專利名稱：：一種低分子量肝素的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種低分子量肝素的制備方法，尤其是利用非哺乳類魚類資源，采用改進(jìn)酶法提取高凝血酶活性低分子量肝素的方法。
背景技術(shù)：
：凝血是參與維持哺乳動(dòng)物正常止血的生理途徑，在血管受傷的情況下，凝血途徑受到激發(fā)而形成血凝塊，阻止血液損失，血管受傷發(fā)生后，血小板立即開始在受傷部位凝集形成物理堵塞物以阻止血液流失。此外，受傷血管也通過血管收縮來減少流經(jīng)此區(qū)域的血流，而血纖維蛋白則開始凝集形成覆蓋破裂區(qū)域的不溶性網(wǎng)絡(luò)或凝塊。當(dāng)凝血途徑傾向于過量凝結(jié)的不平衡狀態(tài)時(shí)，其結(jié)果是血栓趨勢的形成，通常表現(xiàn)為心臟病發(fā)作、中風(fēng)、深靜脈血栓和急性冠狀動(dòng)脈綜合征，例如心肌梗死和不穩(wěn)定型心絞痛。此外，血栓可以弓I發(fā)栓塞，并造成肺栓塞或包括中風(fēng)或短暫缺血性發(fā)作在內(nèi)的腦血管栓塞。目前與凝血途徑中的不平衡相關(guān)的病變的治療方法存在很多風(fēng)險(xiǎn)，必須進(jìn)行謹(jǐn)慎的控制。肝素是一類具有抗凝性質(zhì)的硫酸化的葡糖胺聚糖的名稱。肝素在醫(yī)學(xué)上廣泛用作醫(yī)用介入設(shè)備(invasivemedicalequipment)的涂層劑例如導(dǎo)管和植入體的涂層劑，以及治療劑和預(yù)防劑。此外，已經(jīng)將肝素與體外循環(huán)血液透析一起使用，作為化療藥物和抗炎藥物的助劑，作為生長因子的調(diào)節(jié)劑，并且用于治療血液動(dòng)力學(xué)紊亂(haemodynamoicdisorder)、先兆子癇(pre-eclampsia)、腸炎疾病(inflammatorboweldisease)、癌癥(cancer)、靜脈血栓疾病(venousthromboembolic)、不穩(wěn)定的冠脈局部缺血疾病(unstablecoronaryischemicdisease)和急性腦血管局部缺血(acutecerebravascularischemia)。肝素是天然的抗凝藥物，廣泛分布在哺乳動(dòng)物的肝、肺、心、脾、腎、胸腺、腸黏膜、肌肉和血液中，多與蛋白質(zhì)結(jié)合成復(fù)合物存在，這種復(fù)合物無抗凝活性，隨著蛋白質(zhì)去除而活性增加。各種組織中肝素的含量與肥大細(xì)胞的數(shù)目有關(guān)，肥大細(xì)胞內(nèi)的顆粒含有肝素或肝素前體，當(dāng)物理或化學(xué)的刺激使肥大細(xì)胞脫顆粒時(shí)，肝素被釋放出來，在體內(nèi)被肝素酶滅或而通過尿液排泄出去。肝素具有聚合結(jié)構(gòu)，因而肝素組合物通常包含分子量通常為5kDa至40kDa的肝素(例如參見Mulloyetal.,Thromb.Haemost.841052-1056(2000))ο分子量范圍如此廣的肝素通常是指未分級(jí)肝素(unfractionatedheparin,UFH)。低分子肝素(lowmolecularweightheparin,LMWH)是由未分級(jí)肝素經(jīng)化學(xué)或酶解聚的方法得到的低相對(duì)分子量(Mr)的肝素片段或經(jīng)分級(jí)得到的低Mr肝素組分，Mr范圍一般為3000-8000，平均Mr為5000左右。低分子肝素的抗凝血酶FIIa活性遠(yuǎn)低于其抗Xa因子的活性。LMWH具有抗凝血、抗血栓、調(diào)血脂、抗腫瘤等作用，與UHl相比具有以下幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)它更好地被吸收，并且可以進(jìn)行皮下給藥；在血流中保留更長的時(shí)間；具有更可預(yù)測的臨床響應(yīng)；可能引起更少的與UFH有關(guān)的不利副作用例如出血過多、血小板數(shù)量偏低、骨質(zhì)疏松和刺激注射部位。低分子肝素可從肝素直接分離，或把肝素降解后再純化得到。分離方法包括有機(jī)溶劑分級(jí)沉淀法、凝膠色譜法、親和色譜法、離子交換色譜法和超濾法等。這些方法保持了未分級(jí)肝素原有的結(jié)構(gòu)特征和生物學(xué)活性，但由于低分子量的成分再UHl中的含量低，不宜于大規(guī)模生產(chǎn)。降解方法有肝素酶解法、亞硝酸降解法、過氧化氫降解法、過碘酸降解法、β_消除法、Y-照射法等。不同方法制備得到的LMWH之間結(jié)構(gòu)差異最大之處在于其末端結(jié)構(gòu)，由亞硝酸降解得到的產(chǎn)物，其末端具有無水甘露醇?xì)埢?消除法的產(chǎn)物具有非硫酸化或2-0-硫酸化的不飽和糖醛酸非還原末端。由于化學(xué)降解法反應(yīng)的劇烈，使得肝素分子中的某些功能基團(tuán)再反應(yīng)過程中或多或少被破壞，從而對(duì)其某些生物學(xué)功能帶來一定影響。而酶法降解由于其反應(yīng)條件溫和、便于檢測以及生物活性保持較好等特點(diǎn)，成為近年來LMWH提取研究的熱點(diǎn)?，F(xiàn)在商品肝素主要來源于牛肺、豬肺、豬腸黏膜和羊肺等動(dòng)物器官。但是，由于認(rèn)識(shí)到哺乳動(dòng)物不同種屬之間存在的屬間交叉病毒和朊病毒感染，對(duì)源自哺乳動(dòng)物的LMWH的使用所帶來的副作用倍受關(guān)注。針對(duì)上述問題，本發(fā)明提供了一種使用極為廣泛的非哺乳類魚類資源，改進(jìn)酶法提取工藝，獲取高凝血活性低分子量肝素的制備方法。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種利用非哺乳類魚類資源，采用改進(jìn)酶法提取高凝血酶活性低分子量肝素的方法，以避免哺乳動(dòng)物種屬之間存在的屬間交叉病毒和朊病毒感染，同時(shí)改進(jìn)酶提取方法，提高了低分子量肝素的凝血酶活性。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種制備低分子量肝素的方法，其具體步驟為從魚類組織中粗提獲得未分級(jí)肝素組分，用肝素酶降解未分級(jí)肝素，得到低分子量肝素凍干純品，并對(duì)其含量和活性進(jìn)行測定。本發(fā)明提供的制備低分子量肝素的方法，還包括使用高效液相質(zhì)譜對(duì)所獲得的低分子量肝素的純度和分子量的分析。其中，從魚類組織中粗提獲取未分級(jí)肝素組分的步驟為在組織攪拌機(jī)中加入等量的魚類組織和PBS緩沖液進(jìn)行組織勻漿，將勻漿物中加入40%的NaOH調(diào)節(jié)pH到9.O,升溫至80°C溫育3小時(shí)，并以IOOOOrpm離心，收集上清液備用；在上清液中加入50%硫酸銨進(jìn)行鹽析步驟，升溫至80°C，攪拌I小時(shí)，8000rpm離心，收集上清施加至強(qiáng)堿性陰離子交換樹脂，并使用含有4MNaCl的PBS緩沖液對(duì)肝素進(jìn)行洗脫；收集洗脫組分，使用截留分子量為IOOODa的過濾器對(duì)洗脫液進(jìn)行濃縮和脫鹽，加入95%乙醇洗滌2_3次后進(jìn)行真空凍干處理，即獲得未分級(jí)肝素凍干品。其中，所述的魚類為鮭魚，特別的，所述魚類組織選自頭、皮、鰓和內(nèi)臟。其中，所述強(qiáng)堿性陰離子交換樹脂優(yōu)選為美國RohmHass生產(chǎn)的Amberlite系列、德國拜爾公司生產(chǎn)的Lewatit系列。其中，所述用肝素酶降解未分級(jí)肝素獲得低分子量肝素的步驟包括取UHl組分溶于PH7.4的PBS溶液中，充分溶解后離心去除雜質(zhì)，在上清液中加入肝素酶III(EC4.2.2.8)，37°C水浴反應(yīng)10小時(shí)后，不加入相同量的肝素酶III，繼續(xù)反應(yīng)10小時(shí)，然后水浴升溫加熱至80°C，I小時(shí)候停止反應(yīng)并IOOOOrpm離心，收集上清液用O.22μm濾膜過濾，加入NaCl固體使其鹽濃度未20%(wt)，然后加入90%乙醇，低溫靜置過夜，直至有沉淀析出，8000rpm離心20min后,棄去上清收集沉淀,重復(fù)上述鹽析、脫水步驟,將獲得的沉淀凍干處理后即得低分子量肝素純品。其中，所述低分子量肝素含量的測定的方法采用咔唑比色法。其中，所述低分子量肝素純度和分子量分析采用高效液相質(zhì)譜聯(lián)用儀和聚丙烯酰胺凝膠電泳法。其中，所述高效液相-質(zhì)譜法的具體操作步驟為將凍干純品溶解于蒸餾水配制成Iμg/μI的濃度，進(jìn)樣5μI。流動(dòng)相A為水/乙腈(85:15ν/ν)，B為水/乙腈(35:65ν/ν)，兩個(gè)流動(dòng)相均含有12mM的三丁基氨TBA和38mM醋酸銨，pH用醋酸調(diào)節(jié)至6.5。梯度洗脫程序?yàn)?%B流動(dòng)相洗脫10分鐘，開始增加B的使用量，在60分鐘內(nèi)使得B在總流動(dòng)相中的比例由O%勻速增加到100%。色譜柱為ZorbaxSB-C18(5ym，0.5X250mm)，洗脫速度為ΙΟμΙ/min。洗脫液直接接入電噴霧離子源質(zhì)譜分析儀中，電噴霧接口設(shè)置為負(fù)電模式，進(jìn)口電壓為-40V，出口為-40V，離子源溫度控制在325°C以使得最大程度的得到離子，全譜掃描寬度為150-1500Da，掃描速率為10次/秒，氮?dú)夥謩e被用作干燥氣(5L/min)和中和氣(20psi),數(shù)據(jù)處理采用DataAnalysis2.0。其中，聚丙烯酰胺凝膠電泳法的具體步驟為將所獲得的低分子量肝素純品用雙蒸水配成5mg/ml,再與等體積40%蔗糖混勻配成上樣液，溴酚藍(lán)作指示劑。電泳膠濃度采用22%的分離膠加5%的濃縮膠，150V電泳Ih后，調(diào)電壓為200V繼續(xù)電泳1.5h。上樣量為1020μI,染色用O.25%阿利辛藍(lán)，染色半O.5h,脫色用2%醋酸脫至背景無色。其中，對(duì)低分子量肝素活性的測定包括羊血漿法測定抗IIa效價(jià)和生色底物法測定抗Xa效價(jià)。其中，所述羊血漿法測定抗IIa效價(jià)的步驟為取16支干凈帶塞糖管編號(hào)I至16置于37°C水浴中，按逐管遞增10μI規(guī)律依次加入100μI到250μI的標(biāo)準(zhǔn)肝素(8IU/ml)。再按順序加入羊血漿Iml和O.25%的氯化鈣O.8ml,帶塞倒轉(zhuǎn)3次使混勻并濕潤管內(nèi)壁，勿產(chǎn)生氣泡。置于水浴中恒溫Ih后將其全部取出，觀察各管的凝固程度，找出標(biāo)準(zhǔn)肝素的1/2凝固體積(標(biāo)準(zhǔn)肝素V1/2)。精確稱取層析分離后的肝素寡糖凍干粉適量，用水溶解成Img/ml，測定時(shí)按估計(jì)效價(jià)用O.9%氯化鈉稀釋適當(dāng)倍數(shù)。用上述方法測定各供試品的1/2凝固體積(供試品V1/2)。按如下公式計(jì)算各供試品的抗凝血酶效價(jià)供試品效價(jià)(IU/mg)=(標(biāo)準(zhǔn)肝素V1/2/供試品Vl/2)X標(biāo)準(zhǔn)肝素效價(jià)X稀釋倍數(shù)。其中，所述生色底物法測定抗Xa效價(jià)的步驟為參照英國藥典方法將對(duì)照品依諾肝素用Tris2NaCl緩沖液(ρΗ7·4)配制成4個(gè)具一定濃度梯度(O.02,0.08,0.14,0.2AntiFXaIU/ml)的溶液。精密稱取肝素寡糖凍干粉適量，用上述緩沖液溶解成Img/ml，測定時(shí)再用緩沖液稀釋適當(dāng)倍數(shù)。ATIII和Xa因子均用上述緩沖液溶解按說明稀釋成適宜濃度。生色底物加水溶解成3mmol/L溶液，臨用前再用Tris2EDTA緩沖液(pH8.4)稀釋成0.5mmol/L溶液。取干凈具塞試管置于37°C水浴中，加入對(duì)照品或供試品溶液80μ1，空白管中加入ΡΗ7.4的緩沖液80μI。再依次加入抗凝血酶III溶液80μI,Xa因子溶液160μI,生色底物CBS溶液400μ1，每次加試劑后都迅速漩渦振蕩混勻，勿產(chǎn)生氣泡，分別精確保溫Imin、2min和4min。最后加入37%的醋酸600μI終止反應(yīng)，在波長405nm處測定吸收度。以對(duì)照品效價(jià)為橫坐標(biāo)，空白管減去對(duì)照管吸收值為縱坐標(biāo)做標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)供試品的吸收值差值在標(biāo)曲上查出相應(yīng)的效價(jià)值。圖1表示高效液相-質(zhì)譜圖。圖2表示聚丙烯酰胺凝膠電泳圖，圖中泳道從左往右依次為肝素dplO，部分降解的肝素樣品，本發(fā)明所得LMWH，UFH，商品LMWH。具體實(shí)施例方式以下將結(jié)合附圖及實(shí)施例來詳細(xì)說明本發(fā)明的實(shí)施方式，借此對(duì)本發(fā)明如何應(yīng)用技術(shù)手段來解決技術(shù)問題，并達(dá)成技術(shù)效果的實(shí)現(xiàn)過程能充分理解并據(jù)以實(shí)施。本發(fā)明提供一種制備低分子量肝素的方法，其具體步驟為從魚類組織中粗提獲得未分級(jí)肝素組分，用肝素酶降解未分級(jí)肝素，得到低分子量肝素凍干純品，并對(duì)其含量和活性進(jìn)行測定。本發(fā)明所提供的制備低分子量肝素的方法，還包括使用高效液相質(zhì)譜對(duì)所獲得的低分子量肝素的純度和分子量的分析。所述從魚類組織中粗提獲取未分級(jí)肝素組分的步驟為選取鮭魚頭、皮、鰓和內(nèi)臟等加工廢棄物，在組織攪拌機(jī)中加入等量的魚類組織和PBS緩沖液進(jìn)行組織勻漿，將勻漿物中加入40%的NaOH調(diào)節(jié)pH到9.0，升溫至80°C溫育3小時(shí)，并以IOOOOrpm離心，收集上清液備用；在上清液中加入50%硫酸銨進(jìn)行鹽析步驟，升溫至80°C，攪拌I小時(shí)，8000rpm離心，收集上清施加至強(qiáng)堿性陰離子交換樹脂，并使用含有4MNaCl的PBS緩沖液對(duì)肝素進(jìn)行洗脫；收集洗脫組分，使用截留分子量為IOOODa的過濾器對(duì)洗脫液進(jìn)行濃縮和脫鹽，力口入95%乙醇洗滌2-3次后進(jìn)行真空凍干處理，即獲得未分級(jí)肝素凍干品。所述強(qiáng)堿性陰離子交換樹脂優(yōu)選為美國RohmHass生產(chǎn)的Amberlite系列、德國拜爾公司生產(chǎn)的Lewatit系列。所述用肝素酶降解未分級(jí)肝素獲得低分子量肝素的步驟包括取UHl組分溶于PH7.4的PBS溶液中，充分溶解后離心去除雜質(zhì)，在上清液中加入肝素酶III(EC4.2.2.8)，37°C水浴反應(yīng)10小時(shí)后，不加入相同量的肝素酶III，繼續(xù)反應(yīng)10小時(shí)，然后水浴升溫加熱至80°C，I小時(shí)候停止反應(yīng)并IOOOOrpm離心，收集上清液用O.22μm濾膜過濾，加入NaCl固體使其鹽濃度未20%(wt)，然后加入90%乙醇，低溫靜置過夜，直至有沉淀析出，8000rpm離心20min后，棄去上清收集沉淀，重復(fù)上述鹽析、脫水步驟，將獲得的沉淀凍干處理后即得低分子量肝素純品。所述低分子量肝素含量的測定的方法采用咔唑比色法(CarbazoleAssay),LMWH凍干后配制成0.01mg/ml,O.05mg/ml和0.2mg/ml三個(gè)濃度。另外取同樣量的肝素和商品低分子量肝素各適量，重復(fù)以上的純化步驟，測定重量后凍干配制成相對(duì)應(yīng)的濃度作為對(duì)照。所述低分子量肝素純度和分子量分析采用高效液相質(zhì)譜聯(lián)用儀和聚丙烯酰胺凝膠電泳法。所述高效液相-質(zhì)譜法的具體操作步驟為將凍干純品溶解于蒸餾水配制成Iμg/μI的濃度，進(jìn)樣5μI。流動(dòng)相A為水/乙腈(85:15ν/ν)，B為水/乙腈(35:65v/V)，兩個(gè)流動(dòng)相均含有12mM的三丁基氨TBA和38mM醋酸銨，pH用醋酸調(diào)節(jié)至6.5。梯度洗脫程序?yàn)?%B流動(dòng)相洗脫10分鐘，開始增加B的使用量，在60分鐘內(nèi)使得B在總流動(dòng)相中的比例由O%勻速增加到100%。色譜柱為ZorbaxSB-C18(5ym，0.5X250mm)，洗脫速度為ΙΟμΙ/min。洗脫液直接接入電噴霧離子源質(zhì)譜分析儀中，電噴霧接口設(shè)置為負(fù)電模式，進(jìn)口電壓為-40V，出口為-40V，離子源溫度控制在325°C以使得最大程度的得到離子，全譜掃描寬度為150-1500Da，掃描速率為10次/秒，氮?dú)夥謩e被用作干燥氣(5L/min)和中和氣(20psi),數(shù)據(jù)處理采用DataAnalysis2.O。圖1中顯示了上述高效液相色譜一質(zhì)譜分析的結(jié)果。所述聚丙烯酰胺凝膠電泳法的具體步驟為將所獲得的低分子量肝素純品用雙蒸水配成5mg/ml,再與等體積40%蔗糖混勻配成上樣液，溴酚藍(lán)作指示劑。電泳膠濃度采用22%的分離膠加5%的濃縮膠，150V電泳Ih后，調(diào)電壓為200V繼續(xù)電泳1.5h。上樣量為1020μ1，染色用O.25%阿利辛藍(lán)，染色半O.5h,脫色用2%醋酸脫至背景無色。本發(fā)明所獲得的低分子量肝素產(chǎn)物和肝素對(duì)照品一起進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠，其獲得的結(jié)果見圖2，圖中蛋白條帶顯示本發(fā)明純化所得的蛋白質(zhì)分子量約為5700Da，與已有的肝素樣品分子量類似。對(duì)低分子量肝素活性的測定包括對(duì)IIa效價(jià)和抗Xa效價(jià)的檢測，采用羊血漿法測定抗IIa效價(jià)和生色底物法測定抗Xa效價(jià)。所述羊血漿法測定抗IIa效價(jià)的步驟為取16支干凈帶塞糖管編號(hào)I至16置于37°C水浴中，按逐管遞增10μI規(guī)律依次加入100μI到250μI的標(biāo)準(zhǔn)肝素(8IU/ml)。再按順序加入羊血漿Iml和O.25%的氯化鈣O.8ml,帶塞倒轉(zhuǎn)3次使混勻并濕潤管內(nèi)壁，勿產(chǎn)生氣泡。置于水浴中恒溫Ih后將其全部取出，觀察各管的凝固程度，找出標(biāo)準(zhǔn)肝素的1/2凝固體積(標(biāo)準(zhǔn)肝素V1/2)。精確稱取層析分離后的肝素寡糖凍干粉適量，用水溶解成Img/ml，測定時(shí)按估計(jì)效價(jià)用O.9%氯化鈉稀釋適當(dāng)倍數(shù)。用上述方法測定各供試品的1/2凝固體積(供試品V1/2)。按如下公式計(jì)算各供試品的抗凝血酶效價(jià)供試品效價(jià)(IU/mg)=(標(biāo)準(zhǔn)肝素V1/2/供試品Vl/2)X標(biāo)準(zhǔn)肝素效價(jià)X稀釋倍數(shù)。所述生色底物法測定抗Xa效價(jià)的步驟為參照英國藥典方法將對(duì)照品依諾肝素用Tris2NaCl緩沖液(ρΗ7·4)配制成4個(gè)具一定濃度梯度(O.02,0.08,0.14,0.2AntiFXaIU/ml)的溶液。精密稱取肝素寡糖凍干粉適量，用上述緩沖液溶解成Img/ml，測定時(shí)再用緩沖液稀釋適當(dāng)倍數(shù)。ATIII和Xa因子均用上述緩沖液溶解按說明稀釋成適宜濃度。生色底物加水溶解成3mmol/L溶液，臨用前再用Tris2EDTA緩沖液(pH8.4)稀釋成0.5mmol/L溶液。取干凈具塞試管置于37°C水浴中，加入對(duì)照品或供試品溶液80μ1，空白管中加入ΡΗ7.4的緩沖液80μI。再依次加入抗凝血酶III溶液80μI,Xa因子溶液160μI,生色底物CBS溶液400μ1，每次加試劑后都迅速漩渦振蕩混勻，勿產(chǎn)生氣泡，分別精確保溫Imin、2min和4min。最后加入37%的醋酸600μI終止反應(yīng)，在波長405nm處測定吸收度。以對(duì)照品效價(jià)為橫坐標(biāo)，空白管減去對(duì)照管吸收值為縱坐標(biāo)做標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)供試品的吸收值差值在標(biāo)曲上查出相應(yīng)的效價(jià)值。測定結(jié)果顯示如表I本發(fā)明LMWH與對(duì)照品依諾肝素對(duì)IIa和Xa半抑制率對(duì)比權(quán)利要求1.一種制備低分子量肝素的方法，其具體步驟為從魚類組織中粗提獲得未分級(jí)肝素組分，用肝素酶降解未分級(jí)肝素(UFH)，得到低分子量肝素凍干純品，分析其分子量，并對(duì)其含量和活性進(jìn)行測定。2.如權(quán)利要求1所述的制備低分子量肝素的方法，其特征在于，從魚類組織中粗提獲取未分級(jí)肝素組分的步驟為在組織攪拌機(jī)中加入等量的魚類組織和PBS緩沖液進(jìn)行組織勻漿，將勻漿物中加入40%的NaOH調(diào)節(jié)pH到9.0，升溫至80°C溫育3小時(shí)，并以IOOOOrpm離心，收集上清液備用；在上清液中加入50%硫酸銨進(jìn)行鹽析步驟，升溫至80°C，攪拌I小時(shí)，8000rpm離心，收集上清施加至強(qiáng)堿性陰離子交換樹脂，并使用含有4MNaCl的PBS緩沖液對(duì)肝素進(jìn)行洗脫；收集洗脫組分，使用截留分子量為IOOODa的過濾器對(duì)洗脫液進(jìn)行濃縮和脫鹽，加入95%乙醇洗滌2-3次后進(jìn)行真空凍干處理，即獲得未分級(jí)肝素凍干品。3.如權(quán)利要求2所述的制備低分子量肝素的方法，其特征在于，所述的魚類為海魚，優(yōu)選鮭魚。4.如權(quán)利要求2所述的制備低分子量肝素的方法，其特征在于，所述魚類組織選自頭、皮、鰓和內(nèi)臟。5.如權(quán)利要求1一4任一所述的制備低分子量肝素的方法，其特征在于，用肝素酶降解未分級(jí)肝素獲得低分子量肝素的步驟包括取UFH組分溶于pH7.4的PBS溶液中，充分溶解后離心去除雜質(zhì)，在上清液中加入肝素酶III(EC4.2.2.8)，37°C水浴反應(yīng)10小時(shí)后，不加入相同量的肝素酶III，繼續(xù)反應(yīng)10小時(shí)，然后水浴升溫加熱至80°C，I小時(shí)候停止反應(yīng)并IOOOOrpm離心，收集上清液用O.22μm濾膜過濾，加入NaCl固體使其鹽濃度未20%(wt)，然后加入90%乙醇，低溫靜置過夜，直至有沉淀析出，8000rpm離心20min后，棄去上清收集沉淀，重復(fù)上述鹽析、脫水步驟，將獲得的沉淀凍干處理后即得低分子量肝素純品。6.如權(quán)利要求1一5任一所述的制備低分子量肝素的方法，其特征在于，所述低分子量肝素含量的測定的方法采用咔唑比色法。7.如權(quán)利要求1一6任一所述的制備低分子量肝素的方法，其特征在于，所述低分子量肝素純度和分子量分析采用高效液相質(zhì)譜聯(lián)用儀和聚丙烯酰胺凝膠電泳法，其中高效液相-質(zhì)譜法的具體操作步驟為將凍干純品溶解于蒸餾水配制成Iμg/μI的濃度，進(jìn)樣5μ1，流動(dòng)相A為水/乙腈(85:15ν/ν)，B為水/乙腈(35:65ν/ν)，兩個(gè)流動(dòng)相均含有12mM的三丁基氨TBA和38mM醋酸銨，pH用醋酸調(diào)節(jié)至6.5，梯度洗脫程序?yàn)镺%B流動(dòng)相洗脫10分鐘，開始增加B的使用量，在60分鐘內(nèi)使得B在總流動(dòng)相中的比例由0%勻速增加到100%，色譜柱為ZorbaxSB-C18(5ym，0.5X250mm)，洗脫速度為10μI/min,洗脫液直接接入電噴霧離子源質(zhì)譜分析儀中，電噴霧接口設(shè)置為負(fù)電模式，進(jìn)口電壓為-40V，出口為-40V，離子源溫度控制在325°C以使得最大程度的得到離子，全譜掃描寬度為150-1500Da，掃描速率為10次/秒，氮?dú)夥謩e被用作干燥氣(5L/min)和中和氣(20psi)，數(shù)據(jù)處理采用DataAnalysis2.O。8.如權(quán)利要求1一7任一所述的制備低分子量肝素的方法，其特征在于，對(duì)低分子量肝素活性的測定包括羊血漿法測定抗IIa效價(jià)和生色底物法測定抗Xa效價(jià)。9.如權(quán)利要求8所述的制備低分子量肝素的方法，其特征在于，所述羊血漿法測定抗IIa效價(jià)的步驟為取16支干凈帶塞糖管編號(hào)I至16置于37°C水浴中，按逐管遞增10μI規(guī)律依次加入100μI到250μI的標(biāo)準(zhǔn)肝素(8IU/ml)，再按順序加入羊血漿Iml和O.25%的氯化鈣O.8ml,帶塞倒轉(zhuǎn)3次使混勻并濕潤管內(nèi)壁，勿產(chǎn)生氣泡，置于水浴中恒溫Ih后將其全部取出，觀察各管的凝固程度，找出標(biāo)準(zhǔn)肝素的1/2凝固體積(標(biāo)準(zhǔn)肝素V1/2)，精確稱取層析分離后的肝素寡糖凍干粉適量，用水溶解成Img/ml，測定時(shí)按估計(jì)效價(jià)用O.9%氯化鈉稀釋適當(dāng)倍數(shù)，用上述方法測定各供試品的1/2凝固體積(供試品V1/2)，按如下公式計(jì)算各供試品的抗凝血酶效價(jià)供試品效價(jià)(IU/mg)=(標(biāo)準(zhǔn)肝素V1/2/供試品Vl/2)X標(biāo)準(zhǔn)肝素效價(jià)X稀釋倍數(shù)。10.如權(quán)利要求8所述的制備低分子量肝素的方法，其特征在于，所述生色底物法測定抗Xa效價(jià)的步驟為參照英國藥典方法將對(duì)照品依諾肝素用Tris2NaCl緩沖液(pH7.4)配制成4個(gè)具一定濃度梯度(O.02,0.08,0.14,0.2AntiFXaIU/ml)的溶液，精密稱取肝素寡糖凍干粉適量，用上述緩沖液溶解成Img/ml，測定時(shí)再用緩沖液稀釋適當(dāng)倍數(shù)，ATIII和Xa因子均用上述緩沖液溶解按說明稀釋成適宜濃度，生色底物加水溶解成3mmol/L溶液，臨用前再用Tris2EDTA緩沖液(pH8.4)稀釋成O.5mmol/L溶液，取干凈具塞試管置于37°C水浴中，加入對(duì)照品或供試品溶液80μI,空白管中加入ΡΗ7.4的緩沖液80μ1，再依次加入抗凝血酶III溶液80μI,Xa因子溶液160μI,生色底物CBS溶液400μI,每次加試劑后都迅速漩渦振蕩混勻，勿產(chǎn)生氣泡，分別精確保溫Imin、2min和4min，最后加入37%的醋酸600μI終止反應(yīng)，在波長405nm處測定吸收度，以對(duì)照品效價(jià)為橫坐標(biāo)，空白管減去對(duì)照管吸收值為縱坐標(biāo)做標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)供試品的吸收值差值在標(biāo)曲上查出相應(yīng)的效價(jià)值。全文摘要本發(fā)明提供了一種利用非哺乳類魚類資源制備低分子量肝素的方法，其具體步驟為從魚類組織中粗提獲得未分級(jí)肝素組分，用肝素酶降解未分級(jí)肝素，得到低分子量肝素凍干純品，采用咔唑比色法計(jì)算含量，使用高效液相質(zhì)譜聯(lián)用儀和聚丙烯酰胺凝膠電泳法分析分子量和純度，并通過羊血漿法測定抗Ⅱa效價(jià)和生色底物法測定抗Ⅹa效價(jià)對(duì)其活性進(jìn)行評(píng)價(jià)。本發(fā)明利用非哺乳類魚類資源，克服了由于哺乳動(dòng)物不同種屬之間存在的屬間交叉病毒和朊病毒感染所帶來的不利影響，并改進(jìn)酶提取方法最終獲得高凝血酶活性低分子量肝素。文檔編號(hào)C12P19/26GK103060404SQ201310003149公開日2013年4月24日申請日期2013年1月6日優(yōu)先權(quán)日2013年1月6日發(fā)明者曲輝,張春革,李萍,張永勤申請人:青島亞博生物科技有限公司