專利名稱：水稻轉錄因子Os05g41070基因的應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及基因工程領域，具體地說，涉及水稻轉錄因子0s05g41070基因的應用。
背景技術：
在長日照植物(LDP)擬南芥(Baurleand Dean, 2006; Imaizumi and Kay, 2006)和短日照植物(SDP)水稻(Izawa，2007; Tuji等，2008)中，開花信號途徑已得到了廣泛的研究。G1-CO-FT是控制水稻開花的保守途徑(Yano等，2000;Kojima等，2002;Hayama等，2002)。Hd3a是水稻中FT的同源基因，它受到一個B型響應調控子Ehdl的誘導，該途徑在短日照條件下獨立于Hdl基因(Doi等，2004)。0sMADS51受OsGI的調控，該作用位于Ehdl的上游(Kim等，2007)。相反，在長日照條件下，Hdl抑制Hd3a的表達而推遲水稻開花(Hayama等，2003)。最新研究表明，Hd3a與14_3_3蛋白形成復合體后轉入細胞核內，與轉錄因子FDl結合形成三聚體FAC (f lorigen activation complex),誘導0sMADS15的轉錄，從而使水稻開花。轉錄因子在體內的作用大體上可以分成兩種:一種為轉錄增強子，另一種為轉錄抑制子。當轉錄因子和EAR功能域基序融合之后，它就會抑制轉錄因子的功能，從而在轉基因植株中出現(xiàn)更明顯的表型變化。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供水稻轉錄因子0s05g41070基因的應用。為了實現(xiàn)本發(fā)明目 的，本發(fā)明首先提供一種融合蛋白，該融合蛋白為0s05g41070-Linker-EAR 或 EAR-Linker-0s05g41070。其中，Linker 由 I 20 個柔性氨基酸串聯(lián)而成(例如，GGGGG, GPPPG或Gatway載體重組位點編碼的氨基酸序列DPAFLYKVVPR
OEAR為來自植物轉錄因子的一段具有轉錄抑制功能的蛋白基序，其氨基酸序列如Seq ID N0.2所示，或該序列經替換、缺失或添加一個或幾個氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列，0s05g41070為水稻轉錄因子0s05g41070，其氨基酸序列如Seq ID N0.1所示，或該序列經替換、缺失或添加一個或幾個氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。優(yōu)選地，前述融合蛋白為0s05g41070-Linker_EAR。本發(fā)明還提供編碼所述融合蛋白的基因，以及在嚴格條件下，可與該基因的核苷酸序列雜交的核苷酸序列；其中，所述嚴格條件為65°C，在0.1 X SSPE或0.1XSSC、0.1%SDS的溶液中雜交并洗膜。本發(fā)明還提供含有編碼所述融合蛋白的基因的載體。所述載體為任一種可引導外源基因在宿主中表達的載體。優(yōu)選地，所述載體為植物雙元表達載體(例如，PCAMBIA1301)。在將本發(fā)明編碼所述融合蛋白的基因構建到植物表達載體中時，可在其轉錄起始核苷酸前添加任一種強啟動子(例如，玉米強啟動子Ubiquitin)或誘導型啟動子。此外，在將本發(fā)明編碼所述融合蛋白的基因構建到植物表達載體中時，還可以使用增強子，且這些增強子區(qū)域必須與編碼序列的閱讀框相同，以確保整條序列的翻譯。 本發(fā)明還提供含有編碼所述融合蛋白的基因的轉基因細胞系。本發(fā)明還提供含有編碼所述融合蛋白的基因的工程菌。本發(fā)明還提供編碼所述融合蛋白的基因在使水稻抽穗提前、縮短生育期中的應用。本發(fā)明進一步提供水稻轉錄因子0s05g41070基因的應用，其是將水稻轉錄因子0s05g41070基因的⑶S序列(完整翻譯區(qū))構建到轉錄因子抑制基序EAR的上游，轉化水稻，篩選并最終獲得轉基因水稻。前述的應用，其是將水稻轉錄因子0s05g41070基因的CDS序列通過Gateway系統(tǒng)構建到轉錄因子抑制基序EAR的上游，轉化水稻(如水稻品種‘kitaake’)，從而使轉基因水稻的抽穗期提前、縮短生育期。其中，水稻轉錄因子0s05g41070基因的⑶S序列如Seq IDN0.3所示,轉錄因子抑制基序EAR的核苷酸序列如Seq ID N0.4所示。攜帶有編碼所述融合蛋白的基因的表達載體可通過使用Ti質粒、植物病毒載體、直接DNA轉化、微注射、電穿孔等常規(guī)生物技術方法導入植物細胞中(ffeissbach, 1998, Method for Plant Molecular Biology VIII, Academy Press, NewYork, pp.411-463;Geiserson and Corey,1998, Plant Molecular Biology, 2nd Edition)。

本發(fā)明首次利用轉錄因子抑制基序EAR與水稻轉錄因子0s05g41070基因融合構建得到組成型轉錄因子，并轉化到農作物，如水稻中，從而使轉基因水稻的抽穗期提前、縮短生育期。對于詳細闡明水稻抽穗調控的分子機理，具有重要的理論價值，并且可以通過轉基因手段，縮短水稻生育期，改善水稻對不同生態(tài)區(qū)的適應能力，因此在生產中同樣具有重要意義。


圖1為本發(fā)明實施例1中cEAR-bar-asRED載體圖譜。圖2為本發(fā)明實施例1中ub1:0s05g41070-EAR載體圖譜。圖3為本發(fā)明實施例3中實時熒光定量PCR檢測轉基因陽性水稻株系的結果；其中，WT為野生型水稻‘kitaake’，E74-1、E74-2和E74-3分別為0s05g41070_EAR轉基因水稻的3個株系。圖4為本發(fā)明實施例4中0s05g41070-EAR轉基因水稻株系的表型分析結果；其中，WT為野生型水稻‘kitaake’，E74-1、E74-2和E74-3分別為0s05g41070_EAR轉基因水稻的3個株系。圖5為本發(fā)明實施例4中0s05g41070-EAR轉基因水稻株系抽穗天數(shù)；其中，WT為野生型水稻‘kitaake’，Ε74-1、Ε74-2和E74-3分別為0s05g41070_EAR轉基因水稻的3個株系。
具體實施例方式以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規(guī)手段，所用原料均為市售商品。實施例1水稻轉錄因子0s05g41070基因的獲得及植物表達載體的構建登錄 http://rice.plantbiology.msu.edu/analyses_search_locus.shtml 網站，找到水稻轉錄因子0s05g41070基因，根據(jù)其序列設計PCR擴增引物:0s05g41070-F:5/ -CAAAAAAGCAGGCTTCATGATTCAGGCAATGGCTTCG-3'0s05g41070-R:5/ -CAAGAAAGCTGGGTCGAAGGCGGCCGAGCTTGTTC-3'以水稻品種‘日本晴’葉片為材料，TRIzol法提取總RNA，反轉錄得cDNA，反應步驟如下:(1)在冰上向不含核酸酶的PCR反應管中依次加入下列物質:總RNA6 μ I (0.lng-δμ g), Oligo (dT) 18 引物 I μ 1，不含核酸酶的 ddH20 5 μ 1，置于 PCR 儀中 65 °C反應5min ； (2)然后再加入下列物質:5X反應緩沖液4 μ 1，RNase抑制劑I μ 1，IOmM dNTP2 μ 1，M-M μ IV反轉錄酶I μ 1，輕輕混勻，在PCR儀中45°C反應60min ; (3) PCR儀中，70°C5min,終止反應。以總cDNA為模板，進行PCR擴增，擴增體系為:反應緩沖液25 μ 1，dNTP4 μ I, ddH20 17.5 μ I, Taq DNA 聚合酶 0.5 μ 1，反應程序為熱啟動 98°C 10s，57°C 5s，72°Clmin,30個循環(huán)后，72°C延伸lOmin，最后25°C反應結束。獲得水稻轉錄因子0s05g41070基因的CDS序列，其核苷酸序列如Seq ID N0.3所示。按照PrimeSTAR聚合酶擴增體系和反應程序進行PCR。根據(jù)Gateway克隆技術的要求，此過程中包含兩輪PCR,第一輪PCR的引物采用添加部分adaptor attB接頭的引物，而第二輪的模板用第一輪的PCR產物，并且引物采用完整的adaptor attB引物。將PCR產物克隆到pDONR克隆載體上，經 測序鑒定得到與目的基因完全相同的序列。通過LR反應將0s05g41070基因構建到植物表達載體cEAR-bar-asRED (圖1)上，獲得載體ub1:0s05g41070-EAR (圖 2，載體全序列如 Seq ID N0.5 所示)。其中，植物表達載體cEAR-bar-asRED的構建過程為:以雙元表達載體pCAMBIA1300左右邊界包含的序列為骨架序列，通過體外重組，將ubipromoter-Gateway-EAR 表達單兀、35S promoter-asRED 表達單兀和 35S promoter-bar 表達單元與之融合構建得到，載體cEAR-bar-asRED的全序列如Seq ID N0.6所示。實施例2轉基因水稻植株的獲得取水稻‘kitaake’成熟種子，人工或機械脫殼，挑選飽滿光潔無菌斑的種子經消毒之后接種到誘導培養(yǎng)基上進行誘導培養(yǎng)。選擇外觀良好，生長力好的水稻愈傷組織為受體材料，采用農桿菌介導法將ub1: 0s05g41070-EAR轉入水稻愈傷組織中，用含有100 μ M的乙酰丁香酮和OD=0.7的農桿菌的AAM轉化液進行轉化，將轉化液浸泡過的愈傷組織置于共培養(yǎng)基上進行共培養(yǎng)，25°C暗培養(yǎng)3d后置于篩選培養(yǎng)基上培養(yǎng)約30d，每IOd繼代I次。然后將篩出的抗性愈傷轉移到分化培養(yǎng)基上分化約20d，每IOd繼代I次。將分化出綠色小苗的抗性愈傷轉移到生根培養(yǎng)基上生根，待約7d長出發(fā)達根系后煉苗，并計算轉化所獲轉基因苗數(shù)。煉苗7d后轉移至大田生長。用Basta篩選轉基因水稻，長出4片幼葉后開始噴灑Basta (1:1000, v:v)，隔I天噴I次，共噴灑3次。共獲得轉基因水稻42株。其中，誘導培養(yǎng)基配方為:N6大量+B5微量+NB有機+鐵鹽+銅鈷母液+2.5mg/L2，4-D+0.6g/L酸水解酪蛋白+2.878g/L脯氨酸+0.5g/L谷氨酰胺+30g/L蔗糖，以水配制，調pH至5.8 5.9后加入植物凝膠4g/L。共培養(yǎng)基配方為:N6大量+B5微量+NB有機+鐵鹽+2.5mg/L 2，4-D+0.5g/L谷氨酰胺+0.6g/L酸水解酪蛋白+10g/L葡萄糖+30g/L鹿糖，以水配制,調pH至5.2后加入植物凝膠4g/L。滅菌后，50°C左右加入AS (乙酰丁香酮)100 200μ g/mL。篩選培養(yǎng)基配方為:N6大量+B5微量+NB有機+鐵鹽+IX銅鈷溶液+2.5mg/L2，4-D+0.6g/L酸水解酪蛋白+2.878g/L脯氨酸+0.5g/L谷氨酰胺+30g/L蔗糖，以水配制，調pH至5.8 5.9后加入植物凝膠4g/L。滅菌后加入35mg/L潮霉素(購自上海紐津生物技術有限公司)或5mg/L Bialaphos (購自北京拜爾迪生物技術公司)。分化培養(yǎng)基配方為:MS無機+MS-B5微量+MS有機+鐵鹽+含I X銅鈷溶液的MS+0.05mg/L NAA+2.0mg/L Kinetin (激動素)+30g/L 山梨醇+2g/L 水解酪蛋白+30g/L 蔗糖，以水配制，調pH至5.8 5.9后加入植物凝膠4g/L。其中，2000X 銅鈷母液(1L)配方:KI 1.5g, Na2MoO4.2H20 0.5g, CuS04.5H200.05g，CoCl2.6H20 0.05g，以水配制。實施例3實時熒光定量PCR檢測轉基因水稻中0s05g41070_EAR的表達為了檢測0s05g41070-EAR在T2代轉基因水稻中的過表達情況，利用實時熒光定量PCR對其在轉錄水平上進行鑒定，經過PCR定量檢測，結果表明轉基因植株0s05g41070的表達量明顯高于野生型(圖3)。具體的實時熒光定量PCR實驗流程如下:取適量轉基因材料及野生型水稻葉片，按照實施例1中的方法提取RNA并反轉錄為cDNA。以此為模板·進行PCR反應，反應程序為:預變性95°C 30s ;95°C變性5s，60°C退火延伸20s，40個循環(huán)。融解曲線的標準程序:95°C，15秒；60°C，1分鐘；95°C，15秒；0.5°C/循環(huán)。按照公式:相對表達量(RQ) =2_ΛΛετ的方法計算相對表達量。反應體系為:SYBR Premix Ex Taq(2X) 10.0 μ 1，PCR 正向引物(10 μ Μ) 0.4 μ 1，PCR 反向引物(10 μ Μ)，
0.4μ 1，ROX 參比染料(ROX Reference Dye，50X ) 0.4 μ 1，cDNA 模板 1.0 μ 1，ddH20 (滅菌蒸懼水)7.8 μ I,總體積為20.0 μ I。實時熒光定量PCR 所用引物序列為:bzip74-QF: 5 ' -CAGGGGAGATTGCAGATAAGCT-3/ ；bzip74-QR:5/ -CGAGCTTGTTCGCCTGAGTT-3'。實施例4轉基因水稻表型分析與野生型水稻‘kitaake’相比，0s05g41070-EAR轉基因水稻株系(Ε74-1、Ε74-2和E74-3)的抽穗期明顯提前，野生型雖未抽穗，但轉基因株系已基本完成抽穗(圖4和圖5)。以上提供的實施例是將水稻轉錄因子0s05g41070基因的CDS序列通過Gateway系統(tǒng)構建到轉錄因子抑制基序EAR的上游，轉化水稻品種‘kitaake’，從而使轉基因水稻的抽穗期提前、縮短生育期。同樣地，將水稻轉錄因子0s05g41070基因的⑶S序列通過Gateway系統(tǒng)構建到轉錄因子抑制基序EAR的下游，轉化水稻品種，也能夠達到提前轉基因水稻的抽穗期、縮短生育期的效果。雖然，上文中已經用一般性說明及具體實施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎上，可以對之作一些修改或改進，這對本領域技術人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎上所做的這些修改或改進，均屬于本發(fā)明要求保護的范圍。
權利要求
1.一種融合蛋白，其特征在于，該融合蛋白為OsOSgMOTO-Linker-EAR或EAR-Linker-0s05g41070 ； 其中，Linker由I 20個柔性氨基酸串聯(lián)而成；EAR為來自植物轉錄因子的一段具有轉錄抑制功能的蛋白基序，其氨基酸序列如Seq ID N0.2所示；0s05g41070為水稻轉錄因子0s05g41070，其氨基酸序列如Seq ID N0.1所示。
2.根據(jù)權利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，該融合蛋白為0s05g41070-Linker-EARo
3.根據(jù)權利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，Linker由GGGGG、GPPPG或DPAFLYKVVPR串聯(lián)而成。
4.編碼權利要求1-3任一項所述融合蛋白的基因。
5.含有權利要求4所述基因的載體。
6.含有權利要求4所述基因的轉基因細胞系。
7.含有權利要求4所述基因的工程菌。
8.權利要求4所述的基因在提前水稻抽穗、縮短生育期中的應用。
9.水稻轉錄因子0s05g41070基因的應用，其特征在于，其是將水稻轉錄因子0s05g41070基因的CDS序列構建到轉錄因子抑制基序EAR的上游，轉化水稻，篩選并最終獲得轉基因水稻。
10.根據(jù)權利要求9所述的應用，其特征在于，其是將水稻轉錄因子0s05g41070基因的⑶S序列通過Gateway系統(tǒng)構建到轉錄因子抑制基序EAR的上游，轉化水稻，從而轉基因水稻的抽穗期提前、縮短生育期。
全文摘要
本發(fā)明涉及水稻轉錄因子Os05g41070基因的應用，其是利用轉錄因子抑制基序EAR與水稻轉錄因子Os05g41070基因融合構建得到組成型轉錄因子，并轉化到農作物如水稻中，從而提前轉基因水稻的抽穗期、縮短生育期。對于詳細闡明水稻抽穗調控的分子機理，具有重要的理論價值，并且可以通過轉基因手段，縮短水稻生育期，改善水稻對不同生態(tài)區(qū)的適應能力，因此在生產實踐中同樣具有重要意義。
文檔編號C12N1/21GK103254314SQ201310156050
公開日2013年8月21日 申請日期2013年4月28日 優(yōu)先權日2013年4月28日
發(fā)明者劉斌, 張春雨, 趙濤, 劉軍, 李宏宇, 林辰濤 申請人:中國農業(yè)科學院作物科學研究所