專利名稱：一種鑒別黑龍江流域野生翹嘴鱖的微衛(wèi)星標(biāo)記方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于水產(chǎn)養(yǎng)殖中野生群體鑒定技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種鑒別黑龍江流域野生翹嘴鱖的微衛(wèi)星標(biāo)記方法。
背景技術(shù)：
翅嘴鱖(Simiperca chuatisi)俗稱桂花魚(yú)，屬S盧形目S盧亞目暖S盧科。具有生長(zhǎng)快，肉質(zhì)鮮美，少細(xì)刺，富含人體必需的氨基酸，脂肪含量低等特點(diǎn)，廣泛分布于中國(guó)各主要江河湖泊的淡水名貴魚(yú)類。除青藏高原以外的各大水系均有分布，以長(zhǎng)江流域各江河湖泊分布最為豐富。黑龍江水系是中國(guó)最北部的水系，雖沒(méi)有長(zhǎng)江水系發(fā)達(dá)，黑龍江仍是世界上漁業(yè)資源最豐富、魚(yú)的種類最多的河流之一。主要魚(yú)類有大馬哈魚(yú)(即鮭魚(yú))、鰲花魚(yú)以及鱘、鰉、鯉、鯰等100多種。黑龍江鱖魚(yú)主要分布于黑龍江、松花江水系，是黑龍江省名優(yōu)魚(yú)類“三花五羅”之一。微衛(wèi)星(Microsatellite)是廣泛存在于真核生物基因組中的以幾個(gè)核苷酸(一般為l_6bp)為重復(fù)單位所組成的簡(jiǎn)單串聯(lián)重復(fù)DNA序列。微衛(wèi)星由于其高度多態(tài)、共顯性、PCR檢測(cè)方便、含量豐富、分布相對(duì)較均勻等特點(diǎn)，而被廣泛的應(yīng)用在群體鑒定、群體遺傳學(xué)、遺傳圖譜的構(gòu)建、QTL作圖和分子標(biāo)記輔助育種等方面。目前，尚沒(méi)有采用微衛(wèi)星分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)黑龍江流域翹嘴鱖野生群體進(jìn)行快速簡(jiǎn)潔的鑒別方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種快捷準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便有效的鑒別黑龍江流域野生翹嘴鱖的微衛(wèi)星標(biāo)記方法。上述目的是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的:一種鑒別黑龍江流域野生翹嘴鱖的微衛(wèi)星標(biāo)記方法，包括以下步驟:DDNA提取:采用基因組DNA提取試劑盒提取翹嘴鱖基因組DNA，并測(cè)定其純度和濃度，取A260/A280值為1.6 2，濃度為30(T3000ng/ μ I的基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增；2) DNA片段擴(kuò)增:采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段，PCR反應(yīng)的一對(duì)引物序列為:正向引物:5’ AGACCAGGTTATCCCAGT 3 ’，反向引物:5，CAGAAGGAACAGAAGAGC3’ ；3) PCR產(chǎn)物的電泳及銀染色鑒定:采用非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，進(jìn)行銀染色，顯影后拍照并記錄電泳結(jié)果；4)與標(biāo)準(zhǔn)圖譜進(jìn)行對(duì)比:與標(biāo)準(zhǔn)圖譜對(duì)比，讀出待測(cè)樣品的目的條帶所處的位置，如樣品在靠近標(biāo)準(zhǔn)圖譜230bp位置擴(kuò)增出I條或2條特異性DNA條帶，則鑒定為是黑龍江野生翹嘴鱖群體；如樣品在靠近 標(biāo)準(zhǔn)圖譜80bp位置擴(kuò)增出I條特異性條帶，則鑒定為是其他野生翹嘴鱖群體。
優(yōu)選的:步驟I)中所提取的基因組DNA的A260/A280值為1.8 1.9。優(yōu)選的:步驟I)中所提取的基因組DNA的濃度為100(T2000ng/^l。其中，步驟2)中的PCR反應(yīng)體系為:
dd 11.1)l().1251.1i
IOxPCR 緩沖液Ι.25μ1
dNTP0.25μ1
上游引信0.25μ1
K游引物0.25μ1
DNA0.25μ1
rTaq H0.125μ1
去離子水補(bǔ)齊至Ι2.5μ1.
其中，步驟2)中所述的PCR反應(yīng)的程序?yàn)?94°C預(yù)變性4min ;94°C變性30s，60°C退火45s，72°C延伸30s，30個(gè)循環(huán)；循環(huán)結(jié)束后72°C延伸lOmin，將產(chǎn)物4°C中保存。其中，步驟3)中所述非變性聚丙烯酰胺凝膠的質(zhì)量濃度為8%。本發(fā)明的有益效果是:本發(fā)明是用于鑒別黑龍江流域野生翹嘴鱖群體的一種分子鑒定方法，操作簡(jiǎn)單快捷，能夠提高對(duì)黑龍江流域野生翹嘴鱖鑒定的效率和準(zhǔn)確性，從而對(duì)該流域的野生翹嘴鱖群體進(jìn)行種質(zhì)資源的保護(hù)。


圖1:為野生翹嘴鱖群體PCR擴(kuò)增的微衛(wèi)星帶譜，從左至右依次為沅江流域野生群體，贛江流域野生群體，陸水水庫(kù)野生群體，黑龍江流域野生群體。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。實(shí)施例1一種鑒別黑龍江流域野生翹嘴鱖的微衛(wèi)星標(biāo)記方法，包括以下步驟:I) DNA 提取:采用TIANGEN血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒提取翹嘴鱖基因組DNA。1.2%瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)檢測(cè)DNA的純度和濃度，取A260/A280值為
1.8 1.9，濃度為100(T2000ng/μ I的基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增。所述的翹嘴鱖樣品選自黑龍江野生群體，陸水水庫(kù)野生群體，贛江野生群體，沅江野生群體，每個(gè) 野生群體隨機(jī)選取18個(gè)樣品，同一群體中每2個(gè)樣品提取DNA后取相同體積做為I個(gè)混合模板。
2) DNA片段擴(kuò)增:采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，以下為PCR反應(yīng)的相關(guān)信息:用于PCR反應(yīng)的一對(duì)引物名稱為MDJ，序列為:正向引物:5’AGACCAGGTTATCCCAGT 3，，反向引物:5，CAGAAGGAACAGAAGAGC3’ ；PCR反應(yīng)體系如下:
dd H20丨().125μ1
10>-PCR 緩沖液(含 Mg2+)1.25μ1
dNTP0.25μ1
上游引物0.25μ1
卜'游引物0.25μ1
:)Ν Λ0.25μ1
ι Γ Κ] lW0.125t1.1
Total12.5μΙ

PCR的反應(yīng)條件為:94°C預(yù)變性4min ;94°C變性30s，60°C退火45s，72°C延伸30s，30個(gè)循環(huán)；循環(huán)結(jié)束后72°C延伸lOmin，將產(chǎn)物4°C中保存；3) PCR產(chǎn)物的電泳及銀染色鑒定:制膠:8%的非變性聚丙烯酰胺凝膠。電泳:每個(gè)產(chǎn)物上樣3μ1，同時(shí)點(diǎn)上標(biāo)準(zhǔn)酶切片段作為分子量標(biāo)記對(duì)比，用IXTBE電泳緩沖液，120V恒壓電泳，電泳藍(lán)色染料至凝膠低端終止。銀染色:染色過(guò)程如下:蒸餾水漂洗兩次，0.1%硝酸銀染色lOmin，蒸餾水快速漂洗2次(時(shí)間控制在15s以內(nèi))，2%的無(wú)水氫氧化鈉和0.04%碳酸鈉的甲醛顯影，顯影在IOmin時(shí)將聚丙烯酰胺凝膠放入凝膠成像系統(tǒng)中拍照。電泳圖譜見(jiàn)附圖1，從左至右依次為沅江流域野生群體，贛江流域野生群體，陸水水庫(kù)野生群體，黑龍江流域野生群體。對(duì)比標(biāo)準(zhǔn)圖譜，靠近ISObp處擴(kuò)增出I條明顯特異性DNA條帶的為除黑龍江流域野生群體的其他三個(gè)群體；在靠近230bp位置擴(kuò)增出2條或3條特異性DNA條帶的為黑龍江流域野生翹嘴鱖群體，根據(jù)擴(kuò)增樣品的位置不同，可以方便快速的鑒別出黑龍江流域野生翹嘴鱖群體。
權(quán)利要求
1.一種鑒別黑龍江流域野生翹嘴鱖的微衛(wèi)星標(biāo)記方法，其特征在于包括以下步驟 1)DNA提取采用基因組DNA提取試劑盒提取翹嘴鱖基因組DNA，并測(cè)定其純度和濃度，取A260/A280值為I. 6 2，濃度為30(T3000ng/ μ I的基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增； 2)DNA片段擴(kuò)增采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段，PCR反應(yīng)的一對(duì)引物序列為 正向引物5’ AGACCAGGTTATCCCAGT 3’， 反向引物5，CAGAAGGAACAGAAGAGC 3’ ； 3)PCR產(chǎn)物的電泳及銀染色鑒定采用非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，進(jìn)行銀染色，顯影后拍照并記錄電泳結(jié)果； 4)與標(biāo)準(zhǔn)圖譜進(jìn)行對(duì)比與標(biāo)準(zhǔn)圖譜對(duì)比，讀出待測(cè)樣品的目的條帶所處的位置，如樣品在靠近標(biāo)準(zhǔn)圖譜230bp位置擴(kuò)增出I條或2條特異性DNA條帶，則鑒定為是黑龍江野生翹嘴鱖群體；如樣品在靠近標(biāo)準(zhǔn)圖譜80bp位置擴(kuò)增出I條特異性條帶，則鑒定為是其他野生翹嘴鱖群體。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的鑒別黑龍江流域野生翹嘴鱖的微衛(wèi)星標(biāo)記方法，其特征在于步驟I)中所提取的基因組DNA的A260/A280值為I. 8 I. 9。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的鑒別黑龍江流域野生翹嘴鱖的微衛(wèi)星標(biāo)記方法，其特征在于步驟I)中所提取的基因組DNA的濃度為100(T2000ng/^l。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的鑒別黑龍江流域野生翹嘴鱖的微衛(wèi)星標(biāo)記方法，其特征在于步驟2)中的PCR反應(yīng)體系為 ddH2010.125μΙ IOxPCR 緩沖液1.25μ1 dNTP0.25μ1 Jt游引物0.25μ1 T游引物0.25μ1 DNA0.25μ1 rTaq 酶0.125μ1 去離子水補(bǔ)齊至
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的鑒別黑龍江流域野生翹嘴鱖的微衛(wèi)星標(biāo)記方法，其特征在于步驟2)中所述的PCR反應(yīng)的程序?yàn)?4°C預(yù)變性4min ;94°C變性30s，60°C退火45s，72°C延伸30s，30個(gè)循環(huán)；循環(huán)結(jié)束后72°C延伸lOmin，將產(chǎn)物4°C中保存。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種鑒別翹嘴鱖黑龍江流域野生群體的微衛(wèi)星標(biāo)記方法，其特征在于步驟3)中所述非變性聚丙烯酰胺凝膠的質(zhì)量濃度為8%。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種鑒別黑龍江流域野生翹嘴鱖的微衛(wèi)星標(biāo)記方法，包括翹嘴鱖基因組DNA的提取、DNA片段擴(kuò)增、PCR產(chǎn)物的電泳及銀染色等步驟，如樣品在靠近標(biāo)準(zhǔn)圖譜230bp位置擴(kuò)增出1條或2條特異性DNA條帶，則鑒定為是黑龍江野生翹嘴鱖群體；如樣品在靠近標(biāo)準(zhǔn)圖譜80bp位置擴(kuò)增出1條特異性條帶，則鑒定為是其他野生翹嘴鱖群體。本發(fā)明操作簡(jiǎn)單快捷，能夠提高對(duì)黑龍江流域野生翹嘴鱖鑒定的效率和準(zhǔn)確性，從而對(duì)該流域的野生翹嘴鱖群體的種質(zhì)資源保護(hù)具有重要意義。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK103255219SQ20131014534
公開(kāi)日2013年8月21日 申請(qǐng)日期2013年4月24日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月24日
發(fā)明者梁旭方, 鄭荷子, 楊敏, 田昌緒, 趙程, 竇亞琪 申請(qǐng)人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)