專利名稱：一種高密度固體發(fā)酵生產(chǎn)地衣芽孢桿菌活菌的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種高密度固體發(fā)酵生產(chǎn)地衣芽孢桿菌活菌的方法。
背景技術(shù)：
地衣芽孢桿菌iBacIicus lincheniformis)是芽孢桿菌屬的一種，單個細胞，
0.6^0.8X1.5^3微米，細胞形態(tài)和排列呈桿狀、單生，細胞內(nèi)無聚-羥基丁酸鹽顆粒，革蘭氏陽性桿菌。產(chǎn)生近中生的橢圓狀芽孢，孢囊稍膨大。菌落為扁平、邊緣不整齊、白色。地衣芽孢桿菌Iincheniformis)具有多種功能,是一種可以應(yīng)用于多個領(lǐng)域的優(yōu)良菌種，例如可以作為微生物農(nóng)藥、微生物飼料添加劑、微生物肥料、凈水劑等。它的主要功能有抑制有害細菌(大腸桿菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌)的生長，使機體內(nèi)的有益菌增加而潛在的致病菌減少；能產(chǎn)生多種消化酶，如蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶，能幫助動物對營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收；能有效降解水中有機質(zhì)，改善水質(zhì)，抑制有害藻類的過度繁殖；減輕植物病害，降低農(nóng)藥殘留，改善土壤微生態(tài)環(huán)境。地衣芽孢桿菌生產(chǎn)主要有液體發(fā)酵和固體發(fā)酵兩種，液體發(fā)酵需要全套的發(fā)酵罐裝置，其優(yōu)點是發(fā)酵過程易于控制，產(chǎn)品純度高，缺點是發(fā)酵后需要吸附干燥，工藝程序多，投資大，耗能高，環(huán)境污染比較嚴重；固體發(fā)酵一般在發(fā)酵房中進行，其優(yōu)點是發(fā)酵產(chǎn)量高且發(fā)酵后不需吸附，直接烘干粉碎即可使用，工藝簡單，缺點是發(fā)酵過程不易控制，雜菌污染不易控制。中國專利申請?zhí)枮? 01110324147.2的發(fā)明專利，公布了一種以固體發(fā)酵生產(chǎn)枯草芽孢桿菌活菌的方法，但是其所使用的菌株、種子培養(yǎng)的具體方法、固體發(fā)酵培養(yǎng)的具體操作步驟、發(fā)酵產(chǎn)物晾干的方法以及所使用的培養(yǎng)基的配方均不相同，該對比文件的操作方法復(fù)雜，生產(chǎn)效率低。其次，該對比文件所使用的培養(yǎng)基配方其PH值為自然值，不需要額外調(diào)節(jié)，但采用農(nóng)副產(chǎn)品原料做固體培養(yǎng)基，經(jīng)高溫高壓滅菌后，培養(yǎng)基PH值一般都會降的比較低，偏酸，不利于提高固體發(fā)酵的有效活菌含量。此外，該對比文件的種子培養(yǎng)采用的是二級液體種子，液體發(fā)酵需要全套的發(fā)酵罐裝置，發(fā)酵后需要吸附干燥，工藝程序多，設(shè)備成本高，投資大，耗能高，環(huán)境污染嚴重。地衣芽孢桿菌固體發(fā)酵過程重要的影響因素有培養(yǎng)基配方、水分、溫度和pH值。由于發(fā)酵過程中產(chǎn)熱，料溫升高的很快，一般的敞開培養(yǎng)方式水分和溫度都不易控制。因此，通過合理的培養(yǎng)基配方和培養(yǎng)條件的控制，建立模式化固體發(fā)酵法生產(chǎn)地衣芽孢桿菌的方法具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于針對現(xiàn)有地衣芽孢桿菌固體發(fā)酵技術(shù)存在的問題，提供一種高密度固體發(fā)酵生產(chǎn)地衣芽孢桿菌的方法，生產(chǎn)的地衣芽孢桿菌有效活菌數(shù)高，企業(yè)的生產(chǎn)成本低。
本發(fā)明的目的通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的。1.一種高密度固體發(fā)酵生產(chǎn)地衣芽孢桿菌活菌的方法，它包括以下步驟:
(I)菌種選擇:選用地衣芽抱桿菌iBaclicus lincheniformis) CGMCC1.0518菌株；所述菌種為中國普通微生物菌種保藏中心的保藏號為NO: 1.0518的地衣芽孢桿菌。(2)斜面種子培養(yǎng):將步驟(I)所述菌株，在無菌條件下接種于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基斜面上，培養(yǎng)溫度為28 45°C，培養(yǎng)時間為36 48小時，得斜面種子；
(3)固體種子培養(yǎng):將步驟(2)得到的斜面種子用無菌水清洗，收集于三角瓶中，調(diào)整菌液濃度為IO8個/mL，然后以5 10% v/w(體積質(zhì)量比)的接種量，將該菌液接種于經(jīng)121°C、9(Tl20min滅菌的固體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度為28 45°C，培養(yǎng)時間為48、6小時，得固體種子;
(4)固體發(fā)酵培養(yǎng):將步驟(3)得到的固體種子倒入IOlOL無菌水中，攪拌混勻，將該菌液以廣5% v/w (體積質(zhì)量比)的接種量，接種于經(jīng)12rC、9(Tl20min滅菌的固體培養(yǎng)基中，隨后將接種的固體培養(yǎng)基以1(T20厘米的厚度平攤于淺盤中，再將淺盤置于滅菌的固體發(fā)酵房內(nèi)的擱架上發(fā)酵，控制環(huán)境溫度在28 45°C，同時利用空壓機往固體發(fā)酵房中通無菌風(fēng)，發(fā)酵48 120小時，發(fā)酵結(jié)束；
(5)發(fā)酵產(chǎn)物烘干:將步驟(4)的發(fā)酵產(chǎn)物置于5(T80°C烘房中烘干24 48小時，期間取樣測定水分，當(dāng)含水率低于20%時，烘干過程結(jié)束；
(6)發(fā)酵產(chǎn)物閃蒸:將步驟(5)所得發(fā)酵產(chǎn)物輸入閃蒸機閃蒸干燥，閃蒸機進口溫度為8(Tl30°C，出口溫 度為5(T70°C ;干燥結(jié)束收集產(chǎn)物并粉碎，過80目篩，所得粉末即為含地衣芽孢桿菌活菌的固體發(fā)酵產(chǎn)品；
其中，所述步驟(2)涉及的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基配方及制備方法為:牛肉膏3g/L，蛋白胨10g/L，氯化鈉5 g/L, pH7.(T7.2，配制斜面培養(yǎng)基時加入15 g/L的瓊脂，121°C滅菌15分鐘；
其中，所述步驟(3)、步驟(4)涉及的固體種子培養(yǎng)、固體發(fā)酵培養(yǎng)用固體培養(yǎng)基配方及制備方法為:以重量百分比計，米糠40 60%，豆柏粉20 40%，玉米粉5 20%，花生殼粉5 20%酵母粉1 5%，硫酸鎂0.1 0.5%，磷酸氫二鉀0.1 0.5%，硫酸錳0.1 0.5%，碳酸鈣I 5%，料水質(zhì)量比1:0.9 1:1.1，用石灰調(diào)pH為9.(T10.0，均勻混合后在121°C，蒸汽滅菌90 120分鐘備用。本發(fā)明中，滅菌之前先用石灰將培養(yǎng)基pH值調(diào)到堿性，這樣滅菌后培養(yǎng)基pH值就為中性，利于地衣芽孢桿菌的初始生長。地衣芽孢桿菌在培養(yǎng)過程中會產(chǎn)酸使培養(yǎng)基PH值過快降低，不利于長時間維持菌體的增殖，本配方中加入的碳酸鈣可緩沖培養(yǎng)基的PH值，使菌體能較長時間保持增殖，因此能得到更大的活菌數(shù)。利用系列稀釋法對含地衣芽孢桿菌活菌的固體發(fā)酵成品進行菌落計數(shù)，可計算出地衣芽孢桿菌的有效活菌數(shù)。其中，所述步驟(3)和步驟(4)中，所述固體培養(yǎng)基均為IL固體菌種瓶裝18(T250g濕固體培養(yǎng)基料。優(yōu)選地，IL固體菌種瓶裝200g濕固體培養(yǎng)基料。固體培養(yǎng)基濕料的重量少于180g則制成的培養(yǎng)基厚度薄，培養(yǎng)過程中培養(yǎng)基容易變干；而固體培養(yǎng)基濕料的重量大于250g，則制成的培養(yǎng)基厚度厚，接種后的培養(yǎng)基底部透氣性及散熱性差，影響菌種的接種效果，進一步導(dǎo)致有效活菌含量減少。
其中，所述步驟(3)中，固體種子培養(yǎng)用固體培養(yǎng)基配方及制備方法為以重量百分比計，米糠40 50%，豆柏粉20 25%，玉米粉10 20%，花生殼粉5 12%酵母粉I 5%，硫酸鎂0.1 0.5%，磷酸氫二鉀0.1 0.5%，硫酸錳0.1 0.5%，碳酸鈣3 5%，料水質(zhì)量比1:0.9 1: 1.1，用石灰調(diào)PH為9.(T10.0，均勻混合后在121°C，蒸汽滅菌10(Tl20分鐘備用。其中，所述步驟(4)中，固體發(fā)酵用固體培養(yǎng)基配方及制備方法為以重量百分比計，米糠45 60%，豆柏粉20 35%，玉米粉5 15%，花生殼粉10 20%酵母粉I 5%，硫酸鎂
0.1 0.5%，磷酸氫二鉀0.1 0.5%，硫酸錳0.1 0.5%，碳酸鈣2 4%，料水質(zhì)量比1:0.9 1: 1.1，用石灰調(diào)PH為9.(T10.0，均勻混合后在121°C，蒸汽滅菌10(Tl20分鐘備用。其中，所述步驟(2)中，培養(yǎng)溫度為35 40°C，培養(yǎng)時間為40 48小時。其中，所述步驟(3)中，培養(yǎng)溫度為35 40°C，培養(yǎng)時間為60 84小時。其中，所述步驟(4)中，環(huán)境溫度在35 45°C，發(fā)酵時間為6(Tl08小時。其中，所述步驟(4 )中，無菌風(fēng)的氣流速度是7 10米/分鐘。其中，所述步驟(5)中，烘房溫度為5(T65°C，烘干時間為24 36小時。本發(fā)明的有益效果為:
(I)培養(yǎng)基原料都是采用農(nóng)副產(chǎn)品，成本低，配方合理，能夠滿足菌種繁殖營養(yǎng)需要。特別是加入碳酸鈣緩沖培養(yǎng)過程中培養(yǎng)基的PH值變化，確保菌種在繁殖過程中培養(yǎng)基始終處于中性偏堿性條件下，大大提高了固體發(fā)酵的地衣芽孢桿菌有效活菌含量，實驗及生產(chǎn)證明利用本發(fā)明方法制備的地衣芽孢桿菌的有效活菌數(shù)可達1000億/克以上，且芽孢率聞，達90%以上。(2)培養(yǎng)基配方合理，工藝先進，本發(fā)明工藝生產(chǎn)的產(chǎn)品雜菌率低于5%，大大低于一般固體發(fā)酵工藝生產(chǎn)的產(chǎn)品。(3)本發(fā)明對環(huán)境污染低，符合國家產(chǎn)業(yè)政策。(4)采用先烘房烘干再閃蒸機閃蒸干燥的工藝，能使最終產(chǎn)品水分含量降低至5%以下。(5)本發(fā)明采用固體種子接種，工藝簡單，不需要大型設(shè)備，成本低，對人員要求也相對較低。(6)本發(fā)明具有創(chuàng)新性和實用性，生產(chǎn)的地衣芽孢桿菌有效活菌數(shù)高，能大大降低企業(yè)的生產(chǎn)成本，滿足微生物菌劑生產(chǎn)的需要。
具體實施例方式下面結(jié)合實施例1飛對本發(fā)明作進一步的說明。實施例1。本實施例的一種高密度固體發(fā)酵生產(chǎn)地衣芽孢桿菌的方法，包括以下步驟:
(1)菌種選擇:選用地衣芽抱桿菌iBaclicuslincheniformis) CGMCC1.0518菌株；
(2)斜面種子培養(yǎng):將步驟(I)所述菌株，在無菌條件下接種于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基斜面上，30°C培養(yǎng)48小時，得斜面種；
(3)固體種子培養(yǎng):將斜面種用無菌水洗下，收集于三角瓶中，以系列稀釋法進行平板計數(shù)，該菌懸液活菌含量為2 X109/mL，用無菌水稀釋為lX108/mL，然后以5% v/w (體積質(zhì)量比)的接種量，將該菌液接種于經(jīng)12rC、9 0min滅菌的固體培養(yǎng)基中(IL固體菌種瓶裝180g濕料)，30°C培養(yǎng)60小時，得固體種子；
(4)固體發(fā)酵培養(yǎng):將步驟(3)得到的固體種倒入IOL無菌水中，攪拌混勻，將該菌液以1% v/w (體積質(zhì)量比)的接種量，接種于經(jīng)121°C、900min滅菌的固體培養(yǎng)基中，隨后將接種的固體培養(yǎng)基以10厘米的厚度平攤于淺盤中，再將淺盤置于滅菌的固體發(fā)酵房內(nèi)的擱架上發(fā)酵，控制環(huán)境溫度在30°C，同時利用空壓機往固體發(fā)酵房中通無菌風(fēng)，發(fā)酵72小時，發(fā)酵結(jié)束；
(5)發(fā)酵產(chǎn)物烘干:將步驟(4)發(fā)酵產(chǎn)物置于50°C烘房中烘干36小時，期間取樣測定水分，當(dāng)含水率低于20%時，烘干過程結(jié)束；
(6)發(fā)酵產(chǎn)物閃蒸:將步驟(5)所得發(fā)酵產(chǎn)物輸入閃蒸機閃蒸干燥，閃蒸進口溫度90°C，出口溫度60°C。干燥結(jié)束收集產(chǎn)物并粉碎，過80目篩，所得粉末即為含地衣芽孢桿菌活菌的固體發(fā)酵產(chǎn)品。以系列稀釋法對含地衣芽孢桿菌活菌的固體發(fā)酵成品進行菌落技術(shù)，結(jié)果是:有效活菌數(shù)為9.1 X 101°/克發(fā)酵干料，芽孢率92%，水分3.2%。上述營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基配方及制備方法為:牛肉膏3g/L，蛋白胨10g/L，氯化鈉5g/L, pH7.(T7.2，配制斜面培養(yǎng)基時加入15 g/L的瓊脂，121°C滅菌15分鐘。上述固體種子培養(yǎng)、固體發(fā)酵培養(yǎng)用培養(yǎng)基配方及制備方法為:米糠40%，豆柏粉20%，玉米粉20%，花生殼粉12.5%酵母粉1%，硫酸鎂0.5%，磷酸氫二鉀0.5%，硫酸錳0.5%，碳酸鈣5%，料水質(zhì)量比1:0.9，用石灰調(diào)pH為10.0。均勻混合后在121°C，蒸汽滅菌90分鐘備用。實施例2。本實施例的一種高密度固體發(fā)酵生產(chǎn)地衣芽孢桿菌的方法，包括以下步驟:
(1)菌種選擇:選用地衣芽抱桿菌iBaclicuslincheniformis) CGMCC1.0518菌株； (2)斜面種子培養(yǎng):將步驟(I)所述菌株，在無菌條件下接種于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基斜面上，30°C培養(yǎng)48小時，得斜面種；
(3)固體種子培養(yǎng):將斜面種用無菌水洗下，收集于三角瓶中，以系列稀釋法進行平板計數(shù)，該菌懸液活菌含量為1.8X109/mL，用無菌水稀釋為lX108/mL，然后以5% v/w (體積質(zhì)量比)的接種量，將該菌液接種于經(jīng)12rC、100min滅菌的固體培養(yǎng)基中(1L固體菌種瓶裝190g濕料)，32°C培養(yǎng)55小時，得固體種子；
(4)固體發(fā)酵培養(yǎng):將步驟(3)得到的固體種倒入20L無菌水中，攪拌混勻，將該菌液以2% v/w (體積質(zhì)量比)的接種量，接種于經(jīng)121°C、100min滅菌的固體培養(yǎng)基中，隨后將接種的固體培養(yǎng)基以12厘米的厚度平攤于淺盤中，再將淺盤置于滅菌的固體發(fā)酵房內(nèi)的擱架上發(fā)酵，控制環(huán)境溫度在32°C，同時利用空壓機往固體發(fā)酵房中通無菌風(fēng)，發(fā)酵84小時，發(fā)酵結(jié)束；
(5)發(fā)酵產(chǎn)物烘干:將步驟(4)發(fā)酵產(chǎn)物置于55°C烘房中烘干24小時，期間取樣測定水分，當(dāng)含水率低于20%時，烘干過程結(jié)束；
(6)發(fā)酵產(chǎn)物閃蒸:將步驟(5)所得發(fā)酵產(chǎn)物輸入閃蒸機閃蒸干燥，閃蒸進口溫度IOO0C，出口溫度70°C。干燥結(jié)束收集產(chǎn)物并粉碎，過80目篩，所得粉末即為含地衣芽孢桿菌活菌的固體發(fā)酵產(chǎn)品。以系列稀釋法對含地衣芽孢桿菌活菌的固體發(fā)酵成品進行菌落技術(shù)，結(jié)果是:有效活菌數(shù)為9.8 X 101°/克發(fā)酵干料，芽孢率94%，水分3.3%。上述營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基配方及制備方法為:牛肉膏3g/L，蛋白胨10g/L，氯化鈉5g/L, pH7.(T7.2，配制斜面培養(yǎng)基時加入15 g/L的瓊脂，121°C滅菌15分鐘。上述固體種子培養(yǎng)、固體發(fā)酵培養(yǎng)用培養(yǎng)基配方及制備方法為:米糠49.7%，豆柏粉25%，玉米粉10%，花生殼粉10%酵母粉2%，硫酸鎂0.1%，磷酸氫二鉀0.1%，硫酸錳0.1%，碳酸鈣3%，料水質(zhì)量比1: 1，用石灰調(diào)pH為10.0。均勻混合后在121°C，蒸汽滅菌100分鐘備用。實施例3。本實施例的一種高密度固體發(fā)酵生產(chǎn)地衣芽孢桿菌的方法，包括以下步驟:
(1)菌種選擇:選用地衣芽抱桿菌iBaclicuslincheniformis) CGMCC1.0518菌株；
(2)斜面種子培養(yǎng):將步驟(I)所述菌株，在無菌條件下接種于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基斜面上，30°C培養(yǎng)48小時，得斜面種； (3)固體種子培養(yǎng):將斜面種用無菌水洗下，收集于三角瓶中，以系列稀釋法進行平板計數(shù)，該菌懸液活菌含量為2 X109/mL，用無菌水稀釋為lX108/mL，然后以5% v/w (體積質(zhì)量比)的接種量，將該菌液接種于經(jīng)121°C、120min滅菌的固體培養(yǎng)基中(1L固體菌種瓶裝200g濕料)，40°C培養(yǎng)48小時，得固體種子；
(4)固體發(fā)酵培養(yǎng):將步驟(3)得到的固體種倒入25L無菌水中，攪拌混勻，將該菌液以3% v/w (體積質(zhì)量比)的接種量，接種于經(jīng)121°C、120min滅菌的固體培養(yǎng)基中，隨后將接種的固體培養(yǎng)基以15厘米的厚度平攤于淺盤中，再將淺盤置于滅菌的固體發(fā)酵房內(nèi)的擱架上發(fā)酵，控制環(huán)境溫度在40°C，同時利用空壓機往固體發(fā)酵房中通無菌風(fēng)，發(fā)酵72小時，發(fā)酵結(jié)束；
(5)發(fā)酵產(chǎn)物烘干:將步驟(4)發(fā)酵產(chǎn)物置于60°C烘房中烘干36小時，期間取樣測定水分，當(dāng)含水率低于20%時，烘干過程結(jié)束；
(6)發(fā)酵產(chǎn)物閃蒸:將步驟(5)所得發(fā)酵產(chǎn)物輸入閃蒸機閃蒸干燥，閃蒸進口溫度100°C，出口溫度65°C。干燥結(jié)束收集產(chǎn)物并粉碎，過80目篩，所得粉末即為含地衣芽孢桿菌活菌的固體發(fā)酵產(chǎn)品。以系列稀釋法對含地衣芽孢桿菌活菌的固體發(fā)酵成品進行菌落技術(shù)，結(jié)果是:有效活菌數(shù)為1.05 X IO11/克發(fā)酵干料，芽孢率91%，水分3.1%。上述營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基配方及制備方法為:牛肉膏3g/L，蛋白胨10g/L，氯化鈉5g/L, pH7.(T7.2，配制斜面培養(yǎng)基時加入15 g/L的瓊脂，121°C滅菌15分鐘。上述固體種子培養(yǎng)、固體發(fā)酵培養(yǎng)用培養(yǎng)基配方及制備方法為:米糠60%，豆柏粉20%，玉米粉5%，花生殼粉7.1%酵母粉3%，硫酸鎂0.3%，磷酸氫二鉀0.3%，硫酸錳0.3%，碳酸鈣4%，料水質(zhì)量比1:0.9，用石灰調(diào)pH為10.0。均勻混合后在121°C，蒸汽滅菌120分鐘備用。實施例4。本實施例的一種高密度固體發(fā)酵生產(chǎn)地衣芽孢桿菌的方法，包括以下步驟:
(1)菌種選擇:選用地衣芽抱桿菌iBaclicuslincheniformis) CGMCC1.0518菌株；
(2)斜面種子培養(yǎng):將步驟(I)所述菌株，在無菌條件下接種于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基斜面上，28°C培養(yǎng)45小時，得斜面種；
(3)固體種子培養(yǎng):將斜面種用無菌水洗下，收集于三角瓶中，以系列稀釋法進行平板計數(shù)，該菌懸液活菌含量為2 X109/mL，用無菌水稀釋為lX108/mL，然后以6% v/w (體積質(zhì)量比)的接種量，將該菌液接種于經(jīng)121°C、110min滅菌的固體培養(yǎng)基中(1L固體菌種瓶裝200g濕料)，28°C培養(yǎng)96小時，得固體種子；
(4)固體發(fā)酵培養(yǎng):將步驟(3)得到的固體種倒入IOL無菌水中，攪拌混勻，將該菌液以4% v/w (體積質(zhì)量比)的接種量，接種于經(jīng)121°C、110min滅菌的固體培養(yǎng)基中，隨后將接種的固體培養(yǎng)基以16厘米的厚度平攤于淺盤中，再將淺盤置于滅菌的固體發(fā)酵房內(nèi)的擱架上發(fā)酵，控制環(huán)境溫度在45 °C，同時利用空壓機往固體發(fā)酵房中通無菌風(fēng)，發(fā)酵48小時，發(fā)酵結(jié)束；
(5)發(fā)酵產(chǎn)物烘干:將步驟(4)發(fā)酵產(chǎn)物置于80°C烘房中烘干24小時，期間取樣測定水分，當(dāng)含水率低于20%時，烘干過程結(jié)束；
(6)發(fā)酵產(chǎn)物閃蒸:將步驟(5)所得發(fā)酵產(chǎn)物輸入閃蒸機閃蒸干燥，閃蒸進口溫度1200C，出口溫度70°C。干燥結(jié)束收集產(chǎn)物并粉碎，過80目篩，所得粉末即為含地衣芽孢桿菌活菌的固體發(fā)酵產(chǎn)品。以系列稀釋法對含地衣芽孢桿菌活菌的固體發(fā)酵成品進行菌落技術(shù)，結(jié)果是:有效活菌數(shù)為9.1 X 101°/克發(fā)酵干料，芽孢率95%，水分3.4%。上述營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基配方及制備方法為:牛肉膏3g/L，蛋白胨10g/L，氯化鈉5g/L, pH7.0-7.2，配制斜面培養(yǎng)基時加入15 g/L的瓊脂，121°C滅菌15分鐘。上述固體種子培養(yǎng)、固體發(fā)酵培養(yǎng)用培養(yǎng)基配方及制備方法為:米糠45%，豆柏粉35%，玉米粉7%，花生殼粉5.5%酵母粉1%，硫酸鎂0.5%，磷酸氫二鉀0.5%，硫酸錳0.5%，碳酸鈣5%，料水質(zhì)量比1:1.1，用石灰調(diào)pH為9.0。均勻混合后在121°C，蒸汽滅菌110分鐘備用。實施例5。本實施例的一種高密度固體發(fā)酵生產(chǎn)地衣芽孢桿菌的方法，包括以下步驟:
(1)菌種選擇:選用地衣芽抱桿菌iBaclicuslincheniformis) CGMCC1.0518菌株；
(2)斜面種子培養(yǎng):將步驟(I)所述菌株，在無菌條件下接種于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基斜面上，35°C培養(yǎng)40小時，得斜面種；
(3)固體種子培養(yǎng):將斜面種用無菌水洗下，收集于三角瓶中，以系列稀釋法進行平板計數(shù)，該菌懸液活菌含量為1.8X109/mL，用無菌水稀釋為lX108/mL，然后以8% v/w (體積質(zhì)量比)的接種量，將該菌液接種于經(jīng)12rC、120min滅菌的固體培養(yǎng)基中(1L固體菌種瓶裝220g濕料)，40°C培養(yǎng)75小時，得固體種子；
(4)固體發(fā)酵培養(yǎng):將步驟(3)得到的固體種倒入20L無菌水中，攪拌混勻，將該菌液以5% v/w (體積質(zhì)量比)的接種量,接種于經(jīng)12rC、120min滅菌的固體培養(yǎng)基中，隨后將接種的固體培養(yǎng)基以18厘米的厚度平攤于淺盤中，再將淺盤置于滅菌的固體發(fā)酵房內(nèi)的擱架上發(fā)酵，控制環(huán)境溫度在36°C，同時利用空壓機往固體發(fā)酵房中通無菌風(fēng)，發(fā)酵100小時，發(fā)酵結(jié)束；
(5)發(fā)酵產(chǎn)物烘干:將步驟(4)發(fā)酵產(chǎn)物置于75°C烘房中烘干40小時，期間取樣測定水分，當(dāng)含水率低于20%時，烘干過程結(jié)束；
(6)發(fā)酵產(chǎn)物閃蒸:將步驟(5)所得發(fā)酵產(chǎn)物輸入閃蒸機閃蒸干燥，閃蒸進口溫度95°C，出口溫度75°C。干燥結(jié)束收集產(chǎn)物并粉碎，過80目篩，所得粉末即為含地衣芽孢桿菌活菌的固體發(fā)酵產(chǎn)品。以系列稀釋法對含地衣芽孢桿菌活菌的固體發(fā)酵成品進行菌落技術(shù)，結(jié)果是:有效活菌數(shù)為9.8 X 101°/克發(fā)酵干料，芽孢率97%，水分3.5%。上述營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基配方及制備方法為:牛肉膏3g/L，蛋白胨10g/L，氯化鈉5g/L, pH7.(T7.2，配制斜面培養(yǎng)基時加入15 g/L的瓊脂，121°C滅菌15分鐘。上述固體種子培養(yǎng)、固體發(fā)酵培養(yǎng)用培養(yǎng)基配方及制備方法為:米糠50%，豆柏粉22%，玉米粉11%，花生殼粉8.4%酵母粉5%，硫酸鎂0.2%，磷酸氫二鉀0.2%，硫酸錳0.2%，碳酸鈣3%，料水質(zhì)量比1:1，用石灰調(diào)pH為9.5。均勻混合后在121°C，蒸汽滅菌120分鐘備用。實施例6。本實施例的一種高密度固體發(fā)酵生產(chǎn)地衣芽孢桿菌的方法，包括以下步驟:
(1)菌種選擇:選用地衣芽抱桿菌iBaclicuslincheniformis) CGMCC1.0518菌株；
(2)斜面種子培養(yǎng):將步驟(I)所述菌株，在無菌條件下接種于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基斜面上，45°C培養(yǎng)36小時，得斜面種；
(3)固體種子培養(yǎng):將斜面種用無菌水洗下，收集于三角瓶中，以系列稀釋法進行平板計數(shù)，該菌懸液活菌含量為2 X109/mL，用無菌水稀釋為lX108/mL，然后以10% v/w(體積質(zhì)量比)的接種量，將該菌液接種于經(jīng)121°C、115min滅菌的固體培養(yǎng)基中(1L固體菌種瓶裝250g濕料)，45°C培養(yǎng)50小時，得固體種子；
(4)固體發(fā)酵培養(yǎng):將步驟(3)得到的固體種倒入25L無菌水中，攪拌混勻，將該菌液以3% v/w (體積質(zhì)量比)的接種量,接種于經(jīng)12rC、115min滅菌的固體培養(yǎng)基中，隨后將接種的固體培養(yǎng)基以20厘米的厚度平攤于淺盤中，再將淺盤置于滅菌的固體發(fā)酵房內(nèi)的擱架上發(fā)酵，控制環(huán)境溫度在28°C，同時利用空壓機往固體發(fā)酵房中通無菌風(fēng)，發(fā)酵120小時，發(fā)酵結(jié)束；
(5)發(fā)酵產(chǎn)物烘干:將步驟(4)發(fā)酵產(chǎn)物置于70°C烘房中烘干35小時，期間取樣測定水分，當(dāng)含水率低于20%時，烘干過程結(jié)束；
(6)發(fā)酵產(chǎn)物閃蒸:將步驟(5)所得發(fā)酵產(chǎn)物輸入閃蒸機閃蒸干燥，閃蒸進口溫度80°C，出口溫度50°C。干燥結(jié)束收集產(chǎn)物并粉碎，過80目篩，所得粉末即為含地衣芽孢桿菌活菌的固體發(fā)酵產(chǎn)品。以系列稀釋法對含地衣芽孢桿菌活菌的固體發(fā)酵成品進行菌落技術(shù)，結(jié)果是:有效活菌數(shù)為1.05 X IO11/克發(fā)酵干料，芽孢率93%，水分3.3%。上述營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基配方及制備方法為:牛肉膏3g/L，蛋白胨10g/L，氯化鈉5g/L, pH7.(T7.2，配制斜面培養(yǎng)基時加入15 g/L的瓊脂，121°C滅菌15分鐘。上述固體種子培養(yǎng)、固體發(fā)酵培養(yǎng)用培養(yǎng)基配方及制備方法為:米糠50%，豆柏粉20%，玉米粉5%，花生殼粉16.1%酵母粉4%，硫酸鎂0.3%，磷酸氫二鉀0.3%，硫酸錳0.3%，碳酸鈣4%，料水質(zhì)量比1:1.1，用石灰調(diào)pH為9.0。均勻混合后在121°C，蒸汽滅菌115分鐘備用。本發(fā)明的實施例1飛的各項數(shù)據(jù)列表如下。表1:實施例1飛的各步驟參數(shù)表。
權(quán)利要求
1.一種高密度固體發(fā)酵生產(chǎn)地衣芽孢桿菌活菌的方法，其特征在于，它包括以下步驟: (1)菌種選擇:選用地衣芽抱桿菌iBaclicuslincheniformis) CGMCC1.0518菌株； (2)斜面種子培養(yǎng):將步驟(I)所述菌株，在無菌條件下接種于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基斜面上，培養(yǎng)溫度為28 45°C，培養(yǎng)時間為36 48小時，得斜面種； (3)固體種子培養(yǎng):將步驟(2)得到的斜面種用無菌水洗下，收集于三角瓶中，調(diào)整菌液濃度為IO8個/mL，然后以5 10% v/w (體積質(zhì)量比)的接種量，將該菌液接種于經(jīng)121°C、9(Tl20min滅菌的固體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度為28 45°C，培養(yǎng)時間為48、6小時，得固體種子; (4)固體發(fā)酵培養(yǎng):將步驟(3)得到的固體種子倒入IOlOL無菌水中，攪拌混勻，將該菌液以廣5% v/w (體積質(zhì)量比)的接種量，接種于經(jīng)121°C、9(Tl20min滅菌的固體培養(yǎng)基中，隨后將接種的固體培養(yǎng)基以1(T20厘米的厚度平攤于淺盤中，再將淺盤置于滅菌的固體發(fā)酵房內(nèi)的擱架上發(fā)酵，控制環(huán)境溫度在28 45°C，同時利用空壓機往固體發(fā)酵房中通無菌風(fēng)，發(fā)酵48 120小時，發(fā)酵結(jié)束； (5)發(fā)酵產(chǎn)物烘干:將步驟(4)的發(fā)酵產(chǎn)物置于5(T80°C烘房中烘干24 48小時，期間取樣測定水分，當(dāng)含水率低于20%時，烘干過程結(jié)束； (6)發(fā)酵產(chǎn)物閃蒸:將步驟(5)所得發(fā)酵產(chǎn)物輸入閃蒸機閃蒸干燥，閃蒸機進口溫度為8(Tl30°C，出口溫度為5(T70°C ;干燥結(jié)束收集產(chǎn)物并粉碎，過80目篩，所得粉末即為含地衣芽孢桿菌活菌的固體發(fā)酵產(chǎn)品； 其中，所述步驟(2)涉及的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基配方及制備方法為:牛肉膏3g/L，蛋白胨10g/L，氯化鈉5 g/L，pH7.(T7.`2，配制斜面培養(yǎng)基時加入15 g/L的瓊脂，121°C滅菌15分鐘； 其中，所述步驟(3)和步驟(4)中涉及的固體種子培養(yǎng)、固體發(fā)酵培養(yǎng)用固體培養(yǎng)基配方及制備方法為:以重量百分比計，米糠40 60%，豆柏粉20 40%，玉米粉5 20%，花生殼粉5 20%酵母粉1 5%，硫酸鎂0.1 0.5%，磷酸氫二鉀0.1 0.5%，硫酸錳0.1 0.5%，碳酸鈣1 5%，料水質(zhì)量比1:0.9 1: 1.1，用石灰調(diào)pH為9.(T10.0，均勻混合后在121。。，蒸汽滅菌90 120分鐘備用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種高密度固體發(fā)酵生產(chǎn)地衣芽孢桿菌活菌的方法，其特征在于:所述步驟(3)和步驟(4)中，所述固體培養(yǎng)基均為IL固體菌種瓶裝18(T250g濕固體培養(yǎng)基料。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種高密度固體發(fā)酵生產(chǎn)地衣芽孢桿菌活菌的方法，其特征在于:所述步驟(3)中，固體種子培養(yǎng)用固體培養(yǎng)基配方及制備方法為以重量百分比計，米糠40 50%，豆柏粉20 25%，玉米粉10 20%，花生殼粉5 12%酵母粉I 5%，硫酸鎂0.1 0.5%，磷酸氫二鉀0.1 0.5%，硫酸錳0.1 0.5%，碳酸鈣3 5%，料水質(zhì)量比1:0.9 1: 1.1，用石灰調(diào)pH為9.(T10.0，均勻混合后在121 °C，蒸汽滅菌10(Tl20分鐘備用。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種高密度固體發(fā)酵生產(chǎn)地衣芽孢桿菌活菌的方法,其特征在于:所述步驟(4)中，固體發(fā)酵用固體培養(yǎng)基配方及制備方法為以重量百分比計，米糠45 60%，豆柏粉20 35%，玉米粉5 15%，花生殼粉10 20%酵母粉I 5%，硫酸鎂0.1 0.5%，磷酸氫二鉀0.1 0.5%，硫酸錳0.1 0.5%，碳酸鈣2 4%，料水質(zhì)量比1:0.9 1: 1.1，用石灰調(diào)pH為9.(Tl0.0，均勻混合后在121°C，蒸汽滅菌10(Tl20分鐘備用。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種高密度固體發(fā)酵生產(chǎn)地衣芽孢桿菌活菌的方法，其特征在于:所述步驟(2)中，培養(yǎng)溫度為35 40°C，培養(yǎng)時間為40 48小時。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種高密度固體發(fā)酵生產(chǎn)地衣芽孢桿菌活菌的方法，其特征在于:所述步驟(3)中，培養(yǎng)溫度為35 40°C，培養(yǎng)時間為6(T84小時。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種高密度固體發(fā)酵生產(chǎn)地衣芽孢桿菌活菌的方法，其特征在于:所述步驟(4)中，環(huán)境溫度在35 45°C，發(fā)酵時間為6(Tl08小時。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種高密度固體發(fā)酵生產(chǎn)地衣芽孢桿菌活菌的方法，其特征在于:所述步驟(4)中，無菌風(fēng)的氣流速度是7 10米/分鐘。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種高密度固體發(fā)酵生產(chǎn)地衣芽孢桿菌活菌的方法，其特征在于:所述步 驟(5)中，烘房溫度為5(T65°C，烘干時間為24 36小時。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種高密度固體發(fā)酵生產(chǎn)地衣芽孢桿菌活菌的方法，它包括以下步驟菌種選擇、斜面種子培養(yǎng)、固體種子培養(yǎng)、固體發(fā)酵培養(yǎng)、發(fā)酵產(chǎn)物烘干和發(fā)酵產(chǎn)物閃蒸。本發(fā)明的培養(yǎng)基原料都是采用農(nóng)副產(chǎn)品，成本低，配方合理，能夠滿足菌種繁殖營養(yǎng)需要。特別是加入碳酸鈣緩沖培養(yǎng)過程中培養(yǎng)基的pH值變化，能大大提高了固體發(fā)酵的地衣芽孢桿菌有效活菌含量，實驗及生產(chǎn)證明利用本發(fā)明方法制備的地衣芽孢桿菌的有效活菌數(shù)可達1000億/克，產(chǎn)品雜菌率低于5%，且芽孢率高，達90%以上，能大大降低企業(yè)的生產(chǎn)成本，滿足微生物菌劑生產(chǎn)的需要。
文檔編號C12R1/10GK103205388SQ201310164809
公開日2013年7月17日 申請日期2013年5月8日 優(yōu)先權(quán)日2013年5月8日
發(fā)明者張新雄, 彭鋒, 毛光平, 張東升, 常留群 申請人:東莞市保得生物工程有限公司