專利名稱：靶向人egfr的基因工程化淋巴細(xì)胞及其制備方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體涉及抗EGFR的嵌合抗原受體和能表達(dá)該抗原受體的淋巴細(xì)胞。
背景技術(shù)：
表皮生長因子受體(EGFR)是ー種具有酪氨酸激酶活性的膜表面受體，在細(xì)胞許多生理過程中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用[1，2]。EGFR在結(jié)構(gòu)上由胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)3個(gè)部分組成，其中胞外區(qū)具有兩個(gè)半胱氨酸豐富區(qū)，胞內(nèi)區(qū)具有典型的ATP結(jié)合位點(diǎn)和酪氨酸激酶區(qū)。EGFR在許多惡性腫瘤細(xì)胞表面均高表達(dá)[3]，其中包括表皮鱗癌、乳腺癌、卵巢癌、非小細(xì)胞肺癌、腎癌及頭頸部惡性腫瘤等。通常情況下，EGFR酪氨酸激酶以單體形式存在，當(dāng)特異性的配體和EGFR受體結(jié)合后，引起受體由失活的單體狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榧せ畹磨司刍癄顟B(tài)，進(jìn)而激活胞內(nèi)內(nèi)在的酪氨酸激酶，其胞內(nèi)段的酪氨酸殘基被自磷酸化或交叉磷酸化，引起下游PI3K-AKT、MAPK-ERK等信號(hào)通路的激活，其介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在腫瘤細(xì)胞的增殖、損傷修復(fù)、侵襲及新生血管形成等方面起重要作用，已有眾多的研究結(jié)果證實(shí)EGFR是具有良好應(yīng)用前景的惡性腫瘤治療的靶點(diǎn)[4-6]。近年來，靶向EGFR家族的抗腫瘤藥物研發(fā)已經(jīng)成為ー個(gè)熱點(diǎn)。目前對(duì)EGFR的抑制主要有兩類藥物:一類為小分子酪氨酸激酶抑制劑，以吉非替尼和厄洛替尼為代表，這些小分子藥物在臨床上取得了較好的效果。雖然這些小分子靶向抗腫瘤藥物沒有化療藥物的細(xì)胞毒作用，但是其也存在著突出的耐藥問題和脫靶效應(yīng)等不良反應(yīng)，長期應(yīng)用甚至可以對(duì)機(jī)體造成明顯的影響。另ー類為單克隆抗體，針對(duì)EGFR的抗體類藥物也有三種在中國上市:西妥昔單抗、帕尼單抗和尼妥珠單抗，這些藥物已在結(jié)腸癌、鼻咽癌等實(shí)體瘤的治療中取得了較好的療效，但是由于單抗的分子量比較大，導(dǎo)致其對(duì)實(shí)體瘤的穿透性比較差，在血中容易被清除，導(dǎo)致其療效受到一定限制；另外，單抗的價(jià)格對(duì)普通病人來說非常昂貴，進(jìn)一歩限制了其在臨床上大量、廣泛的應(yīng)用。如何能在保持藥物特異靶向性的同時(shí)，有效地降低其毒副作用？研究者們對(duì)此進(jìn)行了多方面的探索。過繼免疫治療是通過給荷瘤機(jī)體輸注抗腫瘤免疫效應(yīng)細(xì)胞，使受體獲得或增強(qiáng)抗腫瘤應(yīng)答反應(yīng)來殺傷腫瘤的治療方法。目前在臨床上腫瘤過激免疫治療主要采用兩類淋巴細(xì)胞:ー類效應(yīng)細(xì)胞為腫瘤抗原特異性T淋巴細(xì)胞，包括腫瘤浸潤性淋巴細(xì)胞和細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞，選取這兩種T淋巴細(xì)胞的優(yōu)點(diǎn)在于，它們均已被腫瘤抗原激活，可以識(shí)別自身MHC (主要組織相容性復(fù)合物)類分子抗原復(fù)合物，具有高度特異性的殺傷性能，在臨床上顯示出了明顯的療效；另外培養(yǎng)獲得的細(xì)胞未經(jīng)任何轉(zhuǎn)基因修飾，安全性也比較高。其缺點(diǎn)在于體外培養(yǎng)技術(shù)體系較為復(fù)雜，細(xì)胞培養(yǎng)擴(kuò)增速度較慢，細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)周期較長，培養(yǎng)成功率比較低[7，8]。另外ー類包括淋巴細(xì)胞因子激活的殺傷細(xì)胞LAK和細(xì)胞因子刺激的殺傷細(xì)胞CIK，這類細(xì)胞是從外周血中分 后經(jīng)過淋巴因子或細(xì)胞因子誘導(dǎo)刺激獲得的，其殺傷機(jī)理是通過非MHC依賴的方式發(fā)揮抗腫瘤作用。LAK對(duì)靶細(xì)胞的殺傷沒有MHC的限制，但其在體外擴(kuò)增的能力較低而且體內(nèi)殺瘤活性也不高，另外該療法在臨床應(yīng)用上要使用大劑量IL-2，常常導(dǎo)致出現(xiàn)比較大副作用[9，10]。目前的CIK細(xì)胞治療技術(shù)條件已比較成熟，國內(nèi)有多家醫(yī)院以開展了 CIK的臨床治療，并取得了不錯(cuò)的療效[11，12]。但是CIK細(xì)胞中含有的一些具有腫瘤特異性的淋巴細(xì)胞并不能被特異的大量擴(kuò)增，所以CIK所面臨的突出問題就是其沒有腫瘤特異殺傷作用。伴隨著近代生物技術(shù)的迅猛發(fā)展尤其是基因工程技術(shù)的成熟，細(xì)胞過繼免疫治療迎來了新的發(fā)展契機(jī)。EshharZ.研究小組利用基因工程技術(shù)于上世紀(jì)八十年代末首先提出了克服上述缺陷的方法:嵌合性T淋巴細(xì)胞受體(CAR)技術(shù)，這將單抗的特異性與細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞的高效性有機(jī)地融為了一體；與天然的TCR (T細(xì)胞受體)相比，CAR的最大優(yōu)點(diǎn)是與抗原結(jié)合時(shí)可以不受MHC的限制。將CAR基因轉(zhuǎn)染入T淋巴細(xì)胞中，可以賦予非特異性的淋巴細(xì)胞特異識(shí)別腫瘤抗原并祀向殺傷腫瘤細(xì)胞的能力，并可讓該細(xì)胞在受到相應(yīng)抗原刺激時(shí)釋放細(xì)胞因子、表現(xiàn)出細(xì)胞殺傷活性[13，14]。CAR—般由胞外結(jié)合區(qū)(來源于單克隆抗體的scFv)、免疫球蛋白恒定區(qū)(IgGFe)、跨膜區(qū)域(TM)和細(xì)胞 內(nèi)信號(hào)域(SD)等部分組成。scFv負(fù)責(zé)腫瘤特異抗原的特異識(shí)別；IgG Fe使得ScFv保持一個(gè)天然的空間構(gòu)象，更有效的識(shí)別抗原，并介導(dǎo)CAR的二聚化作用；TM的作用是將CAR錨定在細(xì)胞膜上；胞內(nèi)信號(hào)域的功能是在CAR結(jié)合腫瘤抗原后，激活胞內(nèi)信號(hào)通路，活化淋巴細(xì)胞，從而產(chǎn)生針對(duì)CAR所識(shí)別的腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性。近來，經(jīng)過CAR基因修飾的淋巴細(xì)胞在淋巴瘤[15，16]、神經(jīng)母細(xì)胞瘤[17]和轉(zhuǎn)移性腎癌[18]等多種腫瘤的臨床治療上取得較好的療效。目前還沒有使用EGFR靶向嵌合抗原受體技術(shù)改造的淋巴細(xì)胞治療腫瘤技術(shù)方案的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為抗腫瘤技術(shù)領(lǐng)域提供一種新的有效選擇。本發(fā)明首先提供了靶向EGFR單鏈抗體，該單鏈抗體是通過串聯(lián)靶向EGFR的抗體輕鏈和重鏈可變區(qū)獲得。進(jìn)一步的，所述的單鏈抗體，的氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。本發(fā)明還提供了編碼所述的嵌合抗原受體的基因，其核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。本發(fā)明還提供了一種嵌合抗原受體，該嵌合抗原受體是通過氮端到碳端順次拼接hIL-2信號(hào)肽、所述的靶向EGFR的單鏈抗體、IgG2-Fc、⑶28跨膜區(qū)和⑶3 ζ鏈，所得到的嵌合抗原受體的結(jié)構(gòu)為 ant1-EGFR(scFv)-1gG2(Fc)-CD28-CD3 ζ。進(jìn)一步的，所述的嵌合抗原受體的氨基酸序列如SEQ ID N0.4所示。本發(fā)明還提供了編碼所述的嵌合抗原受體的基因，其核苷酸序列SEQ ID N0.3所
/Jn ο本發(fā)明還提供了表達(dá)載體，含有并能表達(dá)氨基酸序列為SEQ ID N0.3所示的嵌合抗原受體的編碼基因。進(jìn)一步的，所述的表達(dá)載體為pmaxCloning質(zhì)粒載體。本發(fā)明還提供了含所述的表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。進(jìn)一步的，所述宿主細(xì)胞為淋巴細(xì)胞。
本發(fā)明還提供了所述的宿主細(xì)胞在制備抗腫瘤藥物中的用途。本發(fā)明還提供了制備所述的宿主細(xì)胞的方法:將所述的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染進(jìn)淋巴細(xì)胞，從而獲得能表達(dá)嵌合抗原受體的基因工程化的淋巴細(xì)胞。本發(fā)明還提供了抗腫瘤藥物，是由的宿主細(xì)胞作為主要活性成分制備而成的。本發(fā)明的有益成果:本發(fā)明創(chuàng)造性地利用通過核糖體展示技術(shù)得到的具有高親和力與特異性的抗EGFR的scFv片段新設(shè)計(jì)得到了ー種嵌合性抗原受體。將該嵌合抗原受體轉(zhuǎn)入非病毒載體，通過核轉(zhuǎn)染技術(shù)實(shí)現(xiàn)了 CAR在人淋巴細(xì)胞表面的高效表達(dá)，將非特異性的淋巴細(xì)胞定向改造為能夠識(shí)別人EGFR從而介導(dǎo)對(duì)過表達(dá)EGFR的腫瘤細(xì)胞進(jìn)行靶向殺傷的特異性淋巴細(xì)胞。其中特別優(yōu)選的抗EGFR的單鏈抗體可以使得嵌合性抗原受體更好地發(fā)揮作用。EGFR靶向嵌合抗原受體修飾的淋巴細(xì)胞在特異識(shí)別過表達(dá)EGFR的腫瘤細(xì)胞后，可以通過細(xì)胞因子的釋放及CTL效應(yīng)發(fā)揮抗腫瘤作用；其在體內(nèi)可以顯著抑制腫瘤的腫瘤形成、腫瘤生長及肺部轉(zhuǎn)移，且沒有明顯的毒副作用。本發(fā)明設(shè)計(jì)了ー種新的基因工程化的淋巴細(xì)胞，提供了一種新的安全、有效的腫瘤治療治療方案。


圖1為嵌合抗原受體基因表達(dá)檢測。ー抗為ant1-EGFR scFv的兔抗血清。ニ抗為FITC標(biāo)記的羊抗兔IgG。Mock:未加質(zhì)粒，但核轉(zhuǎn)染的淋巴細(xì)胞；Vehicle:核轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒的淋巴細(xì)胞；C，CAR:核轉(zhuǎn)染嵌合抗原受體基因質(zhì)粒的淋巴細(xì)胞。圖2為嵌合抗原受體基因轉(zhuǎn)染后淋巴細(xì)胞腫瘤殺傷活性檢測。A431細(xì)胞為EGFR過表達(dá)細(xì)胞，A2780細(xì)胞為EGFR陰性細(xì)胞。圖3為 CAR基因修飾淋巴細(xì)胞對(duì)A549皮下成瘤性的影響。NS:未加淋巴細(xì)胞，只接種腫瘤；Mock:未加質(zhì)粒,但核轉(zhuǎn)染的淋巴細(xì)胞；Vehicle:核轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒的淋巴細(xì)胞；C，CAR:核轉(zhuǎn)染嵌合抗原受體基因質(zhì)粒的淋巴細(xì)胞。圖中所述的各類淋巴細(xì)胞與A549細(xì)胞共同接種N0D/SCID小鼠。縱坐標(biāo)為未成瘤小鼠所占百分比，橫坐標(biāo)為接種后的時(shí)間(天)。圖4為CAR基因修飾淋巴細(xì)胞對(duì)A431和A2780皮下瘤生長的影響。NS:生理鹽水處理組；Mock:未加質(zhì)粒、但核轉(zhuǎn)染的淋巴細(xì)胞處理組；Vehicle:核轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒的淋巴細(xì)胞處理組；C，CAR:核轉(zhuǎn)染嵌合抗原受體基因質(zhì)粒的淋巴細(xì)胞處理組?？v坐標(biāo)為成瘤小鼠腫瘤體積，橫坐標(biāo)為接種后的時(shí)間(天)。圖5為CAR基因修飾淋巴細(xì)胞對(duì)A549腫瘤肺轉(zhuǎn)移的影響。NS:生理鹽水處理組；Mock:未加質(zhì)粒、但核轉(zhuǎn)染的淋巴細(xì)胞處理組；Vehicle:核轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒的淋巴細(xì)胞處理組；C，CAR:核轉(zhuǎn)染嵌合抗原受體基因質(zhì)粒的淋巴細(xì)胞處理組?？v坐標(biāo)為成瘤小鼠生存率，橫坐標(biāo)為接種后的時(shí)間(天)。圖6為A549腫瘤肺轉(zhuǎn)移小鼠治療后谷丙轉(zhuǎn)氨酶(Alanine Transaminase, ALT)和谷草轉(zhuǎn)氨酶(Aspartate Transaminase, AST)表達(dá)水平檢測。小鼠分組與圖5相同。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明提供了一種嵌合抗原受體(CAR)重組基因及其設(shè)計(jì)方式，該嵌合抗原受體可以靶向EGFR。其具體設(shè)計(jì)方式為通過氮端到碳端順次拼接hIL-2信號(hào)肽、本發(fā)明所提供抗EGFR的單鏈抗體(scFv)、IgG2-Fc、⑶28TM-⑶3 ^，所得到的嵌合抗原受體的結(jié)構(gòu)為ant1-EGFR(scFv)-1gG2(Fc)-CD28TM-CD3 し氨基酸序列見 SEQ ID N0.4。本發(fā)明所提供的CAR的設(shè)計(jì)方式是經(jīng)過多次摸索后優(yōu)化所得，組成嵌合抗原受體的每個(gè)片段均發(fā)揮著不同的功能:hIL-2信號(hào)肽可以在CAR其他組件表達(dá)后將其分泌到胞外；scFv具有特異靶向結(jié)合EGFR的作用；IgG2-Fc為scFv正確構(gòu)象的伸展提供合適的空間；CD28跨膜區(qū)將CAR錨定在細(xì)胞膜上；CD3(鏈可以在scFv結(jié)合抗原后激活胞內(nèi)信號(hào)，活化淋巴細(xì)胞。本發(fā)明中CAR核轉(zhuǎn)染淋巴細(xì)胞的條件也是經(jīng)過多次摸索后得到的，從而高效的將抗EGFR嵌合抗原受體基因轉(zhuǎn)染入淋巴細(xì)胞，并使其在淋巴細(xì)胞的細(xì)胞膜上正確表達(dá)，成功的將非特異性的淋巴細(xì)胞定向改造成為能夠識(shí)別人EGFR從而介導(dǎo)對(duì)高表達(dá)EGFR的細(xì)胞進(jìn)行靶向殺傷的特異性的淋巴細(xì)胞。本發(fā)明的基因工程花淋巴細(xì)胞在體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中均顯示出顯著的抗腫瘤作用，其可以作為抗腫瘤藥物使用，具有很好的應(yīng)用前景。實(shí)施例一 EGFR靶向CAR全長基因的獲得及表達(dá)質(zhì)粒載體的構(gòu)建I實(shí)驗(yàn)路線CAR 基因由 SP hIL-2、識(shí)另Ij EGFR 的 scFv、IgG2_Fc、CD28TM-CD3 ^ 構(gòu)成。其中 SPhIL-2序列通過引物合成的方式包含在上游擴(kuò)增引物中；EGFR靶向scFv序列為從抗EGFR雜交瘤細(xì)胞擴(kuò)增即核糖體展示技術(shù)優(yōu)化后所得，具體步驟如下:制備抗EGFR雜交瘤細(xì)胞，提取總RNA，然后用RT-PCR的方式分別擴(kuò)增出抗EGFR的重、輕鏈基因，送至Invitrogen公司進(jìn)行測序。測序結(jié)果利用Jellyfish軟件分析，對(duì)可以正確翻譯的序列再通過VBASE2和GeneBank進(jìn)行序列對(duì)比，并由核糖體展示技術(shù)對(duì)其特異性和親和カ進(jìn)行進(jìn)化，所得到的具有高親和カ的抗EGFR單鏈抗體的編碼基因(氨基酸序列見SEQ ID N0.2)。通過設(shè)計(jì)并合成引物，分別擴(kuò)增得到scFv的基因序列、IgG2Fc段(氨基酸序列見SEQ IDN0.6)和⑶28TM-⑶3(基因序列(通過RT-PCR從人外周血單核細(xì)胞中獲得，氨基酸序列見SEQ ID N0.8)。三個(gè)片段經(jīng)過PCR反應(yīng)之后，再利用重疊PCR程序?qū)⑷齻€(gè)片段連接。實(shí)驗(yàn)具體方案如下:I)引物設(shè)計(jì)(I)擴(kuò)增scFv的引物:上游引物(Fl):SEQ ID N0.95 -GTGCTAGCTAGCATGTACAGGATGCA ACTCCTGTCTTGCATTGCACTA AGTCTTGCACT。此為擴(kuò)增hIL-2信號(hào)肽的上游引物，下劃線部分設(shè)計(jì)與hIL-2信號(hào)肽部分片段互補(bǔ)。該引物也引入酶切位點(diǎn)NheI。擴(kuò)增Ant1-EGFR scFv 的上游引物(F2):SEQ ID N0.10 5，-GCACTAAGTCTTGCACTTGTCACGAACTCGGCCCGAGGTTCAGCTTCAGCAGTCTG-3，其中，下劃線部分設(shè)計(jì)與Ant1-EGFR scFv基因片段互補(bǔ)。擴(kuò)增Ant1-EGFR scFv 的下游引物(Rl):SEQ ID N0.115’ -ATGTACAGGATGCAACTCCTGTCTTGCATTGCACTAAGTCTTGCACTTGTCACGAAcTCGGCCCAGATCCAGTTGCTGCAGTCT-3’。其中，下劃線部分設(shè)計(jì)為與IgG2Fc某閔片段互補(bǔ)，以講行重疊PCR。

(2)擴(kuò)增 IgG2Fc 的引物:上游引物(F3):SEQ ID N0.125’ -GGGGACCAAGCTGGAAATAAAACCACCTTGCCCAGCAC-3’。其中，下劃線部分設(shè)計(jì)為與scFv序列互補(bǔ)，以進(jìn)行重疊PCR。下游引物(R2):SEQ ID N0.135’ -ACCACCAGCACCCAAAAGGGAATGGCCCTGATTGTGCTGGGGGG-3’。其中，下劃線部分設(shè)計(jì)與⑶28TM-⑶3ζ序列互補(bǔ)。(3)擴(kuò)增CD28TM-CD3 ζ序列的引物:上游引物(F4):SEQ ID N0.145 -AGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAACCCTTTTGGGTGCTGGTGGTG-3>。下劃線部分與IgG2Fc片段互補(bǔ)。下游引物(R3):SEQ ID N0.155’-CTAGCTAGCTAGGAAGATCTTCTTAGCGAGGGGGC-3’。引入酶切位點(diǎn) Bgl II。2) PCR 反應(yīng)PCR按照TaKaRa公司操作說明進(jìn)行，反應(yīng)體系如下:
I Ox Pyrobest Buffer5 LiL
2.5mM dNTP4 μ
ΙΟμιη Primer (丨..游)I ‘uL
IOum Primer (卜游)I pL
權(quán)利要求
1.靶向EGFR單鏈抗體，其特征在于該單鏈抗體是通過串聯(lián)靶向EGFR的抗體輕鏈和重鏈可變區(qū)獲得。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的單鏈抗體，其特征在于:其氨基酸序列如SEQID N0.2所示。
3.編碼權(quán)利要求2所述的嵌合抗原受體的基因，其特征在于:其核苷酸序列如SEQIDN0.1所示。
4.一種嵌合抗原受體，其特征在于:該嵌合抗原受體是通過氮端到碳端順次拼接hIL-2信號(hào)肽、權(quán)利要求1或2所述的靶向EGFR的單鏈抗體、IgG2_Fc、⑶28跨膜區(qū)和⑶3 ζ鏈，所得到的嵌合抗原受體的結(jié)構(gòu)為ant1-EGFR(scFv)-1gG2(Fc)-CD28-CD3 ζ。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的嵌合抗原受體，其特征在于:其氨基酸序列如SEQID N0.4所/Jn ο
6.編碼權(quán)利要求5所述的嵌合抗原受體的基因，其特征在于:其核苷酸序列SEQIDN0.3所示。
7.表達(dá)載體，含有并能表達(dá)氨基酸序列為SEQID N0.3所示的嵌合抗原受體的編碼基因。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的表達(dá)載體,其特征在于所述的表達(dá)載體為pmaxCloning質(zhì)粒載體。
9.含有權(quán)利要求7或8任一項(xiàng)所述的表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的宿主細(xì)胞，其特征在于:所述宿主細(xì)胞為淋巴細(xì)胞。
11.權(quán)利要求9或10所述的宿主細(xì)胞在制備抗腫瘤藥物中的用途。
12.制備權(quán)利要求9或10所述的宿主細(xì)胞的方法，其特征在于:將權(quán)利要求5 8任一項(xiàng)所述的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染進(jìn)淋巴細(xì)胞，從而獲得能表達(dá)嵌合抗原受體的基因工程化的淋巴細(xì)胞。
13.抗腫瘤藥物，是由權(quán)利要求9或10所述的宿主細(xì)胞作為主要活性成分制備而成的。
全文摘要
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體涉及抗EGFR的嵌合抗原受體和表達(dá)該抗原受體的淋巴細(xì)胞。本發(fā)明要解決的技術(shù)方案為抗腫瘤技術(shù)領(lǐng)域提供了新的有效選擇。本發(fā)明的技術(shù)方案是提供一種靶向EGFR的單鏈抗體。通過基因工程技術(shù)手段將該單鏈抗體進(jìn)一步設(shè)計(jì)構(gòu)建成一種嵌合抗原受體，所得到的嵌合抗原受體的結(jié)構(gòu)為anti-EGFR(scFv)-IgG2(Fc)-CD28-CD3ζ。通過核轉(zhuǎn)染技術(shù)將嵌合抗原受體轉(zhuǎn)染入淋巴細(xì)胞，可以賦予非特異性的淋巴細(xì)胞特異識(shí)別EGFR腫瘤抗原并靶向殺傷EGFR過表達(dá)腫瘤細(xì)胞的能力。該技術(shù)方案將過繼細(xì)胞治療和基因治療有機(jī)結(jié)合，殺傷腫瘤效果明顯，為本領(lǐng)域提供了一種新的有效選擇。
文檔編號(hào)C12N15/11GK103113470SQ20131006176
公開日2013年5月22日 申請(qǐng)日期2013年2月27日 優(yōu)先權(quán)日2013年2月27日
發(fā)明者魏于全, 李炯, 周西坤 申請(qǐng)人:四川大學(xué)