專利名稱：一種單個核細胞和細胞因子體外濃集試劑盒及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種人體骨髓、外周血或臍帶血中單個核細胞和細胞因子體外分離試劑盒及其應(yīng)用方法。
背景技術(shù)：
血液(包括臍帶血和外周血)和骨髓中含有豐富的細胞因子、干細胞/祖細胞和成熟細胞，成熟的細胞包括紅細胞、白細胞、血小板等。細胞因子主要存在于血漿及血小板中，通過富集可制備成富血小板血漿。干細胞/祖細胞為單個核細胞，因表面抗原的不同可分為一百多種。白細胞通常稱為免疫細胞，是人體免疫系統(tǒng)的重要組成部分。白細胞可分為單個核白細胞和多個核白細胞，干細胞/祖細胞和白細胞中的單個核細胞的密度接近，通過一定的方法可將其分離出來。分離這些成分可診斷和治療不同的疾病，因此具有重大意義。專利200610106875.5，一種有核細胞體外分離試劑盒及其應(yīng)用方法，采用目前國際國內(nèi)從血液和骨髓中分離單個核細胞最普遍的方法——密度梯度離心法，該法操作簡單、造價低廉、易于推廣且純度高。但缺點在于:第一、操作時間比較長，完成整個分離過程需2-3個小時；第二、需要人為界定單個核細胞層的位置，容易引起其他成熟細胞的殘留；第三，分離液可能對人體產(chǎn)生影響。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是提供一種從血液(外周血或臍帶血)和骨髓中分離單個核細胞或富含細胞因子的血漿體外分離試劑盒 ，該技術(shù)具有操作時間縮短、不需要人為界定單個核細胞層位置且對人體無影響、易于推廣等特點。本發(fā)明采用的技術(shù)方案是:本發(fā)明提供一種單個核細胞和細胞因子體外濃集試劑盒，所述試劑盒中包含有血液抗凝劑、泛影酸鈉-聚蔗糖400#、隔離膠和細胞保養(yǎng)液，各試劑獨立分開保存；所述隔離膠為聚丙烯酸丁酯與二氧化硅的混合物(不需要添加溶劑溶解)，所述混合物中聚丙烯酸丁酯質(zhì)量終濃度為71.8 75.0% (優(yōu)選71.8%)，即密度1.065 1.077g/ml的聚丙烯酸丁酯和二氧化硅的混合物。進一步，所述單個核細胞和細胞因子體外濃集試劑盒中，每30ml待分離血液中，血液抗凝劑的用量為2.4 3.0ml (優(yōu)選3.0ml)，泛影酸鈉-聚蔗糖400#的用量為6.0
7.5ml (優(yōu)選7.5ml)，隔離膠的用量為10 12g (優(yōu)選IOgX進一步，每30ml待分離血液中，細胞保養(yǎng)液為8 25ml (優(yōu)選10ml)。本發(fā)明所述的聚丙烯酸丁酯分子量優(yōu)選為9X103 1X104’，更優(yōu)選聚丙烯酸丁酯分子量9.59X 103。進一步,所述血液抗凝劑為質(zhì)量濃度2.58%的枸櫞酸鈉水溶液,所述枸櫞酸鈉水溶液pH為6.5 8.5。
進一步，所述泛影酸鈉-聚蔗糖400#泛影酸鈉與聚蔗糖400#的混合水溶液，所述混合水溶液中泛影酸鈉質(zhì)量終濃度4.2 6.5%，聚蔗糖400#質(zhì)量終濃度為9.0%，所述混合水溶液pH為8.8 9.0 (泛影酸鈉與聚蔗糖400#混合水溶液的自然pH，無需調(diào)節(jié))，溶劑為水。進一步，所述細胞保養(yǎng)液為pH為7.2 7.4的磷酸緩沖液。本發(fā)明還提供一種所述單個核細胞和細胞因子體外濃集試劑盒的應(yīng)用方法，所述方法為:無菌條件下采集骨髓、外周血或臍帶血并加入血液抗凝劑形成抗凝血；將隔離膠與泛影酸鈉_聚鹿糖400#混合后在1800g 2300g下離心3 5min(優(yōu)選1800g,5min)以致形成泛影酸鈉-聚蔗糖400#位于下層而隔離膠位于上層的分離體系，然后將抗凝血轉(zhuǎn)移至分離體系內(nèi)，在1200g 1800g下離心10 20min(優(yōu)選1500g, 15min);吸取隔離膠以上部分液體，在300g 400g下離心3 6min,(優(yōu)選350g, 5min),獲得上清液a和沉淀a,取上清液a再在800g IOOOg下離心6 IOmin (優(yōu)選860g, 8min),取上清液b即可獲得富含細胞因子的血漿(即富血小板血漿)，取沉淀a用細胞保養(yǎng)液洗滌I次后，可獲得單個核細胞；所述每30ml骨髓、外周血或臍帶血中，血液抗凝劑的用量為抗凝劑的用量為2.4-3.0ml(優(yōu)選3.0ml)，泛影酸鈉-聚蔗糖400#的用量為6.0-7.5ml (優(yōu)選7.5ml),隔離膠的用量為10-12g (優(yōu)選10g)，細胞保養(yǎng)液的用量為8 25ml (優(yōu)選10ml)。本發(fā)明中的試劑和膠均為無菌產(chǎn)品，在局部百級生物安全柜中進行無菌操作獲得的富血小板血漿或單個核細胞可安全使用。本發(fā)明所述試劑盒內(nèi)抗凝劑、泛影酸鈉-聚蔗糖400#、隔離膠和細胞保養(yǎng)液的內(nèi)毒素含量均< 0.5EU/ml。本發(fā)明所述聚蔗糖400#是一種合成水溶性高聚物，分子量為400000，聚丙烯酸丁酯為一種高分子化合物，分子量為9 X IO3-1 X IO4 (優(yōu)選9.59X 103)。本發(fā)明所述上清液a和上清液b均為上清液，為便于區(qū)分不同步驟獲得的上清液不同而命名，所述沉淀a為沉淀，為便于區(qū)分不同步驟獲得的沉淀不同而命名，字母本身沒有含義。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在:本發(fā)明中的隔離膠可將血液中紅細胞和泛影酸鈉-聚蔗糖400#與單個核細胞層物理性隔開，不需要人為界定其分界面；本發(fā)明只需兩次離心即可獲得單個核細胞和富含細胞因子的血漿，且單個核細胞回收率
85%)，細胞存活率> 95%，細胞因子濃縮倍數(shù)> 6倍，簡化了操作步驟，縮短了操作時間，整個過程只需I小時，國內(nèi)市場上的產(chǎn)品(如寧夏中聯(lián)達公司骨髓、臍帶血有核細胞體外分離液)普遍在2.5-3小時；本發(fā)明的試劑盒可工業(yè)化生產(chǎn)，易于推廣，能成為醫(yī)生易施行的治療方法的有效工具。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進行進一步描述，但本發(fā)明的保護范圍并不僅限于此:本發(fā)明所述聚丙烯 酸丁酯的分子量9.59X IO3,聚鹿糖400#的分子量4000,購自武漢賽沃爾化工有限公司。實施例1:試劑盒組成:
1、血液抗凝劑:2.58wt%的枸櫞酸鈉水溶液，溶液pH為6.5 ;2、泛影酸鈉-聚蔗糖400#:質(zhì)量終濃度4.2%泛影酸鈉和質(zhì)量終濃度9%的聚蔗糖400# (分子量4000，購自武漢賽沃爾化工有限公司)組成的混合水溶液，混合水溶液pH為
8.8 ；3、細胞保養(yǎng)液:磷酸緩沖液(PBS)，pH為7.2 ;上述三種液體配置后經(jīng)過濾除菌，灌裝于醫(yī)用西林瓶中，經(jīng)過121°C，20分鐘滅菌后分別存放在試劑盒中，且三種液體內(nèi)毒素含量均< 0.5EU/ml。4、隔離膠:71.8wt%的聚丙烯酸丁酯(分子量9.59 X IO3)和28.2wt%的二氧化硅混合物，其密度為1.065g/ml ；上述隔離膠灌裝于醫(yī)用一次性注射器中，經(jīng)輻照滅菌(25kGray鈷-60 y射線照射)后存放于試劑盒中，內(nèi)毒素含量均彡0.5EU/ml。使用所述的單個核細胞和細胞因子體外濃集試劑盒制備富含細胞因子血漿(即富血小板血漿)及單個核細胞的方法，包括以下步驟:I)無菌條件下采集骨髓、外周血或臍帶血30ml (含血液抗凝劑3ml)，形成抗凝血30ml ；2)將12g隔離膠推入50ml無菌離心管，加入泛影酸鈉-聚蔗糖400#7.5ml，離心(2000g,4min),以致形成泛影酸鈉-聚蔗糖400#位于下層而隔離膠位于上層的分離體系；3)然后將30ml抗凝后的骨髓、外周`血或臍帶血轉(zhuǎn)移至步驟2 )50ml無菌離心管內(nèi)，離心(1200g, 20min)；4)吸取隔離膠以上部分液體至新的15ml無菌離心管，離心(300g，6min)，獲得上清液a和沉淀a ；5)將上清液a轉(zhuǎn)移至血清管，離心(800g，10min)，取上清液b即可獲得富含細胞因子的血漿，即富血小板血漿，濃縮倍數(shù)為6-8倍。濃縮倍數(shù)檢測:(1)取濃縮前的血樣，用血細胞分析儀檢測血小板的濃度(A)；
(2)取濃縮后的血樣，用血細胞分析儀檢測血小板的濃度(B) ;(3)濃縮倍數(shù)=B/A (參考文獻:Elizaveta, Platelet-rich plasma:1ntra-articular knee injections producedfavorable results on degenerative cartilage lesions,knee surg sports traumatolarthrosc, 2010, 18，472-479 ;趙強，自制富血小板血漿治療難治性創(chuàng)口，華西醫(yī)學(xué)，2010，25(8)1457-1458)。6)取沉淀a用細胞保養(yǎng)液IOml洗滌I次后，可獲得單個核細胞，回收率> 85%，細胞存活率> 95%。細胞回收率檢測:(I)取分離細胞前的血樣，用血細胞分析儀或顯微鏡手工計算單個核細胞的濃度，根據(jù)分離前的細胞總體積計算出單個核細胞的總數(shù)(A) ；(2)取細胞分離后的血樣，用血細胞分析儀或顯微鏡手工計算單個核細胞的濃度，根據(jù)分離前的細胞懸液的總體積計算出單個核細胞的總數(shù)(B); (3)回收率=B/AX100%。(參考文獻:王寧，安貴林，魏侃等，骨髓經(jīng)羥乙基淀粉(!!ES)處理后分離和培養(yǎng)MSCs的初步探討，實用手外科雜志，2006，20 (4)218-219)。細胞存活率檢測:取一滴分離后的細胞懸液，用終濃度4%的臺盼藍染液染色3 5分鐘，普通光學(xué)顯微鏡下，計數(shù)未被染成藍色的細胞占總細胞數(shù)的百分比即為存活細胞的百分比。(參考文獻:王寧，安貴林，魏侃等，骨髓經(jīng)羥乙基淀粉(HES)處理后分離和培養(yǎng)MSCs的初步探討，實用手外科雜志，2006，20 (4) 218-219)。用該試劑盒制備的富血小板血漿可用于治療難愈合或不愈合的皮膚傷口、骨折，和軟組織損傷、疼痛等機體組織的修復(fù)治療，以及有關(guān)研究。制備的單個核細胞可用于干細胞擴增培養(yǎng)和免疫細胞誘導(dǎo)、診斷造血系統(tǒng)疾病、全基因組檢測、抗腫瘤治療和相關(guān)研究
坐寸o實施例2:試劑盒組成: 1、血液抗凝劑:2.58wt%的枸櫞酸鈉水溶液，溶液pH為8.5 ;2、泛影酸鈉-聚蔗糖400#:質(zhì)量終濃度6.2%泛影酸鈉和質(zhì)量終濃度9%的聚蔗糖400#組成的水溶液，水溶液pH為9.0 ;3、細胞保養(yǎng)液:磷酸緩沖液(PBS)，pH為7.4 ;上述三種液體配置后經(jīng)過濾除菌，灌裝于醫(yī)用西林瓶中，經(jīng)過121°C，20分鐘滅菌后分別存放在試劑盒中，且三種液體內(nèi)毒素含量均< 0.5EU/ml。4、隔離膠:75wt%的聚丙烯酸丁酯和25wt%的二氧化硅混合物，其密度為1.Qllg/ml ；上述隔離膠灌裝于醫(yī)用一次性注射器中，經(jīng)輻照滅菌(25kGray鈷-60 y射線照射)后存放于試劑盒中，內(nèi)毒 素含量均彡0.5EU/ml。使用所述的單個核細胞和細胞因子體外濃集試劑盒制備富含細胞因子(即富血小板血漿)及單個核細胞的方法，包括以下步驟:I)無菌條件下采集骨髓、外周血或臍帶血30ml (含血液抗凝劑3ml)形成抗凝血；2)將IOg隔離膠推入50ml無菌離心管，加入泛影酸鈉-聚蔗糖400#6.0ml，離心(1800g，5min)以致形成泛影酸鈉-聚蔗糖400#位于下層而隔離膠位于上層的分離體系；3)然后將30ml抗凝后的骨髓、外周血或臍帶血轉(zhuǎn)移至步驟2)所述50ml無菌離心管內(nèi)，離心(1500g, 15min)；4)吸取隔離膠以上部分液體至新的15ml無菌離心管，離心(350g，5min)，獲得上清液a和沉淀a ；5)將上清液a轉(zhuǎn)移至血清管，離心(860g，8min)，取上清液b即可獲得富含細胞因子的血漿，即富血小板血漿，濃縮倍數(shù)為6-8倍(方法同實施例1)。6)將沉淀a用IOml細胞保養(yǎng)液清洗I次，即可獲得單個核細胞沉淀備用，回收率彡85% (方法同實施例1)，細胞存活率彡95% (方法同實施例1)。用該試劑盒制備的富血小板血漿可用于治療難愈合或不愈合的皮膚傷口、骨折，和軟組織損傷、疼痛等機體組織的修復(fù)治療，以及有關(guān)研究。制備的單個核細胞可用于干細胞擴增培養(yǎng)和免疫細胞誘導(dǎo)、診斷造血系統(tǒng)疾病、全基因組檢測、抗腫瘤治療和相關(guān)研究
坐寸o實施例3:試劑盒組成:1、血液抗凝劑:2.58wt%的枸櫞酸鈉水溶液，溶液pH為7.2 ;2、泛影酸鈉-聚蔗糖400#:質(zhì)量終濃度5.7%泛影酸鈉和質(zhì)量終濃度9%的聚蔗糖400#組成的混合水溶液，水溶液pH為8.9 ;3、細胞保養(yǎng)液:磷酸緩沖液(PBS)，pH為7.3 ;上述三種液體配置后經(jīng)過濾除菌，灌裝于醫(yī)用西林瓶中，經(jīng)過121°C，20分鐘滅菌后分別存放在試劑盒中，且三種液體內(nèi)毒素含量均< 0.5EU/ml。4、隔離膠:73.2wt%的聚丙烯酸丁酯和26.8wt%的二氧化硅混合物，其密度為1.070g/ml ；上述隔離膠灌裝于醫(yī)用一次性注射器中，經(jīng)輻照滅菌(25kGray鈷-60 y射線照射)后存放于試劑盒中，內(nèi)毒 素含量均彡0.5EU/ml。使用所述的單個核細胞和細胞因子體外濃集試劑盒制備富細胞因子血漿及單個核細胞的方法，包括以下步驟:I)無菌條件下采集骨髓、外周血或臍帶血30ml (含血液抗凝劑2.8ml)形成抗凝血；2)將Ilg隔離膠推入50ml無菌離心管，加入泛影酸鈉-聚蔗糖400#6.0ml，離心(2300g,3min)以致形成泛影酸鈉-聚蔗糖400#位于下層而隔離膠位于上層的分離體系；3)然后將30ml抗凝后的骨髓、外周血或臍帶血轉(zhuǎn)移至步驟2)所述50ml無菌離心管內(nèi)，離心(1800g, IOmin)；4)吸取隔離膠以上部分液體至新的15ml無菌離心管，離心(400g，3min)，獲得上清液a和沉淀a ；5)將上清液a轉(zhuǎn)移至血 清管，離心(1000g，6min)，取上清液b即可獲得富含細胞因子的血漿，即富血小板血漿，濃縮倍數(shù)為6-8倍(方法同實施例1)。6)將沉淀a用IOml細胞保養(yǎng)液清洗I次，即可獲得單個核細胞沉淀備用，回收率≥85% (方法同實施例1)，細胞存活率≥95% (方法同實施例1)。用該試劑盒制備的單個核細胞可用于干細胞擴增培養(yǎng)和免疫細胞誘導(dǎo)、診斷造血系統(tǒng)疾病、全基因組檢測、抗腫瘤治療和相關(guān)研究等。
權(quán)利要求
1.一種單個核細胞和細胞因子體外濃集試劑盒，其特征在于所述試劑盒中包含有血液抗凝劑、泛影酸鈉-聚蔗糖400#、隔離膠和細胞保養(yǎng)液，各試劑獨立分開保存；所述隔離膠為聚丙烯酸丁酯與二氧化硅的混合物，所述混合物中聚丙烯酸丁酯質(zhì)量終濃度為71.8 75.0%。
2.如權(quán)利要求1所述單個核細胞和細胞因子體外濃集試劑盒，其特征在于每30ml待分離血液中，血液抗凝劑的用量為2.4 3.0ml，泛影酸鈉-聚蔗糖400#的用量為6.0 7.5ml，隔離膠的用量為10 12g。
3.如權(quán)利要求1所述單個核細胞和細胞因子體外濃集試劑盒，其特征在于每30ml待分離血液中，細胞保養(yǎng)液的用量為8 25ml。
4.如權(quán)利要求1所述單個核細胞和細胞因子體外濃集試劑盒，其特征在于所述的聚丙烯酸丁酯分子量為9 X IO3 1X104。
5.如權(quán)利要求1所述單個核細胞和細胞因子體外濃集試劑盒，其特征在于所述血液抗凝劑為質(zhì)量濃度2.58%的枸櫞酸鈉水溶液，所述枸櫞酸鈉水溶液pH為6.5 8.5。
6.如權(quán)利要求1所述單個核細胞和細胞因子體外濃集試劑盒，其特征在于所述泛影酸鈉-聚蔗糖400#為泛影酸鈉與聚蔗糖400#的混合水溶液，所述混合水溶液中泛影酸鈉質(zhì)量終濃度為4.2 6.5%，聚蔗糖400#質(zhì)量終濃度為9.0%，溶劑為水。
7.如權(quán)利要求1所述單個核細胞和細胞因子體外濃集試劑盒，其特征在于所述細胞保養(yǎng)液為pH為7.2 7.4的磷酸緩沖液。
8.—種權(quán)利要求1所述單個核細胞和細胞因子體外濃集試劑盒的應(yīng)用方法，其特征在于所述方法為:無菌條件下采集骨髓、外周血或臍帶血并加入血液抗凝劑形成抗凝血；將隔離膠與泛影酸鈉-聚蔗糖400#混合后在ISOOg 2300g下離心3 5min以致形成泛影酸鈉-聚蔗糖400#位于下層 而隔離膠位于上層的分離體系，然后將抗凝血轉(zhuǎn)移至分離體系內(nèi)，在1200g 1800g下離心10 20min ;吸取隔離膠以上部分液體，在300g 400g下離心3 6min,獲得上清液a和沉淀a,取上清液a再在800g IOOOg下離心6 IOmin,取上清液b即可獲得富含細胞因子的血漿，取沉淀a用細胞保養(yǎng)液洗滌I次后，可獲得單個核細胞；所述每30ml骨髓、外周血或臍帶血中，血液抗凝劑的用量為2.4 3.0ml，泛影酸鈉-聚蔗糖400#的用量為6.0 7.5ml，隔離膠的用量為10 12g，細胞保養(yǎng)液的用量為8 25ml o
全文摘要
本發(fā)明公開了一種單個核細胞和細胞因子體外濃集試劑盒，所述試劑盒中包含有抗凝劑、泛影酸鈉-聚蔗糖400#、隔離膠和細胞保養(yǎng)液，各試劑獨立分開保存；所述隔離膠為聚丙烯酸丁酯與二氧化硅的混合物，所述混合物中聚丙烯酸酯質(zhì)量終濃度為71.8～75.0%；本發(fā)明只需兩次離心即可獲得單個核細胞或富細胞因子的血漿，且回收率高，簡化了操作步驟，縮短了操作時間；本發(fā)明的試劑盒可工業(yè)化生產(chǎn)，易于推廣，能成為醫(yī)生易施行的治療方法的有效工具。
文檔編號C12N5/078GK103194427SQ20131014298
公開日2013年7月10日 申請日期2013年4月23日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月23日
發(fā)明者鮑柳君, 吳諍 申請人:浙江星月生物科技股份有限公司