封閉的生物反應(yīng)器的制造方法
【專利摘要】本發(fā)明報道使用再循環(huán)廢氣的單次使用的封閉的生物反應(yīng)器，所述生物反應(yīng)器可在不受控制的環(huán)境中操作，其用于使用在代謝過程中產(chǎn)生二氧化碳或需要二氧化碳的基因修飾的生物培養(yǎng)物制造生物產(chǎn)物。
【專利說明】封閉的生物反應(yīng)器

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種生物反應(yīng)器設(shè)計，其可用于IS014644類別9或更高的不受控制的 環(huán)境，實質(zhì)上降低生物反應(yīng)器操作的成本；本發(fā)明報道一種完全封閉的系統(tǒng)，其中廢氣在所 述生物反應(yīng)器內(nèi)再循環(huán)并且過量的二氧化碳通過化學(xué)吸收去除，并且通過提供新鮮的氣體 供應(yīng)維持營養(yǎng)培養(yǎng)基中氧或二氧化碳的所需張力。

【背景技術(shù)】
[0002] 活性藥物實體經(jīng)常來源于生物培養(yǎng)物，包括人類和動物細(xì)胞、細(xì)菌、酵母、植物細(xì) 胞、雜交瘤以及能夠復(fù)制和進(jìn)行代謝的任何這樣的生物組合物。另外，生物實體長成器官以 及細(xì)胞和基因療法產(chǎn)物。生物實體通常使用傳統(tǒng)的生物反應(yīng)器并且近年來使用一次性生物 反應(yīng)器生長。
[0003] 生物反應(yīng)器是使用生物催化劑（生物培養(yǎng)物），例如人類和動物組織細(xì)胞、微生 物、桿狀病毒以及昆蟲細(xì)胞等將營養(yǎng)元素轉(zhuǎn)變成適用產(chǎn)物的裝置。生物反應(yīng)器的主要功能 是提供一個供生物催化劑生長以獲得所希望的產(chǎn)物的受控環(huán)境。通過針對生物反應(yīng)器的特 定設(shè)計要素而頒予的數(shù)百專利所證實，大量的生物反應(yīng)器設(shè)計是可利用的。這些年來已經(jīng) 研發(fā)多種容器和方法進(jìn)行化學(xué)、生物化學(xué)和/或生物加工。
[0004] 雖然生物反應(yīng)器系統(tǒng)和相關(guān)工藝眾所周知，但對所述系統(tǒng)和工藝的改良將適用于 制備多種由生物來源產(chǎn)生的產(chǎn)物。一種所述改良是生物反應(yīng)器的操作環(huán)境。在藥物和疫苗 制造中，需要每平方英尺不超過100, 000個0. 5 μ m粒子的IS014644類別8或類別區(qū)域分 類。為了維持此大氣質(zhì)量,空氣連續(xù)通過HEPA過濾器并且需要每小時換氣約20次。為了維 持此空氣質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，所需的HVAC系統(tǒng)、HEPA過濾器以及連續(xù)的空氣凈化增加了大量的資金 和能源成本，時常使得小公司或研究組織無法產(chǎn)生用于人類中的藥物和疫苗。例如需要每 小時1百萬立方米氣流的制造工廠，一天操作24小時，全年持續(xù)，并且利用率為$0. 135kW/ h(美國政府勞動統(tǒng)計局（Bureau of Labor Statistics，US Government)2011 年 8 月），單 單操作風(fēng)扇的成本就將超過五十萬美元。其它重大成本是HEPA過濾器，其必須周期性地更 換，總成本又增加五十萬美元。HVAC系統(tǒng)的資金成本也是很高的；對于HVAC系統(tǒng)，每平方 英尺增加大約$200。在一個100, 000平方英尺的工廠中，此給項目成本增加了約$2000萬。 雖然這些成本對于大的醫(yī)藥和生物技術(shù)公司來說并不太顯著，但這些對于無法負(fù)擔(dān)得起這 些成本的較小公司和研究機(jī)構(gòu)研發(fā)藥物來說是主要的屏障。
[0005] 還有藥物或疫苗可能需要在緊急的時候進(jìn)行制造的情況并且在那些情況下，凈化 室環(huán)境的需求阻礙研發(fā)和制造。
[0006] 對產(chǎn)生一種可在適當(dāng)凈化的環(huán)境中操作而無需昂貴的HVAC系統(tǒng)的生物反應(yīng) 器系統(tǒng)存在急迫的未滿足的需要。大氣每平方英尺具有約250萬個粒子并且室內(nèi)空氣 具有約1百萬個尺寸為〇.5μηι或更大的粒子。根據(jù)世界衛(wèi)生組織（the World Health Organization)提供的cGMP指南，室內(nèi)空氣被分為IS014644類別9或水平1 ;其也被標(biāo)記 為不受控制區(qū)域分類。需要受控環(huán)境的原因包括保護(hù)產(chǎn)物免受環(huán)境破壞以及保護(hù)工作人員 免受產(chǎn)物傷害。HVAC系統(tǒng)也防止交叉污染并且一般被認(rèn)為是保證制造的藥物安全的最重要 步驟之一。
[0007] 為了使生物反應(yīng)器在IS014644類別9環(huán)境中操作，其必須具有對于生物反應(yīng)器的 每個操作步驟將生物反應(yīng)器與環(huán)境完全密封的關(guān)鍵特征。一旦此可被驗證并且因此保證 環(huán)境與生物反應(yīng)器的內(nèi)含物之間無法有任何接觸，那么這些生物反應(yīng)器將可能在IS014644 類別9環(huán)境中操作。然而，生物反應(yīng)器需要營養(yǎng)供應(yīng)，包括氧和二氧化碳，并且在無環(huán)境污 染下維持生物反應(yīng)器內(nèi)流動是一個挑戰(zhàn)，尚未令人滿意地得以解決。
[0008] 現(xiàn)有技術(shù)指向愛克塞樂斯公司（Xcellerex)提供的系統(tǒng)（http://www. xcellerex. com/flexfactory-design. htm),所述系統(tǒng)旨在使用專有 FlexFactory 工藝流 程（process train),它包含基于廢棄物的單元操作，使交叉污染的風(fēng)險最小化。每個單元 操作封入受控環(huán)境模塊（CEM)中，所述模塊共定位在共同的受控制造空間中。CEM提供了 一個環(huán)繞設(shè)備并且對房間具有正壓力的定位凈化環(huán)境。FlexFactory CEM的環(huán)境標(biāo)準(zhǔn)是基 于傳統(tǒng)的凈化室標(biāo)準(zhǔn)。操作員站在CEM外面并且通過虹膜口接近設(shè)備入口。消除了對多個 氣鎖以及生長和再生長室的需要。雖然此系統(tǒng)提供了操作的分離，但所述計劃有瑕疵，因為 沒有明確的方式來保證系統(tǒng)中的破壞不會發(fā)生并且如果發(fā)生破壞，那么將立即污染產(chǎn)物。 此概念具有一些應(yīng)用，但管理機(jī)構(gòu)不可能允許使用FlexFactory用于生物藥物的商業(yè)化生 產(chǎn)。
[0009] 本發(fā)明提供了一種完全封閉的生物反應(yīng)器，其中所有入口都通過一個0.22微米 過濾器提供，廢氣再循環(huán)并且營養(yǎng)培養(yǎng)基出口保持密封，直到生物反應(yīng)器準(zhǔn)備用于排出。另 夕卜，需要凈化室暴露的所有那些接觸，例如引入生物培養(yǎng)物和處置制造的產(chǎn)物，都在受控環(huán) 境中進(jìn)行。
[0010] 本發(fā)明的封閉的生物反應(yīng)器可在沒有其必須定位的物理空間的FIexFactory限 制下操作，其可以具有任何尺寸（FlexFactory的限制）并且提供連續(xù)的保護(hù)防止產(chǎn)物被環(huán) 境破壞和環(huán)境被產(chǎn)物破壞。FlexFactory與本發(fā)明之間的主要差異是本發(fā)明直接保護(hù)產(chǎn)物， 而FlexFactory提供盛放產(chǎn)物的容器周圍的保護(hù)。
[0011] 本發(fā)明還報道單次使用或一次性生物反應(yīng)器。在生物反應(yīng)器設(shè)計中傳統(tǒng)的缺點(diǎn)已 經(jīng)引起一次性生物反應(yīng)器的研發(fā)。在過去數(shù)十年期間，已經(jīng)顯著朝使用一次性或單次使用 生物反應(yīng)器（SUB)方向前進(jìn)以避免交叉污染并且降低批料之間的驗證（凈化）成本；病毒 污染的風(fēng)險已經(jīng)進(jìn)一步加速這些單次使用生物反應(yīng)器的研發(fā)。單次使用生物反應(yīng)器的設(shè)計 可模擬使用具有包埋或磁性驅(qū)動的攪拌器的一次性套筒時的攪拌罐，同時使用無內(nèi)部攪拌 的搖擺運(yùn)動類型生物反應(yīng)器。盡管在此領(lǐng)域中顯著發(fā)展，但這些類型生物反應(yīng)器的利用尚 未非常成功地用于需要高氧化速率的細(xì)胞或生物體，因為需要強(qiáng)力攪拌，這是一次性系統(tǒng) 不太容易實現(xiàn)的。SUB的實例是基于波浪攪動的系統(tǒng)。參見例如美國專利6, 544, 788 ;PCT公 開案W000/66706。此類型生物反應(yīng)器可用于在單個一次性容器中培養(yǎng)相對敏感細(xì)胞，例如 CH0細(xì)胞（例如皮爾斯公司（Pierce),生物工藝學(xué)報（Bioprocessing J.) 3 :51-56 (2004))、 雜交瘤細(xì)胞（例如凌（Ling)等人，生物技術(shù)進(jìn)展（Biotech. Prog. )，19 :158-162 (2003))、 昆蟲細(xì)胞（例如維伯（Weber)，細(xì)胞技術(shù)（Cytotech. )38 :77-85(2002))和貼壁細(xì)胞（例如 辛格（Singh)，細(xì)胞技術(shù)30 :149-158(1999))。所述一次性單元相對便宜，由于其單次使用 而降低感染風(fēng)險并且無需內(nèi)部攪拌部分來促進(jìn)氣體交換。用于混合營養(yǎng)培養(yǎng)基的更常見技 術(shù)包括搖動、震蕩、振動、壓縮容器壁以及在鼓泡反應(yīng)器中，使用氣體攪拌液體。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0012] 本發(fā)明的生物反應(yīng)器容器被設(shè)計成能在不受控制的環(huán)境（IS014644類別9)中生 長所有類型的細(xì)胞和生物體。提供一種封閉的系統(tǒng)，其中可獲得充足量的養(yǎng)分和所需的氣 體，例如氧和二氧化碳。在藥物制造中大多遭遇兩種類型的反應(yīng)，一個是其中細(xì)胞或生物體 在其生長過程中產(chǎn)生二氧化碳，例如在細(xì)菌情況下，或其中細(xì)胞需要二氧化碳作為碳來源， 例如在哺乳動物細(xì)胞情況下。
[0013] 在生物體需要氧的情況下，最終產(chǎn)物時常是二氧化碳，并且用于細(xì)菌發(fā)酵的一次 性生物反應(yīng)器的設(shè)計已經(jīng)呈現(xiàn)出巨大的挑戰(zhàn)，因為其需要將極大體積的空氣或氧氣通過營 養(yǎng)培養(yǎng)基，部分用以提供氧并且部分用以去除對細(xì)菌生長不利的二氧化碳（溶于營養(yǎng)培養(yǎng) 基中的）。高水平的二氧化碳產(chǎn)物產(chǎn)生低pH值，此對細(xì)菌生長進(jìn)一步不利。室內(nèi)空氣一般 含有約0. 035 %二氧化碳，而呼出的人類空氣具有約5%二氧化碳。健康個體長時間暴露于 1. 5百分比二氧化碳將引起輕微的問題，而暴露于7百分比到10百分比二氧化碳將在幾分 鐘內(nèi)引起無意識。此是因為在較高濃度下，二氧化碳可取代空氣中的氧。由此，二氧化碳被 稱為"簡單窒息"，對制造工廠的通風(fēng)需求需要調(diào)節(jié)標(biāo)準(zhǔn)。舉例來說，ASHRAE62每平方英尺 占地面積需要至少〇. 12CFM的新鮮空氣入口。
[0014] 我們呼吸的空氣主要由四種氣體組成：氮?dú)猓?8% )、氧氣（21% )、氬氣 (0. 94% )、二氧化碳（0. 04% )。當(dāng)我們在空氣中呼吸時，身體消耗其氧氣并且將它轉(zhuǎn)變成 二氧化碳。呼出的空氣含有約4. 5百分比的二氧化碳。身體對氮?dú)饣驓鍤馕醋鋈魏问?。?于利用氧氣進(jìn)行代謝的生物體來說同樣如此。因為僅有兩種具有重要意義的氣體，氧氣和 二氧化碳，所以毫無疑問從生物反應(yīng)器的廢氣中出來，氮?dú)夂蜌鍤鉄o法再使用。這是一個創(chuàng) 造性的步驟，其中僅利用空氣中的有用組分，同時允許使用完全封閉的系統(tǒng)。
[0015] 盡管標(biāo)準(zhǔn)生物反應(yīng)器操作將廢氣排到環(huán)境中，但廢氣的開口端產(chǎn)生一種永久性的 污染生物反應(yīng)器內(nèi)含物的風(fēng)險；重要的是認(rèn)識到，當(dāng)使用一次性柔性容器作為生物反應(yīng)器 時，來自室內(nèi)的空氣可能吸入容器中；從生物反應(yīng)器排出氣體提供了可能需要使用受控環(huán) 境的污染可能性。一種解決此問題的方案是消除生物反應(yīng)器中的所有廢氣；作為替代，生 物反應(yīng)器中的空氣再循環(huán)，但在營養(yǎng)培養(yǎng)基中產(chǎn)生二氧化碳的情況下，需要從空氣再循環(huán) 去除二氧化碳。存在一種大的現(xiàn)有技術(shù)正在使用的方法，用于從空氣去除二氧化碳或從空 氣洗去二氧化碳。這些通常包括使用牛皮紙漿制法的變體。洗滌工藝可基于氫氧化鈉。 首先，二氧化碳被堿性NaOH溶液吸收以產(chǎn)生溶解的碳酸鈉。碳酸根離子通過與氫氧化鈣 (Ca(0H)2)反應(yīng)從溶液去除，產(chǎn)生方解石（CaC03)沉淀。航天飛機(jī)軌道上再生性二氧化碳去 除系統(tǒng)（RCRS)使用一種雙床裝置，其提供二氧化碳的連續(xù)去除而無消耗性產(chǎn)物?？稍偕?統(tǒng)允許在太空中更長時間停留執(zhí)行穿梭任務(wù)，而無需補(bǔ)充其吸附劑筒。不可再生的更老舊 的基于氫氧化鋰（LiOH)的系統(tǒng)正在被可再生的基于金屬氧化物的系統(tǒng)更換?；诮饘傺?化物的系統(tǒng)主要由金屬氧化物吸附劑筒和再生器組合件組成。其通過使用吸附材料去除二 氧化碳并接著使吸附材料再生來工作。金屬氧化物吸附劑通過抽吸在7. 5scfm下被加熱到 大約400° F的空氣通過其筒達(dá)10小時來再生。因為本發(fā)明是基于完全封閉的系統(tǒng)，所以 可再生的系統(tǒng)不能使用并且規(guī)定了盛放副產(chǎn)物的洗滌器裝置的設(shè)計，副產(chǎn)物一般是可回到 生物反應(yīng)器的水。
[0016] 活性碳可用作二氧化碳洗滌器。各種強(qiáng)堿，例如堿石灰、氫氧化鈉、氫氧化鉀和氫 氧化鋰，能夠通過與二氧化碳進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)來去除其。具體來說，在宇宙飛船上使用氫氧化 鋰來從大氣去除二氧化碳。其與二氧化碳反應(yīng)，產(chǎn)生碳酸鋰。
[0017] 本發(fā)明包括一種用于從在生物反應(yīng)器中產(chǎn)生的廢氣去除二氧化碳的方法，其是通 過安裝一個含有例如堿石灰的化學(xué)物質(zhì)的筒；一旦二氧化碳已經(jīng)去除，氣體就可帶回到生 物反應(yīng)器中（為了攪動溶液和在需要的情況下為了氧化）。值得注意的是，與生物反應(yīng)器 有關(guān)的唯一組分是氧和二氧化碳，并且因此操縱其水平的能力允許空氣在封閉系統(tǒng)中再循 環(huán)，因為這些是通過新鮮氣體的引入來補(bǔ)充。
[0018] 在需要一定量的二氧化碳（例如哺乳動物細(xì)胞）的生物反應(yīng)器中，不需要從廢氣 去除二氧化碳的構(gòu)件。
[0019] 營養(yǎng)培養(yǎng)基中氧張力對于許多生物反應(yīng)器來說是重要的，并且此在本發(fā)明中通過 在需要時提供通過殺菌過濾器添加氧氣（氧氣與空氣或氮?dú)獾幕旌衔铮┑臉?gòu)件來控制。遠(yuǎn) 程控制的營養(yǎng)培養(yǎng)基中的傳感器允許營養(yǎng)培養(yǎng)基在需要時氧化。在需要較高水平二氧化碳 的情況下，例如在哺乳動物細(xì)胞情況下，注入氣體可以是空氣與二氧化碳的混合物或純二 氧化碳；再次入口氣體的目的僅僅是提供這些氣體在營養(yǎng)培養(yǎng)基中的所需水平，而生物反 應(yīng)器內(nèi)氣體的再循環(huán)提供混合功能以及作為推動氣體、更尤其二氧化碳通過在再循環(huán)的循 環(huán)期間進(jìn)行化學(xué)洗滌離開的手段。
[0020] 本發(fā)明由一個容器組成，所述容器可由柔性或半柔性防水材料，優(yōu)選地塑料建造。 可針對光傳播質(zhì)量挑選塑料。某些細(xì)胞可能對亮白光或紫外線輻射敏感，并且對于這些細(xì) 胞，容器可由吸收這些波長的塑料制成。同樣地，其它種類的細(xì)胞，比如植物細(xì)胞，可通過光 的光譜質(zhì)量試驗性地調(diào)節(jié)，并且對于這些細(xì)胞，培養(yǎng)容器可由選擇性地傳播所希望的光的 波長的塑料制成。用于制造容器的材料的其它特征在培養(yǎng)各種類型的細(xì)胞或微生物中可為 重要的。容器內(nèi)部可用增加或減少細(xì)胞粘附的物質(zhì)處理，取決于所希望的培養(yǎng)條件和細(xì)胞 種類。
[0021] 在一個優(yōu)選實施例中，所述容器將由低密度聚乙烯內(nèi)層、乙烯乙烯醇?xì)怏w屏障、低 密度聚乙烯外層和由聚乙烯制成的端口形成；其將具有325μπι膜厚度，5%混濁度（ASTM D-1033)、0.4克/平方米.天的水蒸汽傳輸速率（ASTM F-1249)、0. 1立方厘米/平方 米·天·巴的氧滲透性仏5了110-3985(231：，0%冊)）、0.2立方厘米/平方米.天.巴（膜 康公司（Mocon)Permatran Ο?ν?β?,Ο^ΚΗ))的二氧化碳滲透性并且通過50KGy的最大 Y輻射劑量殺菌。袋將在4°C到40°C下使用。
[0022] 容器包含一或多個端口用作氣體或液體的入口或出口。端口由與用于建造容器的 材料相容的剛性或半剛性材料建造。在優(yōu)選實施例中，任何標(biāo)準(zhǔn)塑料管道或模制塑料都可 用于建造端口，并且其根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)焊接到容器的縫。多種這樣的端口可購得，例如用于醫(yī) 學(xué)袋和相似的容器。形成端口的結(jié)構(gòu)也可變化，例如以容納不同體積的培養(yǎng)基、高壓滅菌技 術(shù)和端口功能。
[0023] 本發(fā)明的一次性生物反應(yīng)器優(yōu)選地在使用前預(yù)殺菌。可使用各種殺菌技術(shù)。技 術(shù)的挑選部分地取決于所挑選的塑料類型（李（Lee)等人，1995,高分子生物材料手冊 (Handbook of Polymeric Biomaterials), CRC 出版社（CRC Press)，博卡拉頓（Boca Raton)，第581-597頁）。此項技術(shù)中常見的殺菌技術(shù)包括（但不限于）干熱、高壓滅菌、輻 射和環(huán)氧乙烷氣體。
[0024] 本發(fā)明的生物反應(yīng)器可通過若干構(gòu)件實體支撐。容器可通過容器頂部中在縫外部 的孔洞或通過連接到容器頂部的鉤子懸掛?；蛘撸蓪⑷嵝运芰先萜鞣湃雱傂酝獠咳萜髦?， 所述剛性外部容器包括諸如商業(yè)55加侖塑料圓筒等簡單系統(tǒng)。最終，容器可由可自身支撐 的半柔性塑料建造。
[0025] 生物反應(yīng)器可裝備有任選的幫助培養(yǎng)細(xì)胞和微生物生長的裝置。這些裝置包括 (但不限于）溫度計、氣體評價系統(tǒng)（即二氧化碳或氧氣）以及評估細(xì)胞密度的構(gòu)件和體積 校正標(biāo)記。
[0026] 空氣或其它氣體經(jīng)由進(jìn)氣口引入容器中。連接端口到氣泵的管道配備有至少一個 過濾器，以在氣體引入生物反應(yīng)器前從氣流過濾微生物。管優(yōu)選地適用于市售氣泵，限制條 件為無論在培養(yǎng)物開始生長和培養(yǎng)基密度增加后累積的背壓有多少，抽吸生物反應(yīng)器內(nèi)恒 定量的空氣。
[0027] 鼓泡器包含適當(dāng)直徑的管或圓盤，取決于待擴(kuò)散到容器中的空氣的量；鼓泡器一 般由陶瓷或氧化鋁材料、塑料、硅或金屬建造。推測鼓泡功能去除為了混合而震蕩或搖動容 器的需要。然而，在一些情況下，可能需要震蕩營養(yǎng)培養(yǎng)基的外部構(gòu)件。此可通過多種現(xiàn)有 方法，例如搖動、震蕩、旋轉(zhuǎn)、推動容器壁來提供。
[0028] 本發(fā)明進(jìn)一步包括入口端口，其用于最初用生長培養(yǎng)基填充生物反應(yīng)器或在灌注 系統(tǒng)中，用再循環(huán)的培養(yǎng)基或接種物填充。
[0029] 在容器頂部的液體端口通常連接到足夠長而到達(dá)培養(yǎng)基工作液面以下的封液管 以防止廢氣進(jìn)入此端口。此端口也可用于在發(fā)酵工藝期間（例如當(dāng)使用饋料-培養(yǎng)技術(shù) 時）添加養(yǎng)分或在灌注生物反應(yīng)器操作過程中提供去除的任何培養(yǎng)基的更換。
[0030] 值得注意的是，用以添加生物培養(yǎng)物的端口在循環(huán)結(jié)束時去除營養(yǎng)培養(yǎng)基，并且 營養(yǎng)饋料的添加是通過在另一個末端處在凈化環(huán)境中開口的管進(jìn)行；此可容易為安裝在生 物反應(yīng)器附近的層流罩。
[0031] 本發(fā)明中提供的生物反應(yīng)器可用于生長多種細(xì)胞，包括（但不限于）植物細(xì)胞、細(xì) 菌、酵母、哺乳動物細(xì)胞和昆蟲細(xì)胞。其它的應(yīng)用可見于器官生長和基于個體化醫(yī)療產(chǎn)生治 療介入術(shù)中。所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)了解，培養(yǎng)基和接種體的組成可進(jìn)行選擇以需氧培養(yǎng) 多種細(xì)胞和生物體。生長溫度、空氣流動和培養(yǎng)持續(xù)時間也可調(diào)整到適合特定細(xì)胞。其它的 調(diào)整可包括用不同的氣體通氣，例如在植物細(xì)胞情況下二氧化碳，或?qū)τ诹蚣?xì)菌是硫化氫； 或在哺乳動物細(xì)胞情況下處理生物反應(yīng)器壁以促進(jìn)細(xì)胞粘附。
[0032] 本發(fā)明不局限于以上描述和例示的實施例，而是能夠在不偏離隨附權(quán)利要求書的 范圍下變化和修改。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0033] 圖1為用于不需要去除二氧化碳的反應(yīng)的單次使用封閉生物反應(yīng)器的側(cè)視圖。
[0034] 圖2為用于需要去除二氧化碳的反應(yīng)的單次使用封閉生物反應(yīng)器的側(cè)視圖。

【具體實施方式】
[0035] 生物反應(yīng)器一般在建造和操作昂貴的IS014664類別8環(huán)境中操作。其中所有操 作都在支撐營養(yǎng)培養(yǎng)基的容器內(nèi)進(jìn)行的封閉的生物反應(yīng)器可在建造和維持廉價得多的不 太控制或IS014644類別9環(huán)境中使用。本發(fā)明提供一種擴(kuò)大生物反應(yīng)器使用并且使其更 可承受的理想解決方案。此在緊急事件中制造藥物和疫苗、研發(fā)新藥、制造臨床試驗供應(yīng)品 以及一般地以較低成本生產(chǎn)商業(yè)規(guī)模生物藥物時尤其具有價值。近來以上考慮已經(jīng)變得非 常重要，因為這些藥物的創(chuàng)新者專利到期后通用生物藥物已經(jīng)開始出現(xiàn)在市場上。通用生 產(chǎn)者必須能夠以更低廉的成本制造這些分子以進(jìn)行競爭并且本發(fā)明滿足此需要。
[0036] 在一個方面，本發(fā)明提供一種適于從預(yù)定體積的營養(yǎng)培養(yǎng)基制備生物產(chǎn)物，同時 在IS014664類別9環(huán)境中操作的生物反應(yīng)器，以及相關(guān)使用方法。更具體地說，本發(fā)明提 供一種設(shè)備和方法，它在所述設(shè)備無論生物培養(yǎng)物的性質(zhì)如何都可用于制備生物產(chǎn)物的意 義上為通用的。
[0037] 最初轉(zhuǎn)到圖1，說明本發(fā)明生物反應(yīng)器的一優(yōu)選實施例。在此實施例中，說明一種 優(yōu)選的容器1，此容器內(nèi)部包含營養(yǎng)培養(yǎng)基2、至少一個鼓泡構(gòu)件4所連接的新鮮空氣入口 18、通過新鮮空氣入口的新鮮氣體來源8、安置在進(jìn)氣口 18與新鮮空氣入口 8之間的氣體殺 菌過濾器7以及在進(jìn)氣口 18與殺菌過濾器7之間的旋塞閥12、通過入口 5連接到營養(yǎng)培養(yǎng) 基來源的液體端口 17、安置在入口 5與液體端口 17之間的液體培養(yǎng)基殺菌過濾器6以及安 置在殺菌過濾器6與液體端口 17之間的旋塞閥12。廢氣通過出氣口 11逸出并且通過使 用蠕動泵9移動，并且通過旋塞閥12,用于通過進(jìn)氣口 18和鼓泡器4再循環(huán)。一組用以監(jiān) 測二氧化碳或氧的傳感器3和10安置在容器1中和出氣口 11中；所述容器具有支撐表面 15,支撐表面15又支撐在立柱14上。提供一種加熱構(gòu)件13,其連接到支撐表面15的下表 面。
[0038] 圖2展示圖1中所有特征的細(xì)節(jié)，具有額外的特征，所述額外的特征包含安裝在出 氣口 11與進(jìn)氣口 18之間的二氧化碳洗滌器19。
[0039] 正如前面所提及，希望容器包括一或多個傳感器或探針，用于監(jiān)測容器內(nèi)部的一 或多個工藝參數(shù)，例如比如細(xì)胞密度、溫度、壓力、pH值、溶解氧（D0)、溶解二氧化碳（DC0 2)、 混合速率以及氣體流動速率。希望DO、pH值以及DC02的傳感器是光學(xué)傳感器，其中開頭 兩個更希望是一次性的（例如加利福尼亞州圣克拉拉市芬尼斯溶液有限公司（Finesse Solutions LLC，Santa Clara，California)的 TruFluor 傳感器或馬薩諸塞州 01775 斯托 市福魯米斯公司（Fluorometrix Corporation，Stow，Massachusetts)的 CellPhase 傳感 器）。每個傳感器都意圖與用于計算和控制各種參數(shù)以及顯示和用戶界面的計算機(jī)執(zhí)行的 控制系統(tǒng)（例如計算機(jī)）通信。此類控制系統(tǒng)也可包括電子、機(jī)械和/或氣動系統(tǒng)的組合 以按要求控制以上提及的加工參數(shù)，從而穩(wěn)定化或控制參數(shù)（例如pH值可通過添加 C02或 氨調(diào)節(jié)）。應(yīng)了解控制系統(tǒng)可執(zhí)行其它功能并且本發(fā)明不局限于具有任何具體功能或成組 功能。
[0040] 本文所述的一或多種控制系統(tǒng)可以多種方式執(zhí)行，例如使用專用硬件和/或韌 件，使用處理器，所述處理器使用微碼或軟件編程序，以執(zhí)行上述功能或上述功能任何適合 的組合。
[0041] 加工裝置也可與可調(diào)節(jié)工藝參數(shù)到預(yù)定可接受水平的各種裝置通信，比如啟動加 熱器、啟動進(jìn)氣口閥以調(diào)節(jié)氧或co 2水平、啟動出氣口閥以降低頂部空間中的氣體壓力等 等。
[0042] 或者，本發(fā)明可缺乏任何傳感器以及對通過端口 16收集的樣品進(jìn)行的培養(yǎng)基特 征的測量，端口 16也用以引入生物培養(yǎng)物在容器1中并且在生物反應(yīng)循環(huán)結(jié)束時去除營養(yǎng) 培養(yǎng)基。值得注意的是，端口 16需要足夠長的延長以允許傳遞用于測試或進(jìn)一步加工的營 養(yǎng)培養(yǎng)基到受控環(huán)境，可能IS014644類別7或較低。
[0043] 本文所述的生物反應(yīng)器適用于從預(yù)定體積的營養(yǎng)培養(yǎng)基產(chǎn)生生物產(chǎn)物。在一個相 關(guān)實施例中，本發(fā)明提供一種方法，其涵蓋提供如本文中描述的生物反應(yīng)器，用營養(yǎng)培養(yǎng)基 填充每個容器；啟動選擇性地鼓泡的過濾器和加熱或冷卻裝置，添加生物培養(yǎng)物并且允許 生物反應(yīng)器靜置特定時間，以預(yù)定時間間隔檢測容器中營養(yǎng)培養(yǎng)基中的細(xì)胞密度；以及當(dāng) 容器中營養(yǎng)培養(yǎng)基中的細(xì)胞密度到達(dá)預(yù)定值時從生物反應(yīng)器去除營養(yǎng)培養(yǎng)基和由此產(chǎn)生 的生物產(chǎn)物。廢氣通過容器再循環(huán)，同時補(bǔ)充適當(dāng)量的氧或二氧化碳；當(dāng)生物反應(yīng)中產(chǎn)生二 氧化碳時，提供二氧化碳洗滌器以從廢氣去除二氧化碳。
[0044] 本發(fā)明生物反應(yīng)器和相關(guān)方法的優(yōu)點(diǎn)之一為操作生物反應(yīng)器所需的環(huán)境控制的 成本降低。與這些操作一般需要的類別8環(huán)境相對比，本發(fā)明可在IS014644類別9環(huán)境中 操作。
[0045] 相對降低的量的引入的氣體（相對于已知的工藝）具有在容器的頂部空間中產(chǎn)生 更少的紊流和泡沫的進(jìn)一步優(yōu)點(diǎn)。
[0046] 每個容器都具備亞微米過濾器，所述亞微米過濾器幫助維持營養(yǎng)培養(yǎng)基和引入 的氣體的無菌性。過濾器可具有任何適合的尺寸和孔隙率，但優(yōu)選是具有約〇. 3 μ m到約 0. 1 μ m并且更優(yōu)選地約0. 22 μ m的平均孔隙率的HEPA過濾器。
[0047] 一般說來，本發(fā)明提供生物反應(yīng)器和方法，它們在本發(fā)明適合和可適用于加工多 種組合物，包括生物與非生物組分的意義上為通用的。實際上，為適用于哺乳動物細(xì)胞而設(shè) 計的本發(fā)明的生物反應(yīng)器比如可用于培養(yǎng)細(xì)菌，使制造容易。
[0048] 歷史上，通過首先利用離心或過濾工藝去除生物培養(yǎng)物，將在營養(yǎng)培養(yǎng)基中表達(dá) 的生物產(chǎn)物與培養(yǎng)基分離。在此步驟后為減少培養(yǎng)基體積到約1/10到1/20,使得在合理時 間內(nèi)將營養(yǎng)培養(yǎng)基裝載在純化柱上成為可能。雖然這些工藝步驟已經(jīng)廣泛地驗證并且運(yùn)行 很好，但使用這些步驟的實用性在要處置大體積培養(yǎng)基時變得很難?，F(xiàn)在，生物反應(yīng)器一次 加工上千升并且甚至幾十萬升培養(yǎng)基并不罕見。為了容納此，公司使用非常大規(guī)模的過濾 和體積減小方法，這些耗費(fèi)數(shù)百萬美元來安裝并且又耗費(fèi)數(shù)百萬美元來操作和維持。對以 下存在極大的未被滿足的需要，即簡化這些工藝、降低生產(chǎn)成本以及使無法擔(dān)負(fù)得起如此 大的投資的數(shù)千研究人員和較小公司可使用所述技術(shù)?？朔@些工藝的障礙也將使得能夠 基于這些生物藥物產(chǎn)生制造更廉價的藥物并且因此提高全世界無法擔(dān)負(fù)得起這些藥物的 上億人的負(fù)擔(dān)能力。
[0049] 本發(fā)明的關(guān)鍵在于根據(jù)背道而馳的教示。雖然所有制造商都根據(jù)上述包括從準(zhǔn)備 純化的發(fā)酵液去除組分的途徑，但檢驗首先去除目標(biāo)生物產(chǎn)物作為替代并且棄去不需要的 東西的實用性將是謹(jǐn)慎的，而不是如目前所實施的，逐步去除不需要的東西。
[0050] 本發(fā)明利用能夠大量結(jié)合生物產(chǎn)物的許多樹脂的新近可用性。大部分現(xiàn)代樹脂每 毫升樹脂將結(jié)合20_125mg之間的生物產(chǎn)物。許多這些樹脂對生物產(chǎn)物具有高度特異性并 且其中多者可組合以通過物理化學(xué)結(jié)合的簡單過程從溶液去除任何類型和數(shù)量的生物產(chǎn) 物，所述物理化學(xué)結(jié)合足夠強(qiáng)烈以保留連接到樹脂的生物產(chǎn)物，而營養(yǎng)培養(yǎng)基從生物反應(yīng) 器去除。所屬領(lǐng)域也已經(jīng)在生物產(chǎn)物純化領(lǐng)域得到顯著發(fā)展，其中現(xiàn)在具有優(yōu)良得多的通 過調(diào)節(jié)pH值、離子強(qiáng)度或洗脫緩沖液的其它特征以打破樹脂與生物產(chǎn)物之間的結(jié)合從樹 脂洗脫這些結(jié)合的生物產(chǎn)物的能力。此允許生物產(chǎn)物呈高度濃縮溶液形式從生物反應(yīng)器去 除，準(zhǔn)備用于進(jìn)一步純化并且在一些情況下，其甚至可為最終使用產(chǎn)物。
[0051] 親和色譜法是基于分子構(gòu)象的一種分離技術(shù)，其經(jīng)常利用專用的樹脂。這些樹脂 具有連接到其表面的配體，所述配體對待分離的化合物具有特異性。最經(jīng)常地，這些配體以 類似于抗體-抗原相互作用的方式起作用。配體與其目標(biāo)化合物之間的此"鎖和鑰匙"配 合使其具有高度特異性。
[0052] 許多膜蛋白是糖生物產(chǎn)物并且可通過凝集素親和色譜法來純化。清潔劑溶解的蛋 白質(zhì)可以被允許結(jié)合到色譜樹脂，所述樹脂已經(jīng)被改性以具有共價連接的凝集素。
[0053] 免疫親和色譜樹脂采用抗體與目標(biāo)生物產(chǎn)物的特異性結(jié)合以選擇性地純化生物 產(chǎn)物。程序包括將抗體固定到柱材料，接著選擇性地結(jié)合生物產(chǎn)物，而所有其它東西流過。
[0054] 溶解后的內(nèi)含體暴露了疏水基，而變性蛋白上殘存能夠結(jié)合于樹脂的化學(xué)基團(tuán) (辛格（Singh)和潘達(dá)（Panda)，2005)，允許這些蛋白質(zhì)在再折疊到天然狀態(tài)的階段期間分 離。
[0055] -些現(xiàn)行技術(shù)樹脂結(jié)合技術(shù)包括：
[0056] a.諾維信（Novozyme)的新專利雙重親和力多肽技術(shù)平臺用相似但一次性的技術(shù) 更換蛋白質(zhì)A工藝步驟。
[0057] b.刺激反應(yīng)性聚合物能夠復(fù)合和操縱生物產(chǎn)物并且允許控制聚合物和生物產(chǎn)物 復(fù)合物溶解性，此使得在無離心或蛋白質(zhì)A培養(yǎng)基（來自密理博公司（Millipore Corp.)) 下直接捕捉產(chǎn)物。
[0058] c.混合模式吸附劑更換傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)A和離子交換，以提高選擇性和容量并且滯 留時間較短。這些具有新穎的化學(xué)作用的培養(yǎng)基包括疏水電荷誘導(dǎo)色譜，例如MEP，以及來 自帕爾公司（Pall Corp.)的 Q和 S HyperCel。
[0059] d.莫諾利斯（Monoliths)，包括色譜介質(zhì)作為單件均相柱，例如來自必藹公司 (BIA Separations)的對流相互作用介質(zhì)整體式柱（Convective Interaction Media monolithic column)〇
[0060] e.模擬的移動床，包括多層柱逆流色譜，例如來自塔彭生物系統(tǒng)公司（Tarpon Biosystems)的 BioSMB。
[0061] f.蛋白質(zhì)G(多個供應(yīng)商）。
[0062] g. IgG的單域駱駝來源（駱駝科）抗體，例如來自巴克公司（BAC)的 CaptureSelect〇
[0063] h.新的無機(jī)配體，包括合成染料，例如來自普美替克生物科學(xué)公司（Prometic Biosciences)的 Mabsorbent A1P 和 A2P〇
[0064] i.膨脹床吸附色譜系統(tǒng)，例如來自前沿色譜公司（Upfront Chromatography)的 Rhobust 平臺。
[0065] j.超耐久的氧化锫結(jié)合的親和配體色譜介質(zhì)，來自佐克公司（ZirChrom Separations)〇
[0066] k. Fc-受體模擬配體，來自特諾格公司（Tecnoge)。
[0067] 1. ADSEPT (先進(jìn)分離技術(shù)），來自尼薩膜技術(shù)公司（Nysa Membrane Technologies)〇
[0068] m.膜親和純化系統(tǒng)，來自普瑞法姆技術(shù)公司（PurePharm Technologies)。
[0069] η.專門設(shè)計的用于親和色譜的肽配體，來自普美替克生物科學(xué)公司（Prometic Biosciences)、達(dá)克斯公司（Dyax)以及其它公司。
[0070] 〇.蛋白質(zhì)A和G涂布的磁性珠粒，例如來自英杰公司（Invitrogen)/達(dá)尼爾公司 (Dynal)〇
[0071] p.新的親和純化方法，其基于生物產(chǎn)物或作為融合生物產(chǎn)物的MAb的表達(dá)，所述 產(chǎn)物具有對色譜介質(zhì)具有親和力的可去除部分（標(biāo)簽），例如羅氏公司（Roche)(基因泰克 公司（genentech))許可的組氨酸標(biāo)簽。
[0072] q.發(fā)展中的蛋白質(zhì)A替代物，包括反向膠束（脂質(zhì)體）、液體-營養(yǎng)介質(zhì)提取系統(tǒng)、 結(jié)晶、固定金屬親和色譜以及新穎的膜色譜系統(tǒng)。
[0073] r.具有一次性組分的即插即用溶液（例如ReadyToProcess)、具有實驗設(shè)計能力 的工藝開發(fā)AKTA以及多層柱連續(xù)捕捉，來自通用電氣醫(yī)療集團(tuán)（GE Healthcare)。
[0074] 令人驚訝的是，雖然在可用于捕捉生物產(chǎn)物的樹脂的設(shè)計上已經(jīng)有了巨大的發(fā) 展，但是這些樹脂僅用于純化的下游加工。將樹脂添加到生物產(chǎn)物與宿主細(xì)胞的粗混合物 中與簡單地濃縮相同培養(yǎng)基并且在所有雜質(zhì)都在其中的情況下將其裝載到柱上的當(dāng)前工 藝沒有不同。唯一的差異將是，當(dāng)在生物反應(yīng)循環(huán)結(jié)束時實踐時，此將需要足夠樹脂來結(jié)合 幾乎全部生物產(chǎn)物。針對產(chǎn)生lmg/mL蛋白質(zhì)并且所用樹脂的結(jié)合能力是50mg/mL的細(xì)胞 系，當(dāng)操作1000L生物反應(yīng)器時，此將需要20L樹脂。適于制造單克隆抗體的樹脂的成本可 在每升$15-$20, 000范圍內(nèi)，例如蛋白質(zhì)A。因此，大部分制造商寧愿使用較小量的樹脂進(jìn) 行若干子批料的純化。然而，考慮到這些樹脂可使用數(shù)百次，成本容易分?jǐn)偸褂貌⑶冶苊饬?子批料制備中冗長的調(diào)控障礙。
[0075] 雖然在工藝處理結(jié)束時添加較大量的樹脂，但如果使用其中用樹脂捕捉更換經(jīng)典 的灌注方法的本發(fā)明，那么這些添加隨時間散布。通過在生物反應(yīng)進(jìn)行時添加各種量的樹 月旨，從營養(yǎng)培養(yǎng)基去除所表達(dá)蛋白質(zhì)。重要的是在任何給定時間添加的樹脂的量都不超過 所需，因為如果所用樹脂具有非特異性結(jié)合特性，那么營養(yǎng)培養(yǎng)基中的其它組分也會不可 避免地?fù)p失在樹脂中。如果使用免疫親和或特異性結(jié)構(gòu)樹脂，例如蛋白質(zhì)A，那么不會出現(xiàn) 這種情況。如果養(yǎng)分不可避免地?fù)p失于樹脂中，那么應(yīng)在將樹脂添加到生物反應(yīng)器的同時 更換這些養(yǎng)分。當(dāng)在生物反應(yīng)過程期間使用樹脂結(jié)合蛋白質(zhì)時需要謹(jǐn)慎一些，因為這些蛋 白質(zhì)必須恰當(dāng)?shù)貧⒕?。因此，可有利地使用更具特異性的結(jié)合樹脂，其可在通過Y輻射對 容器進(jìn)行殺菌期間添加。
[0076] 另外，本發(fā)明的一個實施例可通過以下來實施：使用最便宜的樹脂來普遍性地結(jié) 合所有可溶性有機(jī)組分，并且接著在洗脫型態(tài)無關(guān)下立即使用緩沖液洗脫其以分離這些組 分。所述通用樹脂非常廉價并且甚至可不必再使用。
[0077] 本發(fā)明提供一種在產(chǎn)生生物產(chǎn)物的相同生物反應(yīng)器中收獲和純化生物產(chǎn)物的方 法。
[0078] 應(yīng)用
[0079] 在本發(fā)明中，包含非生物組分的組合物包括（但不限于）包含以下的組合物：微載 體（例如聚合物球、實心球、凝膠粒子、微珠粒和微盤，其可為多孔或無孔的）、帶有特定化 學(xué)基團(tuán)（例如叔氨基）的交聯(lián)珠粒（例如葡聚糖）、包括捕集在無孔聚合物纖維中的細(xì)胞的 2D微載體、3D載體（例如載體纖維、空心纖維、多筒反應(yīng)器以及可包含多孔纖維的半透膜）、 離子交換能力降低的微載體、細(xì)胞、毛細(xì)管以及聚集體（細(xì)胞聚集體）。
[0080] 可根據(jù)本發(fā)明加工的生物組分描述于隨后段落中并且包括（但不限于）來源于例 如以下來源的細(xì)胞培養(yǎng)物：動物（例如倉鼠、小鼠、豬、兔、犬、魚、蝦、線蟲以及人類）、昆蟲 (例如蛾和蝴蝶）、植物（例如藻、玉米、番茄、稻米、小麥、大麥、苜蓿、甘蔗、大豆、馬鈴薯、 萵苣、羽葉豆、煙草、油菜籽（柯羅納（canola))、向日葵、蕪菁、甜菜糖蜜、種子、紅花以及花 生）、細(xì)菌、真菌以及酵母。
[0081] 例示性動物細(xì)胞包括中國倉鼠卵巢（CH0)、小鼠骨髓瘤、M0035(NS0細(xì)胞系）、雜 交瘤（例如與骨髓瘤腫瘤細(xì)胞融合的B-淋巴細(xì)胞）、幼倉鼠腎（BHK)、猴C0S、非洲綠猴腎 上皮細(xì)胞（VER0)、小鼠胚胎成纖維細(xì)胞（NIH-3T3)、小鼠結(jié)締組織成纖維細(xì)胞（L929)、牛 主動脈內(nèi)皮細(xì)胞（BAE-1)、小鼠骨髓瘤成淋巴細(xì)胞樣（NS0)、小鼠 B細(xì)胞淋巴瘤成淋巴細(xì)胞 樣（WEHI231)、小鼠淋巴瘤成淋巴細(xì)胞樣（YAC1)、小鼠成纖維細(xì)胞（LS)、小鼠肝臟細(xì)胞（例 如MC/9、NCTC克隆1469)以及大鼠肝臟細(xì)胞（例如ARL-6、BRL3A、H4S、Phil (來自Fu5細(xì) 胞））。
[0082] 例示性人類細(xì)胞包括視網(wǎng)膜細(xì)胞（PER-C6)、胚腎細(xì)胞（HEK-293)、肺成纖維細(xì)胞 (MRC-5)、宮頸上皮細(xì)胞（HELA)、二倍體成纖維細(xì)胞（WI38)、腎上皮細(xì)胞（HEK293)、肝上皮 細(xì)胞（HEPG2)、淋巴瘤成淋巴細(xì)胞樣細(xì)胞（Namalwa)、白血病成淋巴細(xì)胞樣細(xì)胞（HL60)、骨 髓瘤成淋巴細(xì)胞樣細(xì)胞（U266B1)、成神經(jīng)細(xì)胞瘤成神經(jīng)細(xì)胞（SH-SY5Y)、二倍體細(xì)胞系細(xì) 胞（例如脊髓灰質(zhì)炎病毒的傳播）、郎格罕氏島細(xì)胞（pancreatic islet cell)、胚胎干細(xì) 胞（hES)、人類間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC，其可分化成比如生骨、軟骨形成、生腱、生肌、生脂以及 骨髓基質(zhì)系）、人類神經(jīng)干細(xì)胞（NSC)、人類組織細(xì)胞淋巴瘤成淋巴細(xì)胞樣細(xì)胞（U937)以及 人類肝細(xì)胞，例如WRL68 (來自胚細(xì)胞）、PLC/PRF/5 ( S卩，含有乙型肝炎序列）、Hep3B ( S卩，產(chǎn) 生血漿蛋白：纖維蛋白原、胎蛋白、運(yùn)鐵蛋白、白蛋白、互補(bǔ)C3和/或α-2-巨球蛋白） 以及！fepG2 (即，產(chǎn)生血漿蛋白：凝血酶原、抗凝血酶III、α -胎蛋白、互補(bǔ)C3和/或纖維蛋 白原）。
[0083] 來自昆蟲（例如桿狀病毒和草地夜蛾（Spodoptera frugiperda)卵巢（Sf21細(xì)胞 產(chǎn)生Sf9細(xì)胞系））的細(xì)胞和來自植物或食品的細(xì)胞也可根據(jù)本發(fā)明進(jìn)行培養(yǎng)。來自例如 稻米（例如水稻（Oryza sativa)、水稻栽培品種孟加拉愈傷組織培養(yǎng)（Oryza sativa cv Bengal callus culture)以及水稻栽培品種臺北 309 (Oryza sativa cv Taipei309))、 大豆（例如大豆栽培品種威廉82(Glycine max cv Williams82))、番茄（西紅柿栽培 品種瑞光（Lycopersicum esculentum cv Seokwang))以及煙葉（例如根癌土壤桿菌 (Agrobacterium tumefaciens)，包括嫩黃2 (BY-2)、普通煙草（Nicotiana tabacum)栽培品 種NT-1、普通煙草栽培品種BY-2以及普通煙草栽培品種SR-1)的來源的細(xì)胞是例示性實 例。
[0084] 細(xì)菌、真菌或酵母也可根據(jù)本發(fā)明培養(yǎng)。例示性細(xì)菌包括沙門氏菌屬 (Salmonella)、大腸桿菌（Escherichia coli)、霍亂弧菌（Vibrio cholerae)、枯草 桿菌（Bacillus subtilis)、鏈霉菌（Streptomyces)、突光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens)、惡臭假單胞菌（Pseudomonas putida)、假單胞菌屬（Pseudomonas sp)、紅 球菌屬（Rhodococcus sp)、鏈霉菌屬（Streptomyces sp)和產(chǎn)喊菌屬（Alcaligenes sp)。 可培養(yǎng)來自例如黑曲霉菌（Aspergillus niger)和里氏木霉（Trichoderma reesei)的物 種的真菌細(xì)胞，并且酵母細(xì)胞可包括來自多形漢遜酵母（Hansenula polymorpha)、甲醇酵 母、釀酒酵母、與貝酵母（S. bayanus)雜交的釀酒酵母、與來自乳酸克魯維酵母（K. lactis) 的LAC4和LAC1-2基因雜交的釀酒酵母、與施柔曲霉（Aspergillus shirousamii)雜 交的釀酒酵母、枯草桿菌、淀粉酶酵母（Saccharomyces diastasicus)、西方許旺酵母 (Schwanniomyces occidentalis)、具有來自樹干畢赤酵母（Pichia stipitis)的基因的釀 酒酵母以及粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe)。
[0085] 產(chǎn)物
[0086] 多種不同的產(chǎn)物也可根據(jù)本發(fā)明產(chǎn)生。例示性產(chǎn)物包括蛋白質(zhì)（例如抗體和酶）、 疫苗、病毒產(chǎn)物、激素、免疫調(diào)節(jié)劑、代謝物、脂肪酸、維生素、藥物、抗生素、細(xì)胞以及組織。 蛋白質(zhì)的非限制性實例包括人類組織纖維蛋白溶酶原活化因子（tPA)、凝血因子、生長因子 (例如細(xì)胞因子，包括干擾素和趨化因子）、粘著分子、蛋白質(zhì)Bcl-2家族、多角體蛋白、人類 血清白蛋白、scFv抗體片段、人類紅細(xì)胞生成素、小鼠單克隆重鏈7、小鼠 IgG2b/k、小鼠 IgGl、 重鏈mAb、布榮?。˙ryondin)l、人類介白素-2、人類介白素-4、篦麻毒素、人類α?-抗胰 蛋白酶、biscFv抗體片段、免疫球蛋白、人類粒細(xì)胞、刺激因子（hGM-CSF)、乙型肝炎表面抗 原（HBsAg)、人類溶菌酶、IL-12以及針對HBsAg的mAb。血漿蛋白的實例包括纖維蛋白原、 α -胎蛋白、運(yùn)鐵蛋白、白蛋白、互補(bǔ)C3和α-2-巨球蛋白、凝血酶原、抗凝血酶III、α -胎 蛋白、互補(bǔ)C3和纖維蛋白原、胰島素、乙型肝炎表面抗原、尿酸氧化酶、升糖素、粒細(xì)胞-巨 噬細(xì)胞群落刺激因子、水蛭素/地西盧定（desirudin)、血管抑制素、彈性蛋白酶抑制劑、 內(nèi)皮抑制素、表皮生長因子類似物、胰島素樣生長因子-1、舒血管素抑制劑、α 1-抗胰蛋白 酶、腫瘤壞死因子、膠原蛋白結(jié)構(gòu)域（而不是整個膠原蛋白醣蛋白）、無代謝副產(chǎn)物的蛋白 質(zhì)、人類白蛋白、牛白蛋白、凝血調(diào)節(jié)蛋白、運(yùn)鐵蛋白、血友病Α的因子VIII (S卩，來自CH0或 BHK細(xì)胞）、因子VIIa( S卩，來自BHK)、血友病B的因子IX( S卩，來自CH0)、人類分泌的堿性 磷酸酶、抑肽酶、組織胺、白三烯、IgE受體、N-乙?；咸前坊D(zhuǎn)移酶-III以及抗血友病因 子 VIII。
[0087] 酶可由多種來源使用本發(fā)明產(chǎn)生。所述酶的非限制性實例包括來自酵母的 YepACT-AMY-ACT_X24 雜交酶、米曲霉（Aspergillus oryzae) α -淀粉酶、木聚糖酶、 尿激酶、組織纖維蛋白溶酶原活化因子（rt-PA)、牛凝乳酶、葡糖腦苷脂酶（高雪氏病 (Gauchei^ s disease)的治療酶，來自CH0)、乳糖酶、胰蛋白酶、抑肽酶、人類乳鐵傳遞蛋 白、溶菌酶以及油質(zhì)蛋白。
[0088] 疫苗也可使用本發(fā)明產(chǎn)生。非限制性實例包括用于以下的疫苗：前列腺癌、人類乳 頭狀瘤病毒、病毒性流感、三價血凝素流感、AIDS、HIV、瘧疾、炭疽、細(xì)菌性腦膜炎、雞痘、霍 舌U白喉、流感嗜血桿菌類型B、甲型肝炎、乙型肝炎、百日咳、瘟疫、肺炎球菌肺炎、脊髓灰質(zhì) 炎、狂犬病、人類狂犬病、破傷風(fēng)、傷寒、黃熱病、獸醫(yī)學(xué)FMD、紐卡斯?fàn)柺喜。∟ew Castle' s Disease)、口蹄疫、DNA、委內(nèi)瑞拉馬腦炎病毒（Venezuelan equine encephalitis virus)、 癌癥（結(jié)腸癌）疫苗（即，預(yù)防或治療）、MMR(麻疹、腮腺炎、風(fēng)疹）、黃熱病、流感嗜血桿 菌（Hib)、DTP(白喉和破傷風(fēng)疫苗，具有百日咳亞單位）、連接到多醣的疫苗（例如Hib、 奈瑟菌屬腦膜炎球菌（Neisseria meningococcus))、肺炎葡萄球菌（Staphylococcus pneumoniae)、煙堿、多發(fā)性硬化、牛海綿狀腦（瘋牛?。gGl (膦酸酯）、IgM(神經(jīng)肽半抗 原）、SIgA/G (變異鏈球菌黏附素）、scFv-布瑞?。╞ryodin) 1免疫毒素（CD-40)、IgG(HSV)、 LSC(HSV)、諾沃克病毒（Norwalk virus)、人類細(xì)胞巨大病毒、輪狀病毒、呼吸道合胞體病毒 F、胰島素依賴性自體免疫糖尿病、腹瀉、鼻病毒、單純皰疹病毒以及個性化癌癥疫苗，例如 用于淋巴瘤治療（即，以可注射、口服或可食用形式）。也可產(chǎn)生重組亞單位疫苗，例如乙型 肝炎病毒包膜蛋白、狂犬病毒醣蛋白、大腸桿菌熱不穩(wěn)定腸毒素、諾沃克病毒衣殼蛋白、糖 尿病自身抗原、霍亂毒素 B亞單位、霍亂毒素 B (-種dA2亞單位）、輪狀病毒腸毒素以及腸 產(chǎn)毒性大腸桿菌、菌毛抗原融合以及豬傳染性胃腸炎病毒醣蛋白S。
[0089] 也可產(chǎn)生病毒產(chǎn)物。病毒產(chǎn)物的非限制性實例包括辛德畢斯（sindbis)、VSV、瘤、 甲型肝炎、回科魚病毒、RSV、冠狀病毒、FMDV、狂犬病、脊髓灰質(zhì)炎、呼腸孤病毒、麻疹以及腮 腺炎。
[0090] 激素也可使用本發(fā)明產(chǎn)生。激素的非限制性實例包括生長激素（例如人類生長激 素（hGH)和牛生長激素）、生長因子、β和γ干擾素、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF)、生長抑素、 血小板衍生生長因子（PDGF)、促濾泡激素（FSH)、黃體化激素、人類絨膜激素以及紅細(xì)胞生 成素。
[0091] 也可產(chǎn)生免疫調(diào)節(jié)劑。免疫調(diào)節(jié)劑的非限制性實例包括干擾素（例如β -干擾素 (用于多發(fā)性硬化）、α-干擾素以及Υ-干擾素）和介白素（例如IL-2)。
[0092] 也可產(chǎn)生代謝物（例如紫草素和太平洋紫杉醇）和脂肪酸（即，包括直鏈（例如 己二酸、壬二酸、2-羥基酸）、分支鏈（例如10-甲基十八烷酸和視黃酸）、含環(huán)脂肪酸（例 如茼蒿酸和硫辛酸）以及復(fù)合脂肪酸（例如脂肪酰基-CoA))。
[0093] 器官生長、細(xì)胞以及基因療法。
[0094] 生物反應(yīng)器組合件
[0095] 適用于本發(fā)明的各實施例的容器可具有適于含有營養(yǎng)培養(yǎng)基的任何尺寸。舉例 來說，容器可具有 1-40L、40-100L、100-200L、200-300L、300-500L、500-750L、750-1，000L、 1，000-2, 000L、2, 000-5, 000L或5, 000-10, 000L之間的體積。在一些情況下，容器具有超過 1L的體積，或在其它情況下，超過10L、20L、40L、100L、200L、500L或1，000L。超過10, 000L 的體積也是可能的。優(yōu)選地，容器體積將介于約1L與1000L之間，并且更優(yōu)選地在約5L與 500L之間，并且甚至更優(yōu)選地5L與200L之間。
[0096] 希望與營養(yǎng)培養(yǎng)基或由此提供的產(chǎn)物接觸的生物反應(yīng)器的組件和本文所述的其 它裝置包含生物相容性材料，更希望是生物相容性聚合物，并且優(yōu)選地是可殺菌的。
[0097] 還應(yīng)了解本文所述的許多組件也希望是柔性的，例如容器希望包含柔性生物相容 性聚合物容器（例如可折疊的袋），其中也希望管道包含此類生物相容性聚合物。進(jìn)一步希 望柔性材料是證明是USP類別VI的材料，例如硅酮、聚碳酸酯、聚乙烯以及聚丙烯。柔性材 料的非限制性實例包括聚合物，例如聚乙烯（例如線性低密度聚乙烯和超低密度聚乙烯）、 聚丙烯、聚氯乙烯、聚二氯乙烯、聚偏二氯乙烯、乙烯乙酸乙烯酯、聚碳酸酯、聚甲基丙烯酸 酯、聚乙烯醇、耐綸、硅酮橡膠、其它合成橡膠和/或塑料。必要時，柔性容器的部分可包含 實質(zhì)上剛性材料，例如剛性聚合物（例如高密度聚乙烯）、金屬和/或玻璃。
[0098] 希望容器包含生物相容性材料，更希望是生物相容性聚合物。當(dāng)選擇可折疊容器 進(jìn)行使用時，容器可通過支撐結(jié)構(gòu)的內(nèi)表面支撐或可內(nèi)襯其，例如具有容器保持側(cè)壁的外 部支撐外殼。然而，本發(fā)明可使用不可折疊或剛性容器或管道實施。
[0099] 容器可具有適于保持營養(yǎng)培養(yǎng)基于其內(nèi)的任何厚度，并且可設(shè)計成具有在操作期 間或在處理時一定的抗刺穿性。舉例來說，容器壁可具有小于或等于250密耳（1密耳是 25. 4微米）、小于或等于200密耳、小于或等于100密耳、小于或等于70密耳（1密耳是25. 4 微米）、小于或等于50密耳、小于或等于25密耳、小于或等于15密耳或小于或等于10密耳 的總厚度。在某些實施例中，容器可包括一個以上材料層，其可層壓在一起或以其它方式彼 此連接以給予容器某些性質(zhì)。舉例來說，一層可由實質(zhì)上氧不能滲透的材料形成。另一層 可由給予容器強(qiáng)度的材料形成?？砂ㄓ忠粚右越o予容器中可含有的流體抗化學(xué)性。
[0100] 因此應(yīng)了解容器可由任何適合的層組合形成。容器（例如可折疊的袋）可包括比 如1層、大于或等于2層、大于或等于3層或超過等于5層材料。每一層可具有比如小于或 等于200密耳、小于或等于100密耳、小于或等于50密耳、小于或等于25密耳、小于或等于 15密耳、小于或等于10密耳、小于或等于5密耳或小于或等于3密耳或其組合的厚度。 [0101] 另外，容器優(yōu)選地是無縫的，從而提高其強(qiáng)度并且避免生長細(xì)胞沉積在培養(yǎng)基中。
[0102] 另外，容器優(yōu)選地是圓柱形，以保持鼓泡過濾器與容器外壁之間的距離。
[0103] 也希望容器全部或部分是半透明的，或更希望是透明的，以允許觀察容器內(nèi)部的 內(nèi)含物。當(dāng)希望照射容器內(nèi)的營養(yǎng)培養(yǎng)基時后者是優(yōu)選的。
[0104] 本文中所引用的所有參考文獻(xiàn)，包括公開案、專利申請案以及專利都以引用的方 式并入本文中，引用程度如同每個參考文獻(xiàn)個別并特定地指示以引用的方式并入一般并且 全文闡述于本文中。
[0105] 除非本文中另外指示或上下文明顯相矛盾，否則在描述本發(fā)明的上下文中（特別 在以下權(quán)利要求書的上下文中）術(shù)語"一（a)"和"一（an)"和"該"以及類似指示物視為 涵蓋單數(shù)與復(fù)數(shù)兩者。除非另作說明，否則術(shù)語"包含（comprising)"，具有（having)"、 "包括（including)"以及"含有（containing)"應(yīng)理解為開放術(shù)語（S卩，意指"包括，但不 限于"）。除非本文中另外指示，否則本文中數(shù)值范圍的敘述僅意圖充當(dāng)個別提及在所述范 圍內(nèi)的每一各別值的速記方法，并且每一各別值如同本文中個別敘述其一般地并入本說明 書中。除非本文中另外指示或另外上下文明顯相矛盾，否則所有本文所述的方法可按任何 適合次序執(zhí)行。本文所提供的任何和所有實例或例示性措辭（比如"例如"）的使用僅意圖 更好地說明本發(fā)明，并且除非另外要求，否則不會對本發(fā)明的范圍構(gòu)成限制。本說明書中無 措辭應(yīng)理解為指示任何未要求的要素對本發(fā)明的實施來說不可或缺。
[0106] 本文描述本發(fā)明的優(yōu)選實施例，包括本
【發(fā)明者】已知用于進(jìn)行本發(fā)明的最佳模式。 那些優(yōu)選實施例的變體可為所屬領(lǐng)域的一般技術(shù)人員在閱讀以上描述后變得顯而易見。諸 位發(fā)明人預(yù)期所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員酌情采用所述變體，并且諸位發(fā)明人意圖本發(fā)明以除本 文特定描述以外的方式實施。因此，本發(fā)明包括如適用法律所允許，隨附權(quán)利要求書中敘述 的主題的所有修改和同等物。此外，除非本文中另外指示或另外上下文明顯相矛盾，否則其 所有可能變體中上述要素的任何組合都涵蓋于本發(fā)明中。
[0107] 雖然本發(fā)明已經(jīng)根據(jù)特定的實施例和應(yīng)用描述，但熟習(xí)此項技術(shù)者可按照此教 示，在不超過所要求的發(fā)明的范圍或偏離其精神下產(chǎn)生其它實施例。灌注生物反應(yīng)器系統(tǒng) 的各種要素的特定組成比如不應(yīng)視為是一個限制因素。因此，應(yīng)了解提供本發(fā)明中的圖式 和說明以促進(jìn)本發(fā)明的理解并且不應(yīng)視為限制其范圍。
【權(quán)利要求】
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的封閉的生物反應(yīng)器，其中所述生物反應(yīng)器處于IS014644類別 9或更高的不受控制的環(huán)境中。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的封閉的生物反應(yīng)器，其進(jìn)一步包含向所述容器提供支撐的外 部支撐外殼。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的封閉的生物反應(yīng)器，其中所述營養(yǎng)培養(yǎng)基是通過充氣、攪拌、 搖動、震蕩、振動和/或按壓所述容器來混合。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的封閉的生物反應(yīng)器，其進(jìn)一步包含能夠保留大于5 μ m的粒子 的過濾管。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的封閉的生物反應(yīng)器，其中所述生物培養(yǎng)物為人類細(xì)胞、動物 細(xì)胞、細(xì)菌、植物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、酵母或真菌。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的生物反應(yīng)器，其中所述生物培養(yǎng)物在其代謝過程中產(chǎn)生二氧 化碳。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的生物反應(yīng)器，其中所述生物培養(yǎng)物需要二氧化碳用于其代謝 過程。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的封閉的生物反應(yīng)器，其進(jìn)一步包含多個遠(yuǎn)程操作的傳感器。
10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的封閉的生物反應(yīng)器，其中所述遠(yuǎn)程操作的傳感器包含氧和 二氧化碳傳感器。 II. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的封閉的生物反應(yīng)器，其進(jìn)一步包含用于所述營養(yǎng)培養(yǎng)基的 溫度控制器。
12. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的封閉的生物反應(yīng)器，其中所述容器無菌。
13. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的封閉的生物反應(yīng)器，其中所述容器為一次性的。
14. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的封閉的生物反應(yīng)器，其中所述容器為柔性的。
15. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的封閉的生物反應(yīng)器，其中所述容器包含生物相容性聚合物。
16. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的封閉的生物反應(yīng)器，其中所述鼓泡過濾器在所述封閉的生 物反應(yīng)器操作期間浸在所述營養(yǎng)培養(yǎng)基中。
17. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的封閉的生物反應(yīng)器，其進(jìn)一步包含連接到所述出氣口的直 列式筒，所述直列式筒包含選自包含以下各物的吸收性材料群組的二氧化碳吸收性材料： 堿石灰、氫氧化鈣、氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化鋰、硅酸鋰、鋯酸鋰、氧化鋰、活性炭、沸石和 離子交換樹脂。
18. -種用于產(chǎn)生生物產(chǎn)物的方法，其包含： a. 提供包含容器的封閉的生物反應(yīng)器，所述容器包含： i.至少一個出氣口； ii至少一個進(jìn)氣口，其通過管連接到所述出氣口以使氣體在所述容器內(nèi)再循環(huán)； iii. 至少一個液體端口； iv. 安裝在所述進(jìn)氣口的殺菌過濾器； v. 安裝在所述殺菌過濾器（iv)與所述進(jìn)氣口之間的旋塞閥； vi. 安裝在所述液體端口的殺菌過濾器； vii. 安裝在所述殺菌過濾器（vi)與所述液體端口之間的旋塞閥； viii. 安裝在所述出氣口與所述進(jìn)氣口之間的所述管中的蠕動泵； ix. 至少一個鼓泡過濾器，其連接到所述進(jìn)氣口并且位于所述容器中；以及 X.溫度控制器； b. 添加營養(yǎng)培養(yǎng)基到所述容器； c. 將包含5%到100%二氧化碳的新鮮氣體的供應(yīng)連接到所述進(jìn)氣口，其中所述新鮮 氣體通過（a) (ix)的所述鼓泡過濾器通入營養(yǎng)培養(yǎng)基中并且打開所述供應(yīng)； d. 當(dāng)所述營養(yǎng)培養(yǎng)基中達(dá)到二氧化碳的預(yù)定濃度時斷開所述新鮮氣體的供應(yīng)； e. 開啟（a) (viii)的所述蠕動泵以使氣體在所述容器中通過（a) (ii)的所述進(jìn)氣口再 循環(huán)； f. 啟動所述溫度控制器； g. 添加足夠量的生物培養(yǎng)物到所述營養(yǎng)培養(yǎng)基； h. 以時間間隔檢測所述容器中所述營養(yǎng)培養(yǎng)基中所述生物培養(yǎng)物的密度； i. 當(dāng)所述營養(yǎng)培養(yǎng)基中所述二氧化碳濃度降到低于預(yù)定水平時，間歇性開啟新鮮氣體 的流動，并且繼續(xù)所述新鮮氣體的所述流動，直到所述二氧化碳濃度升高到所述營養(yǎng)培養(yǎng) 基中的預(yù)定水平；以及 j. 從所述容器去除所述生物培養(yǎng)物以及由此產(chǎn)生的生物產(chǎn)物。
19. 一種用于產(chǎn)生生物產(chǎn)物的方法，其包含： a.提供包含容器的封閉的生物反應(yīng)器，所述容器包含： i.至少一個出氣口； ii至少一個進(jìn)氣口，其通過管連接到所述出氣口以使氣體在所述容器內(nèi)再循環(huán)； iii. 至少一個液體端口； iv. 安裝在所述進(jìn)氣口的殺菌過濾器； v. 安裝在（iv)的所述殺菌過濾器與所述進(jìn)氣口之間的旋塞閥； vi. 安裝在所述液體端口的殺菌過濾器； vii. 安裝在（vi)的所述殺菌過濾器與所述液體端口之間的旋塞閥； viii. 安裝在所述出氣口與所述進(jìn)氣口之間的所述管中的蠕動泵； ix. 至少一個鼓泡過濾器，其連接到所述進(jìn)氣口并且位于所述容器中； X.溫度控制器；以及 Xi.包含二氧化碳吸收性材料的直列式筒，其安裝在所述出氣口與所述進(jìn)氣口之間； b. 添加營養(yǎng)培養(yǎng)基到所述容器； c. 連接包含5%到100%氧的新鮮氣體的供應(yīng)，其中所述新鮮氣體通過（a) (ix)的所述 鼓泡過濾器通入所述營養(yǎng)培養(yǎng)基中并且打開所述供應(yīng)； d. 當(dāng)所述營養(yǎng)培養(yǎng)基中達(dá)到氧的預(yù)定濃度時斷開所述新鮮氣體的供應(yīng)； e. 開啟（a) (viii)的所述蠕動泵以使氣體在所述容器中通過（a) (ii)的所述進(jìn)氣口再 循環(huán)； f. 啟動所述溫度控制器； g. 添加足夠量的生物培養(yǎng)物到所述營養(yǎng)培養(yǎng)基； h. 以時間間隔檢測所述容器中所述營養(yǎng)培養(yǎng)基中所述生物培養(yǎng)物的密度； i. 當(dāng)所述營養(yǎng)培養(yǎng)基中所述二氧化碳濃度降到低于預(yù)定水平時，間歇性開啟新鮮氣體 的流動，并且繼續(xù)所述新鮮氣體的所述流動，直到所述二氧化碳濃度升高到所述營養(yǎng)培養(yǎng) 基中的預(yù)定水平；以及 j. 從所述容器去除所述生物培養(yǎng)物以及由此產(chǎn)生的生物產(chǎn)物。
20. 根據(jù)權(quán)利要求18或19所述的用于產(chǎn)生生物產(chǎn)物的方法，其中所述容器內(nèi)部的壓力 通過所述新鮮氣體的間歇性流動保持在預(yù)定范圍內(nèi)。
21. 根據(jù)權(quán)利要求18所述的用于產(chǎn)生生物產(chǎn)物的方法，其中所述生物培養(yǎng)物為哺乳動 物細(xì)胞。
22. 根據(jù)權(quán)利要求19所述的用于產(chǎn)生生物產(chǎn)物的方法，其中所述生物培養(yǎng)物為細(xì)菌。
23. 根據(jù)權(quán)利要求18或19所述的用于產(chǎn)生生物產(chǎn)物的方法，其中所述容器進(jìn)一步包含 過濾管。
24. 根據(jù)權(quán)利要求23所述的用于產(chǎn)生生物產(chǎn)物的方法，其中能夠捕捉所述營養(yǎng)培養(yǎng)基 中的所述生物產(chǎn)物的樹脂是通過所述液體端口添加，并且所述營養(yǎng)培養(yǎng)基在所述樹脂已經(jīng) 捕捉到所述生物產(chǎn)物后通過所述過濾管排出。
【文檔編號】C12M3/00GK104066833SQ201280067632
【公開日】2014年9月24日 申請日期:2012年11月14日 優(yōu)先權(quán)日:2011年12月6日
【發(fā)明者】薩爾法拉茨·尼亞齊 申請人:醫(yī)用蛋白國際有限責(zé)任公司