專利名稱：一個抑制BMPR-lB基因表達合成的shRNA分子的制作方法
技術領域：
本發(fā)明是“七個抑制BMPR-1B基因表達合成的shRNA分子”的專利，即申請?zhí)枮?011103725220的母案專利的分案申請。本發(fā)明涉及能夠對骨形成蛋白受體-1B(BMPR-1B)基因產生顯著抑制作用的小干擾RNA分子的設計、合成和抑制作用在Hek293細胞上的評價方法。
背景技術：
BMPR-1B基因是一種增加排卵率的調控基因，屬于TGF-β超家族成員，又稱為ALK6基因；ALK6突變是在Booroola母羊(FecB)中發(fā)現(xiàn)的第一個點突變，發(fā)生在高度保守的胞內激酶區(qū)，核苷酸830處(A830G)，引起精氨酸代替了谷氨酰胺(Q249R);其顯性表現(xiàn)型為卵泡發(fā)育提前以及產多胎。文獻檢索披露:(l)Biol.Reprod.64，1225-1235作者:ffilson, T.等發(fā)表《表現(xiàn)為多胎性狀的Booroola羊，在卵母細胞和顆粒細胞表達的ALK6基因的一個突變》文章內容是攜帶FecB純合子的母羊其排卵率升高，伴隨著大量囊狀卵泡比FecB+雜合子的母羊提前成熟并發(fā)生排卵；因此，攜帶FecB純合子母羊其排卵前卵泡提前達到了最大直徑并維持在一定水平，直到排卵，導致最終卵泡生長動力學發(fā)生了變化。(2)Repix)duCtiveBiologyandEndocrinology2006, 4:20do1: 1184/1477-7827-4-20 作者 St6phane Fabre 等發(fā)表《在哺乳動物中調節(jié)排卵率:羊基因模型的作用》文章，內容是BMP15，GDF9, BMPR-1B這三個基因型來理解BMP系統(tǒng)的作用作為卵巢內濾泡生長和成熟的調節(jié)最后影響排卵率。(3)Reproduction (2011) 141 643-651作者Wei Wang等發(fā)表《RNA分子干擾豬的含有內源性SMAD4的顆粒細胞導致的FSH介導的顆粒細胞的增值和類固醇合成的減少》文章內容是在豬的顆粒細胞上用RNA干擾的方法敲低了 SMAD4，結果顯示了 SMAD4_siRNA抑制了 SMAD4的mRNA和蛋白的表達并抑制了 FSH引起的豬顆粒細胞的分化和雌二醇的分泌和細胞周期蛋白的表達。

關于BMPR-1B基因shRNA分子的研究，ALK6基因干擾的小鼠并沒有像Booroola母羊一樣表現(xiàn)出多胎性狀，且卵泡發(fā)育和排卵率都表現(xiàn)正常，但其軟骨形成受到影響，骨骼肌發(fā)育存在缺陷，說明ALK6突變存在種屬差異，針對其它家畜品種，如綿羊、山羊、豬等，均未見報道。本發(fā)明構思根據(jù)綿羊BMPR-1B基因cDNA序列，自行設計合成的shRNA分子，通過功能驗證，得到I個對綿羊BMPR-1B基因表達有顯著抑制作用的shRNA分子，為綿羊生物學研究拓展了應用領域。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目在于:獲得對BMPR-1B基因表達具有顯著抑制效果的shRNA分子，在mRNA水平上抑制BMPR-1B基因表達效率90%以上。本發(fā)明的目的是這樣實現(xiàn)的:一個抑制BMPR-1B基因表達合成的shRNA分子，依據(jù)GeneBank中綿羊BMPR-1B基因，即NM-001009431.1序列；設計2條shRNA分子，將合成的兩條互補單鏈的shRNA分子經(jīng)退火形成雙鏈后，連接到pLL3.7慢病毒干擾載體上，構建慢病毒干擾RNA質粒，將pLL-BMPR-1B-shRNA干擾RNA質粒與BMPR-1B表達載體經(jīng)脂質體轉染293T細胞產毒，經(jīng)熒光定量PCR檢測，得到了 I個能顯著抑制BMPR-1B基因表達的shRNA分子；
其中使用的引物:
LV-BMPR-1B-1475上游:
5’ TTGAGAGAGATCGTGTGTATTTCAAGAGAATACACACGATCTCTCTCATTTTTTC-3’ ；
下游:
5，TCGAGAAAAAATGAGAGAGATCGTGTGTATTCTCTTGAAATACACACGATCTCTCTCAA-3，；
其中獲取shRNA分子的步驟:
其I shRNA慢病毒載體的構建
取IOUL IOuM的兩條siRNA寡核苷酸，即為正鏈和互補鏈；加入8 μ L IOXannealingbuffer和12 μ L滅菌超純水，煮沸10分鐘后冷卻至室溫；同時用pLL3.7質粒載體經(jīng)XhoI和HpaI雙酶切后回收質粒，與退火產物4°C過夜連接，連接產物轉化DH5a感受態(tài)細胞，LB平板氨芐青霉素，即為lOOug/uL;篩選，用載體檢測引物及shRNA寡核苷酸引物篩選陽性克隆，并送上海生工所測序鑒定，提取純化重組質粒用于轉染；
其 2 plex-bmpr-1b、Lv-BMPR-lB-shRNA 慢病毒的制備
鋪板，每IOcm面積中 鋪5 X IO6個293T細胞；Lipectamine2000脂質體轉染，在含有脂質體和DNA復合物的試管中加入1.5ml預熱的Opt1-MEM培養(yǎng)基后，加入目的載體及病毒包裝載體，其載體的加量分別為:轉染載體Iv- bmpr-1b -shRNA 12ug、REV 6ug、pMDL 6ug、VSVG 6ug ； plex-bmpr-1bl2 ug、Pspax2 9ug、PMD2.G3.5 ug,輕輕混勻，室溫放置 5 分鐘,之后將上述稀釋好的DNA與脂質體混合，置于室溫孵育20分鐘，此時用Opt1-MEM培養(yǎng)基清洗液轉染細胞一次；將脂質和DNA復合物加入細胞，置于37°C培養(yǎng)箱，培養(yǎng)4-6小時，換IOmL新鮮DMEM完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48_50h，收集病毒，此時的病毒能直接用來轉染或置于-70°C備用；
其3重組Lentivirus感染Hek293細胞系的步驟
將濾過的重組0.5 mL Lentivirus和0.5 mL培養(yǎng)液，以體積比1:1混合,加入濃度為10 μ g/mL的聚凝胺I μ L，將病毒加入細胞，置于32°C培養(yǎng)箱14-16h，移回37°C培養(yǎng)箱孵育，4-6h，更換新鮮培養(yǎng)液，在37°C培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，感染48-52h，轉入IOOmm培養(yǎng)皿，1-1.5h加入含有濃度為600ng/ mL的Puromycin的選擇性培養(yǎng)液；每隔2_3天更換選擇性培養(yǎng)液，2-3周獲得穩(wěn)定轉染的細胞；
其4 shRNA病毒載體感染轉染BMPR-1B基因的Hek293細胞系步驟感染前按每孔4 X IO5個/mL的密度將表達BMPR-1B的Hek293細胞接種于六孔板，用2mL含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)細胞，24_26h備用；將500 μ L的shRNA干擾病毒與500 μ L含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)細胞，以體積比1:1混合，同時加入IuL 10 μ g/mL的Polybrene，24_30h，更換含10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)液，再培養(yǎng)24-28h收獲細胞；用Trizol法提取總RNA ；
其5 shRNA抑制效果在Hek293細胞系上的評價PCR 反應體系:2 X master mix 10 μ L,上下游，即 10pm，即 0.8 μ L ;cDNA 2μ L ；
PCR反應條件:95°C 10s, 58°C 20s, 72°C 20s，55個循環(huán)后進入溶解曲線分析程序:40°C -99°C，即為0.10C /s ;通過定量分析，shl475干擾分子能夠有效抑制99.78% BMPR-1B
基因的表達。本發(fā)明的實踐意義與技術效果:多胎性狀是綿羊重要的經(jīng)濟性狀之一 ；BMPR_IB基因是小尾寒羊，湖羊等多個綿羊品種的多胎主效基因；本研究應用分子克隆技術，細胞培養(yǎng)技術，熒光定量PCR技術，針對綿羊的BMPR-1B基因序列設計了 I個shRNA干擾分子，并檢測了 BMPR-1B基因的mRNA表達量變化，結果顯示，該shRNA干擾分子具有顯著抑制效果，能夠有效抑制99.78%BMPR-1B基因的表達；本發(fā)明為闡明BMPR-1B基因的作用機制，培育多胎綿羊品種提供技術支持，彰顯技術進步。
具體實施例方式本發(fā)明結合實施例作進一步說明。依據(jù)GeneBank 中綿羊 BMPR-1B 基因，S卩 NM-001009431.1 序列；設計 2 條 shRNA 分子，將合成的兩條互補單鏈的shRNA分子經(jīng)退火形成雙鏈后，分別連接到pLL3.7慢病毒干擾載體上，構建了慢病毒干擾RNA質粒，將pLL-BMPR-1B-shRNA干擾RNA質粒與BMPR-1B表達載體經(jīng)脂質體轉染293T細胞產毒，經(jīng)熒光定量PCR檢測，得到了 I個能顯著抑制BMPR-1B基因表達的shRNA分子；所用引物(略)；
I) shRNA慢病毒載體的構建
各取IOUL IOuM的兩條siRNA寡核苷酸(正鏈和互補鏈)，加入8 μ L IOXannealingbuffer和12 μ L滅菌超純水，煮沸IOmin后自然冷卻至室溫，同時pLL3.7質粒載體經(jīng)XhoI和HpaI雙酶切后回收線性化質粒，與退火產物4°C過夜連接，連接產物轉化DH5a感受態(tài)細胞，LB平板氨芐青霉素(100ug/uL)篩選；用載體檢測引物及shRNA寡核苷酸引物篩選陽性克隆并送上海生工測序鑒定序列正確后，提取純化重組質粒用于轉染。2) plex-bmpr-1b、Lv-BMPR-lB-shRNA 慢病毒的制備 第一日:鋪板(上午10-11時)
每IOcm面積中鋪3X IO6個293T細胞，保證第二天細胞在完全培養(yǎng)液中匯合度達到80%-90% ；
第二日:Lipectamine2000脂質體轉染(下午2-3時)
首先在聚丙烯管內準備脂質體和DNA復合物；
加入1.5ml預熱的OPT1-MEMs I培養(yǎng)基后，按比例加入目的載體及病毒包裝載體，輕輕混勻，室溫放置；其中加入的比例位:轉染載體Iv- bmpr-1b -shRNA 12ug、包裝質粒REV6ug、pMDL 6ug、包膜質粒 VSVG 6ug、轉染載體 plex-bmpr-1b 12 ug、包裝質粒 Pspax2 9ug、包膜質粒 PMD2.G 3.5 ug;
在使用Lipictamine2000之前先輕輕混勻脂質體，而后在另一個聚丙烯管中加入
1.5mL預熱的OPT1-MEMs I培養(yǎng)基，再加入50uL Lipictamine2000,輕輕混勻后室溫放置；在室溫放置5分鐘后，將上述稀釋好的 DNA與脂質體混合，混合物質于室溫孵育20min,在此期間可以用OPT1-MEMs I培養(yǎng)基洗待轉染的細胞一次；注:由于293T細胞易脫壁，故整個過程中操作須輕緩，可以先將細胞培養(yǎng)板傾斜，將液體沿板壁慢慢加入，再慢慢放正細胞板。然后將脂質和DNA復合物加入細胞，上下傾斜細胞板使液體均勻覆蓋在細胞表面，37°C培養(yǎng)4h后，換IOmL新鮮的DMEM完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48h后收集病毒，此時的病毒能直接用來轉染，或置于_70°C備用。3)重組Lentivirus感染Hek293細胞系的步驟
轉染前一天按每孔4X IO5個/mL的密度將Hek293細胞系接種于六孔板，保證轉染時匯合度達到60-70%;將濾過的重組0.5 mL Lentivirus和0.5 mL培養(yǎng)液(體積比1:1)混合，同時加入I μ L聚凝胺(polybrene)(終濃度為10yg/mL)，將病毒加入細胞，然后，把細胞置于32°C培養(yǎng)箱14-16h后移回37°C培養(yǎng)箱孵育，4-6h后更換新鮮培養(yǎng)液，37°C培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。感染48h后,轉入IOOmm培養(yǎng)皿，Ih后加入Puromycin (終濃度為600ng/ mL)選擇性培養(yǎng)液；為了獲得穩(wěn)定整合外院基因的細胞，每隔2-3d更換含PuiOmycin選擇性培養(yǎng)液，通常14-21d，即獲得穩(wěn)定轉染的細胞。4 ) shRNA病毒載體感染含BMPR-1B的Hek293細胞系
感染前一天按每孔4 X IO5個/mL的密度將表達BMPR-1B的Hek293細胞接種于六孔板，用2mL含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)細胞，24h后細胞達到70-80%匯合度時；將500 μ L的ShRNA干擾病毒與500 μ L含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)細胞(體積比1:1)混合，同時加入I μ L 10 μ g/mL的Polybrene , 24h后,更換為含有10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)液，再培養(yǎng)24h后收集細胞，用Trizol法提取總RNA。5) shRNA抑制效果在Hek293細胞系上的評價
上述感染細胞的總RNA經(jīng)反轉錄成cDNA后，通過熒光定量PCR對BMPR-1B基因表達進行相對定量分析，評價對BMPR-1B基因表達的抑制效果；定量分析方法如下=Realtime PCR熒光染料SYBR Green I購自TAKARA公司試劑進行Real Time PCR反應體系為:2 X master mix 10 μ L,上下游(10pm)個 0.8 μ L ;cDNA 2yL。PCR 反應條件為:95°C10s, 58°C 20s, 72°C 20s, 55個循環(huán)后進入溶解曲線分析程序:40°C -99°C (0.1°C /s)。通過相對定量分析得出:shl475干擾分子能夠有效抑制99.78% BMPR-1B基因的表達。本實驗選用的Opt1-MEM培養(yǎng)液和DMEM培養(yǎng)液，購自美國Gibco公司；XhoI和HpaI限制性內切酶，購自日本TAKARA公司；pLL3.7載體由周文來，即美國加州大學圣地亞哥分校醫(yī)學部，霍華德休斯醫(yī)學研究所提供；Pspax2 ；VSVG由李文蓉，即美國克羅拉大學提供；plex載體購 自美國Openbiosystem公司；包裝質粒pMDL, REV, PMD2.G購自美國biosystem 公司。
權利要求
1.一個抑制BMPR-IB基因表達合成的ShRNA分子，其特征在于其堿基序列的上游5’ TTGAGAGAGATCGTGTGTATTTCAAGAGAATACACACGATCTCTCTCATTTTTTC-3’ ；下游5，TCGAGAAAAAATGAGAGAGATCGTGTGTATTCTCTTGAAATACACACGATCTCTCTCAA-3，。
全文摘要
本發(fā)明提供的一個抑制BMPR-lB基因表達合成的shRNA分子，其堿基序列為上游:5’TTGAGAGAGATCGTGTGTATTTCAAGAGAATACACACGATCTCTCTCATTTTTTC-3’；下游:5’TCGAGAAAAAATGAGAGAGATCGTGTGTATTCTCTTGAAATACACACGATCTCTCTCAA-3’。本發(fā)明涉及能夠對骨形成蛋白受體-lB(BMPR-lB)基因產生顯著抑制作用的小干擾RNA分子的設計、合成和抑制作用在Hek293細胞上的評價方法。
文檔編號C12N15/113GK103255143SQ20131002598
公開日2013年8月21日 申請日期2013年1月24日 優(yōu)先權日2013年1月24日
發(fā)明者黃俊成, 林嘉鵬, 汪立芹, 吳陽升, 金賢華, 韓冰, 劉莉, 趙云程 申請人:新疆維吾爾自治區(qū)畜牧科學院中國-澳大利亞綿羊育種研究中心