒定。目前，鑒定豬薩佩羅病毒的常規(guī)方法有病毒分離、病毒中和試驗、病變形態(tài)觀察、抗原分析、RT-PCR等，由于這些技術(shù)周期長，操作繁瑣或者只能進行定性檢測而不能定量分析，并且有時靈敏性不夠，尤其是低病毒含量的樣品，因此在實際應(yīng)用中受到限制。目前還沒有使用Taqman-MGB實時熒光定量RT-PCR檢測該病毒的報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術(shù)中的上述不足，提供一種檢測豬薩佩羅病毒的引物；另外提供一種檢測豬薩佩羅病毒的Taqman-MGB探針；以及提供一種檢測豬薩佩羅病毒的試劑盒。本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)上述目的:
一種檢測豬薩佩羅病毒的引物，核苷酸序列如SEQ ID Ν0:Γ2所示:
上游引物:5’ -GGCAGTAGCGTGGCGAGC-3’ (SEQ ID NO:1)；下游引物:5’ -CTACTCTCCTGTAACCAGT-3，(SEQ ID NO:2)。一種檢測豬薩佩羅病毒的Taqman-MGB探針，核苷酸序列為SEQ ID NO: 3所示，該序列5’端標記有發(fā)光的報告熒光基團，3’端標記有不發(fā)光的淬滅基團和二氫環(huán)化吲哚卟啉-三月太(dehydrocyclopyrroindole tripetide, DPI3):
探針核苷酸序列:5’ -CGATAGCCATGTTAGTG-3’ (SEQ ID NO:3)。優(yōu)選地，上述的檢測豬薩佩羅病毒的Taqman-MGB探針，其所述報告熒光基團為FAM (Carboxyfluorescein,竣基突光素)，萍滅基團為 NFQ (Non-Fluorescent Quencher,非熒光淬滅基團)。一種檢測豬薩佩羅病毒的試劑盒，包括上述SEQ ID NO:1 2的引物，以及SEQ IDNO:3序列結(jié)合熒光基團和淬滅基團的Taqman-MGB探針。一種檢測豬薩佩羅病毒的試劑盒，包括以下組分:PCR反應(yīng)緩沖液、Mg2+、SEQ IDNO: Γ2的引物序列、由SEQ ID NO: 3構(gòu)成的Taqman-MGB探針、dNTP混合物以及Taq酶。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果:
采用Taqman-MGB實時熒光定量RT-PCR方法，克服了病毒分離操作過程繁瑣且不易鑒定和傳統(tǒng)PCR檢測速度慢、易污染、擴增后需電泳檢測和每次檢測的樣品數(shù)量少等缺點，可以對樣品中的病毒含量進行精確的定量檢測。本發(fā)明的引物和Taqman-MGB探針特異性高，穩(wěn)定性好，檢測準確率高，Taqman-MGB診斷試劑盒具有檢測快速、靈敏性高、穩(wěn)定性好、易于定量、假陽性低等特點，有利于規(guī) ?；妥詣踊瘷z測分析。TaqMan-MGB探針與傳統(tǒng)的 TaqMan-TAMRA (TaqMan-四甲基羅丹明)探針比較具有以下優(yōu)勢:
(I)提高Tm值:平均15bases可提高18°C，這樣可以使探針的長度縮短，尤其對AT含量高的序列設(shè)計有很大的幫助，并且提高配對與非配對模板間的Tm值差異。(2)提高信噪比:由于在探針的3’端的淬滅基團為不發(fā)光的熒光基團，并且與報告基因在空間的位置更接近，實驗結(jié)果更精確，分辨率更高。(3)更簡化實驗:MGB探針實驗優(yōu)化步驟簡單，雜交的穩(wěn)定性大大提高，重復(fù)性大大提聞。


圖1 =TaqMan-MGB熒光定量PCR標準曲線；
圖2:豬薩佩羅病毒TaqMan-MGB熒光定量PCR方法敏感性實驗；
圖3:豬薩佩羅病毒TaqMan-MGB熒光定量PCR方法特異性實驗檢測結(jié)果曲線圖，其中a為PSV YC2011株，b為豬流行性腹瀉病毒、豬傳染性胃腸炎病毒、豬輪狀病毒、豬繁殖與呼吸障礙綜合癥病毒。
具體實施例方式為便于理解本發(fā)明的技術(shù)方案，下面結(jié)合具體實施例來進一步闡述本發(fā)明。以下實施例中，“ηΧ”(η表示數(shù)字)意為稀釋η倍。實施例中使用的生物材料及試劑說明:
PSV YC2011毒株由廣東溫氏食品集團研究院分離保存，也可以使用其他市售或自分離的PSV病毒株，僅為便于本領(lǐng)域技術(shù)人員理解本發(fā)明技術(shù)方案使用，不對本發(fā)明的技術(shù)方案產(chǎn)生影響；TaKaRa RNA PCR Kit (AMV) Ver.3.0、pMD18_T載體和DH5 α感受態(tài)細胞均為寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品；質(zhì)粒抽提試劑盒購于Omega公司；Axyprep體液病毒DNA/RNA小量提取試劑盒購于Axygen公司。實施例1
1)設(shè)計引物和TaqMan-MGB探針
從Genbank中檢索獲得的豬薩佩羅病毒的全基因組序列(參考毒株Genbank登錄號為JX286666.1,NC_003987.1和HQ875059.1 )，通過DNAstar軟件進行序列比對，找出豬薩佩羅病毒基因組特異性的保守序列共10段,登錄http://www.ncb1.nlm.nih.gov/進行BLAST確定其保守性。運 用Oligo 6.0軟件對這些保守序列做堿基組成成分及穩(wěn)定性等方面分析，并從引物和探針設(shè)計等原則綜合考慮，最終篩選出I段最合適的保守序列，該段保守序列位于PSV基因組的5’非翻譯區(qū)的第153bp到第260bp(毒株Genbank登錄號JX286666.1)。運用專業(yè)引物設(shè)計軟件對該保守序列進行引物設(shè)計，得到多對特異性引物和探針序列，經(jīng)過比對篩選，最終確定一組最佳引物對和一條MGB探針，引物和探針位于5’非翻譯區(qū)，目的擴增片段為IOSbp。上游引物:5’-GGCAGTAGCGTGGCGAGC-3’ (SEQ ID NO:1)；
下游引物:5’ -CTACTCTCCTGTAACCAGT-3，(SEQ ID N0:2)；
探針:FAM-5’ -CGATAGCCATGTTAGTG-3’ -MGB (序列為 SEQ ID NO:3)
2)定量標準質(zhì)粒的構(gòu)建和制備
以提取 PSV YC2011 毒株的 RNA 為模板，按 TaKaRa RNA PCR Kit (AMV) Ver.3.0 試劑盒說明書步驟進行反轉(zhuǎn)錄，合成cDNA,以cDNA為模板,用上述試劑盒內(nèi)的SapU和SapD引物進行PCR擴增。SapU:ACGGCGAGTACATATGG (SEQ ID N0:4)；
SapD:GCCATTGCATTAGCTATC (SEQ ID NO:5)。擴增體系如下:
cDNA6 μ L
上游引物 SapU (10 μ Μ)4 μ L
下游引物 SapD (10 μ Μ)4 yL
Taq DNA polymerase50 μ L
ddH2046 μ L
總量110 μ L
配好體系混勻后，低速離心，將液體全部置于管底，用PCR自動擴增儀進行擴增，擴增程序如下:94°C預(yù)變性5min ;94°C變性15sec ;55°C退火15sec ;72°C延伸Imin ；30個循環(huán)后再延伸lOmin。擴增結(jié)束后在1%的瓊脂糖凝膠上進行電泳鑒定，將748bp處的目的條帶切割下來，通過膠回收試劑盒(Omega公司)進行純化,純化的目的片段與pMD18_T載體在16°C條件下連接過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5 α感受態(tài)細胞，挑選單克隆菌落進行擴大培養(yǎng)并做PCR鑒定，鑒定為陽性的單克隆菌落送上海英駿生物技術(shù)有限公司進行測序驗證，測序驗證正確的單克隆菌落擴大培養(yǎng)。上述鑒定陽性且測序驗證正確的單克隆菌液用質(zhì)粒抽提試劑盒(Omega公司)進行質(zhì)粒抽提和純化，紫外分光光度計測定質(zhì)粒濃度，并根據(jù)以下公式換算為質(zhì)?？截悢?shù)。質(zhì)粒濃度(yg/yL)=0D260X稀釋倍數(shù)X50/1000 ;質(zhì)?？截悢?shù)=質(zhì)粒濃度X6.02X 1023mol/1000M，M代表質(zhì)粒分子量。該質(zhì)粒便為以下步驟制作標準曲線的定量標準質(zhì)粒。3)病毒RNA的提取:
取PSV YC2011株，按Axyprep體液病毒DNA/RNA小量提取試劑盒使用說明書進行，步驟如下:
①取200μ 已知陽性病毒樣品，加入1.5mL離心管中；
②加200μ Buffer V_L，漩渦振蕩混合均勻，靜置5min ；
③加75PLBuffer V-N，漩渦振蕩混合均勻，12000 Xg離心5min ；④將上清轉(zhuǎn)移到新的2mL離心管中，加300μ 異丙醇(1%冰乙酸)，上下倒置6_8次，混合均勻；
⑤將制備管置于2mL離心管(試劑盒內(nèi)提供)中，取步驟④中的混合液移入制備管中，6000 X g 離心 Imin ；
⑥棄濾液，將制備管置回到2mL離心管中，加500μ Buffer W1A，室溫靜置lmin，12000 X g 離心 Imin ；
⑦棄濾液，將制備管置回到2mL離心管中，加800μ Buffer W2，12000 Xg離心lmin ；
⑧將制備管置回到2mL離心管中，12000Xg離心Imin ；
⑨將制備管置于潔凈的1.5mL離心管(試劑盒內(nèi)提供)中，在制備管膜中央加40μ Buffer TE,室溫靜置 Imin，12000 X g 離心 Imin 洗脫 DNA/RNA。4)病毒RNA的逆轉(zhuǎn)錄:
以步驟 3)提取的 PSV YC2011 株的 RNA 為模板，按 TaKaRa RNA PCR Kit (AMV) Ver.3.0試劑盒說明書進行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA,反轉(zhuǎn)錄體系如下:5XAMV buffer 4 μ L, dNTP( IOmM)
2μ L, Random Primer (6_9mer) 50pmol, AMV 反轉(zhuǎn)錄酶 10 U, RNA 樣品 I μ g，RNaseInhibitor 20U，加DEPC H2O至20 μ L0將各試劑混合均勻，置PCR儀中按以下程序進行:300C 10 min，42°C溫浴30 min,90°C 5 min反應(yīng)結(jié)束后_20°C保存，用于熒光定量PCR檢測。5) TaqMan-MGB熒光定量PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化:
以步驟4)所得的cDNA為模板，通過對反應(yīng)體系中不同的Mg2+、引物濃度、MGB探針濃度、dNTP濃度等實驗結(jié)果比較，選擇反應(yīng)靈敏度高、本底熒光信號低、具有典型S型擴增熒光信號曲線、擴增效率接近I的反應(yīng)體系。經(jīng)優(yōu)化后的20μ L最佳反應(yīng)體系為:
組分用量/終濃度
IOXBuffer (PCR 緩沖液)IX
2Smmol/T, MgCl2Smmol/I,
dNTP 混合物Immol/I,
SEQ ID NO:1 2引物每種引物各0.4 μ mol/L
TaqMan-MGB 探針0.2 μ mol/L
cDNA 模板2 μ L
Taq 酶5UnitROX reference dye0.04 μ L
將加好樣品的PCR管放置熒光PCR儀中進行擴增，反應(yīng)程序如下:50°C，2分鐘，熱啟動；95°C，10分鐘預(yù)變性；95°C，10秒，60°C 40秒，45個循環(huán)。試驗結(jié)果可以實時檢測。豬薩佩羅病毒TaqMan-MGB熒光定量PCR的檢測結(jié)果判定:進行熒光定量PCR時設(shè)置陽性對照和陰性對照，陽性對照為定量標準質(zhì)粒，陰性對照為滅菌水，檢測結(jié)果若出現(xiàn)典型的S型擴增曲線，則判定為陽性結(jié)果，表明檢測樣品中含有豬薩佩羅病毒；若檢測樣品中不含有豬薩佩羅病毒則無擴增信號。6) TaqMan-MGB熒光定量PCR標準曲線的建立
用無菌雙蒸水將步驟2)獲得的定量標準質(zhì)粒稀釋至2.475X 109，2.475X 108，
2.475 X IO7, 2.475 X IO6, 2.475 X IO5Copies^L,用步驟5)最優(yōu)化的體系進行反應(yīng)，反應(yīng)條件按上述優(yōu)化好的條件 進行。檢測結(jié)束后熒光定量PCR會自動繪制標準曲線(圖1)。本檢測方法在2.475X 109 2.475X 105copies/reaction范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。7)檢測靈敏度分析
步驟2)獲得的定量標準質(zhì)粒用無菌雙蒸水稀釋至2.475X 109，2.475X 108，2.475X107，2.475X106，2.475X105，2.475X104，2.475X103，2.475X102，
2.475 X lOkopies/^L，用步驟5)最優(yōu)化的體系進行反應(yīng)，反應(yīng)條件按上述優(yōu)化好的條件進行檢測其靈敏度。通過分析檢測結(jié)果可以看出，檢測靈敏度可達到10(Γ1000個拷貝/μ (圖2)。8)特異性分析
設(shè)定可能存在潛在交叉反應(yīng)的病毒cDNA為模板(以豬流行性腹瀉病毒、豬傳染性胃腸炎病毒、豬輪狀病毒、豬繁殖與呼吸障礙綜合癥病毒為模板)，設(shè)定無菌蒸餾水作為陰性對照，PSV YC2011株cDNA作為陽性對照，按上述最優(yōu)反應(yīng)體系和條件進行熒光定量PCR反應(yīng)，結(jié)果顯示該檢測體系特異性良好，非目標病毒核酸均沒有擴增曲線，只有豬薩佩羅病毒才有良好的擴增曲線(圖3)。9)穩(wěn)定性分析
選取3個已知陽性的臨床樣品，分別進行批內(nèi)重復(fù)檢測和批間重復(fù)檢測。批內(nèi)重復(fù)實驗:將3個已知陽性樣品在同一批中進行檢測，每個樣品設(shè)置兩個重復(fù)，分析同一樣品在批內(nèi)檢測的穩(wěn)定性；批間重復(fù)實驗:將3個已知陽性樣品分批次檢測，每次單獨檢測一個樣品，樣品設(shè)置兩個重復(fù)，比較同一樣品在不同批次中檢測的穩(wěn)定性。從下表中的檢測結(jié)果分析，可以看出批內(nèi)變異系數(shù)在0.63%-1.14%之間，批間變異系數(shù)在1.09%-1.46%之間，所以可以判斷出本檢測方法穩(wěn)定性良好。表I樣品檢測穩(wěn)定性分析
權(quán)利要求
1.一種檢測豬薩佩羅病毒的引物，其特征在于，核苷酸序列如SEQ ID Ν0:Γ2所示。
2.一種檢測豬薩佩羅病毒的Taqman-MGB探針，其特征在于，核苷酸序列為SEQ IDNO: 3所不,該序列5’端標記有發(fā)光的報告突光基團，3’端標記有不發(fā)光的淬滅基團和二氫環(huán)化吲哚卟啉-三肽。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測豬薩佩羅病毒的Taqman-MGB探針，其特征在于，所述報告熒光基團為FAM，淬滅基團為NFQ。
4.一種檢測豬薩佩羅病毒的試劑盒，其特征在于，包括權(quán)利要求1所述的引物，以及權(quán)利要求2或3所述的Taqman-MGB探針。
5.一種檢測豬薩佩羅病毒的試劑盒，其特征在于，包括以下組分:PCR反應(yīng)緩沖液、Mg2+、SEQ ID NO:1 2的引物序列、由SEQ ID NO: 3構(gòu)成的Taqman-MGB探針、dNTP混合物以及Taq酶。
全文摘要
本發(fā)明公開了檢測豬薩佩羅病毒的引物、Taqman-MGB探針及試劑盒，屬于動物病原微生物檢測技術(shù)領(lǐng)域。用于檢測豬薩佩羅病毒的引物核苷酸序列如SEQIDNO:1~2所示，Taqman-MGB探針的DNA序列如SEQIDNO:3所示。本發(fā)明的引物和Taqman-MGB探針特異性高，穩(wěn)定性好，檢測準確率高，Taqman-MGB診斷試劑盒具有檢測快速、靈敏性高、穩(wěn)定性好、易于定量、假陽性低等特點，有利于規(guī)模化和自動化檢測分析。采用Taqman-MGB實時熒光定量RT-PCR方法，克服了病毒分離操作過程繁瑣且不易鑒定和傳統(tǒng)PCR檢測速度慢、易污染、擴增后需電泳檢測和每次檢測的樣品數(shù)量少等缺點。
文檔編號C12R1/93GK103205512SQ201310168628
公開日2013年7月17日 申請日期2013年5月9日 優(yōu)先權(quán)日2013年5月9日
發(fā)明者陳俊偉 申請人:廣東溫氏食品集團股份有限公司