專利名稱：鮸魚熱休克蛋白hsp90基因的熒光定量pcr檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及魚類熱應(yīng)激蛋白功能基因的檢測方法，具體地說，涉及鯢魚熱休克蛋白HSP90基因的熒光定量PCR檢測方法。
背景技術(shù)：
熱休克蛋白(Heat shock proteins, HSPs)又稱熱應(yīng)激蛋白，是所有細(xì)胞能在應(yīng)激情況下由熱休克基因所編碼合成的高度保守的一類蛋白，它們能使細(xì)胞對抗更為嚴(yán)重的應(yīng)激損傷，對維持機(jī)體的穩(wěn)定發(fā)揮著重要作用，已成為當(dāng)今世界生命科學(xué)研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。熱休克蛋白按同源性及分子量大小包括5個主要家族:HSP110、HSP90、HSP70、HSP60和小分子量熱休克蛋白。其中HSP90是近年來被深入并廣泛研究的一種蛋白。它作為蛋白成熟過程中的分子伴侶，可保證蛋白正確構(gòu)象、糾正突變蛋白的錯誤折疊，維持留體激素類受體、激酶、中心體等的結(jié)構(gòu)，參與細(xì)胞周期調(diào)節(jié)、機(jī)體免疫調(diào)節(jié)和信號傳導(dǎo)，從而提高生物體對環(huán)境脅迫或傷害的耐受性，更能適應(yīng)周圍不利的環(huán)境。目前海水養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展面臨的病害問題日趨嚴(yán)重，養(yǎng)殖生態(tài)環(huán)境的破壞，魚類疾病頻繁 暴發(fā)，給魚類養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大經(jīng)濟(jì)損失。雖然抗生素的使用可以一定程度減少細(xì)菌病的暴發(fā)，但過多使用會增加病原菌的抗藥性，藥物殘留亦會造成環(huán)境污染。因此提高魚體自身免疫能力是病害防治的趨勢。熱休克蛋白的產(chǎn)生，體現(xiàn)了生物對環(huán)境的自我主動適應(yīng)能力。因此，利用分子生物學(xué)技術(shù)提高HSP90基因的表達(dá)，增強(qiáng)魚類自身對環(huán)境應(yīng)激的防護(hù)和對不同環(huán)境的適應(yīng)能力。深入開展魚類熱休克蛋白研究，可進(jìn)一步揭示其在生理過程中的作用，以及與其他因素在時空上綜合保護(hù)細(xì)胞和機(jī)體的機(jī)理，其研究成果將在實(shí)踐中對鯢魚養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展起巨大的促進(jìn)作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種鯢魚熱休克蛋白HSP90基因的熒光定量PCR檢測方法。為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明首先提供用于檢測鯢魚熱休克蛋白HSP90基因的熒光定量PCR引物對，其包括:正向引物HSP90-RT-F: 5 ’ -ATGACCAAAGCCGACCTG-3 ’ 和反向引物HSP90-RT-R: 5 ’ -GTGAAAGAACCTCCAGCA-3 ’。本發(fā)明還提供用于檢測鯢魚熱休克蛋白HSP90基因的試劑盒。優(yōu)選地，所述試劑盒還包括dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg2+、PCR反應(yīng)緩沖液中的一種或多種。更優(yōu)選地，所述試劑盒還包括標(biāo)準(zhǔn)陽性模板。本發(fā)明進(jìn)一步提供一種鯢魚熱休克蛋白HSP90基因的熒光定量PCR檢測方法，其是利用所述引物HSP90-RT-F和HSP90-RT-R，或含有該引物對的試劑盒對鯢魚熱休克蛋白HSP90基因進(jìn)行熒光定量PCR檢測。包括以下步驟:I)提取樣品組織中的總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA ；2)以步驟I)中的cDNA為模板，HSP90-RT-F和HSP90-RT-R為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng);3)分析PCR產(chǎn)物。PCR反應(yīng)體系以25 ill計(jì)為:
模板 cDNAIOOng
IOmM dNTPs2ul
I O(JN^1-HSlx)O-RT-FI^il
10|iPvr41.HSP90-RT-RI^il
2U4d/&/DNA 聚合酶UU
IOxPCR反應(yīng)緩沖液2.5叫
CidH2O補(bǔ)足至25叫。PCR反應(yīng)條件為:94°C 5分鐘；94°C 30秒，60°C 30秒，72°C I分鐘，共30個循環(huán)；72 0C 5分鐘。本發(fā)明采用實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)檢測熱休克蛋白HSP90基因在鯢魚的腦、眼球、鰭條、鰓、心臟、小腸、腎臟、肝臟、 肌肉、脾臟中的轉(zhuǎn)錄本水平，結(jié)果表明:在上述十個組織中均能檢測到熱休克蛋白HSP90基因mRNA轉(zhuǎn)錄本的存在，其中在肝中的豐度最高，其次為鰭和腦，而在其他組織中僅檢測到較少量的mRNA轉(zhuǎn)錄本存在。優(yōu)選地，本發(fā)明提供一種檢測鯢魚熱休克蛋白HSP90基因的方法，其中熱休克蛋白HSP90基因在不同組織中的表達(dá)分布進(jìn)行實(shí)時定量檢測，反應(yīng)條件為:在ABI7300實(shí)時熒光定量PCR系統(tǒng)上進(jìn)行反應(yīng)，熒光定量反應(yīng)程序模板設(shè)置為ddCt (RelativeQuantitation) Plate，反應(yīng)循環(huán)參數(shù)設(shè)置為:95°C 20s ；95°C 5s, 60°C 30s，共 40 個循環(huán)，利
用2_AACT法計(jì)算相對表達(dá)量。優(yōu)選地，本發(fā)明的一種檢測鯢魚熱休克蛋白HSP90基因的方法，其中熱休克蛋白HSP90基因在不同組織中的表達(dá)實(shí)時定量檢測，20iiL反應(yīng)體系包括:9iiL SYBR GreenReal-time PCR Master Mixtures、10 y mol/L正向引物HSP90-RT-F和反向引物HSP90-RT-R各I ii L、IOOng的cDNA模板溶液I ii L及超純水8 y L。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn):鯢魚熱休克蛋白HSP90基因的熒光定量PCR檢測方法能夠有效、快速、準(zhǔn)確地檢測到熱休克蛋白HSP90基因在鯢魚各種組織內(nèi)的表達(dá)以及該基因的表達(dá)水平。這種高效檢測方法的建立對于研究鯢魚應(yīng)對外來應(yīng)激反應(yīng)的機(jī)制具有重要的意義，此外，本發(fā)明提供的特異性引物對還可以用于HSP90基因的分子多態(tài)性研究。


圖1為本發(fā)明利用特異性引物HSP90-RT-F和HSP90-RT-R對鯢魚及同科內(nèi)近緣不同物種的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳檢測結(jié)果；其中M =DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)(DL2000)，從上到下條帶依次為2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp和IOObp ;1_6:為不同海域采集的鯢魚樣品；7:皇姑魚；8:大黃魚；9:棘頭梅童魚；10:白姑魚；11:小黃魚；12:黑觸梅童魚；13:美國紅魚；14:皮氏叫姑魚。圖2為本發(fā)明利用特異性引物HSP90-RT-F和HSP90-RT-R對鯢魚不同濃度的cDNA模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增的電泳檢測結(jié)果；其中M =DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)(DL2000)，從上到下條帶依次為 2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp 和 IOObp ;1_10 依次為 10 101° 倍濃度梯度稀釋的cDNA模板擴(kuò)增圖。圖3為本發(fā)明熒光定量PCR檢測熱休克蛋白HSP90基因在鯢魚各組織中的分布及表達(dá)水平。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實(shí)施例均按照常規(guī)實(shí)驗(yàn)條件，如Sambrook等分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(New York:Gold Spring HarborLaboratory Press, 1989),或按照制造廠商說明書建議的條件。實(shí)施例鯢魚熱休克蛋白HSP90基因的熒光定量PCR檢測方法1.1主要材料、試劑和儀器設(shè)備

手術(shù)刀，眼科剪，鑷子，解剖盤，充氧泵，水箱，1.5ml離心管，微量移液器、微量移液器槍頭，一次性培養(yǎng)皿，陶瓷研缽。脫氧核糖核苷酸dNTP，Taq DNA聚合酶，Trizol-A+總RNA提取試劑盒，RealMasterMix (SYBRGreen)試劑，Quant cDNA第一鏈合成試劑盒以及DH5 a感受態(tài)細(xì)胞，小型離心機(jī)(Qspin ，BAYGENE)，渦旋振蕩器(QL-866型，QILINEBEIER)，核酸蛋白儀(SmartSpace Plus, Bio-Rad),超凈工作臺(SW-CJ-1G型，名牌之星)，恒溫培養(yǎng)箱(普斯特)，-80°C超低溫冰箱(Thermo scientific)，熒光定量PCR系統(tǒng)(ABI 7300型)，pH計(jì)(Mettler Toledo320PH Meter)、高壓蒸氣滅菌鍋(SANYO)、高速冷凍離心機(jī)(Centrifuge5417R, eppendorf)、電泳儀(DYY-6C型,北京六一)、水浴鍋(上海精宏)、凝膠成像系統(tǒng)(Bio-RadGD2000)、PCR 儀(ABI Veriti96well Thermal Cycler)、自動測序儀(ABI3730 型)。本實(shí)施例中使用的常規(guī)藥品氯仿(分析純)，異丙醇(分析純)，氯霉素，氯化鈉(分析純)購自國藥集團(tuán)，異丙基硫代-D-半乳糖苷(IPTG)，5-溴-4-氯-3-吲哚-P -D-半乳糖苷(X-gal)，胰蛋白胨，酵母提取物，瓊脂糖，溴化乙錠，焦碳酸二乙酯(DEPC)等購自Takara公司，液氮為浙江省舟山億洋氣體有限公司產(chǎn)品，脫氧核糖核苷酸dNTP，Taq DNA聚合酶，Trizol-A+ 總 RNA 提取試劑盒，RealMasterMix (SYBRGreen)試劑，Quant cDNA 第一鏈合成試劑盒以及DH5a感受態(tài)細(xì)胞購自TIANGEN公司，引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。本發(fā)明實(shí)施例所用主要儀器包括:小型離心機(jī)(Qspin ，BAYGENE)，渦旋振蕩器(QL-866 型，QILINEBEIER)，核酸蛋白儀(SmartSpace Plus, Bio-Rad)，超凈工作臺(SW—CJ一IG型，名牌之星)，恒溫培養(yǎng)箱(普斯特)，-80 °C超低溫冰箱(Thermo scientific),熒光定量PCR系統(tǒng)(ABI7300型)pH計(jì)(Mettler Toledo320PH Meter)，高壓蒸氣滅菌鍋(SANYO),高速冷凍離心機(jī)(Centrifuge5417R, eppendorf),電泳儀(DYY-6C 型，北京六一)，水浴鍋(上海精宏)，凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad⑶2000)，PCR儀(ABI Veriti96well ThermalCycler)，自動測序儀(ABI3730型)。
1.2鯢魚RNA的提取及cDNA合成以及各近緣物種基因組DNA的提取本實(shí)施例中涉及的樣本為采自6個不同海域的鯢魚個體、皇姑魚、大黃魚、棘頭梅童魚、白姑魚、小黃魚、黑鰓梅童魚、美國紅魚、皮氏叫姑魚等(表I)。表I用于PCR檢測的樣本來源

權(quán)利要求
1.用于檢測鯢魚熱休克蛋白HSP90基因的熒光定量PCR引物對，其特征在于，其包括: 正向引物 HSP90-RT-F:5’ -ATGACCAAAGCCGACCTG-3’ 和 反向引物 HSP90-RT-R:5’ -GTGAAAGAACCTCCAGCA-3’。
2.含有權(quán)利要求1所述引物對的用于檢測鯢魚熱休克蛋白HSP90基因的試劑盒。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括dNTPs、TaqDNA聚合酶、Mg2+、PCR反應(yīng)緩沖液中的一種或多種。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括標(biāo)準(zhǔn)陽性模板。
5.鯢魚熱休克蛋白HSP90基因的熒光定量PCR檢測方法，其是利用權(quán)利要求1所述引物對或權(quán)利要求2-4任一項(xiàng)所述試劑盒對鯢魚熱休克蛋白HSP90基因進(jìn)行熒光定量PCR檢測。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的檢測方法，其特征在于，包括以下步驟: 1)提取樣品組織中的總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA； 2)以步驟I)中的cDNA為模板，HSP90-RT-F和HSP90-RT-R為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)； 3)分析PCR產(chǎn)物。
7.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的檢測方法，其特征在于，PCR反應(yīng)體系以25計(jì)為:
8.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的檢測方法，其特征在于，PCR反應(yīng)條件為:94°C5分鐘；940C 30秒，60°C 30秒，72°C I分鐘，共30個循環(huán)；72°C 5分鐘。
全文摘要
本發(fā)明提供一種鮸魚熱休克蛋白HSP90基因的熒光定量PCR檢測方法，擴(kuò)增使用的特異性引物的核苷酸序列如Seq ID No.1和2所示。利用熒光定量PCR技術(shù)分析熱休克蛋白HSP90基因在不同器官/組織中的表達(dá)譜。對進(jìn)一步研究魚類應(yīng)激蛋白的功能及其特征具有重要的意義，對鮸魚養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展起到推動作用。
文檔編號C12N15/11GK103103274SQ20131003095
公開日2013年5月15日 申請日期2013年1月24日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月4日
發(fā)明者徐田軍, 王日昕, 魏濤, 孫悅娜 申請人:浙江海洋學(xué)院