植物中dha和其它lc-pufa的生成的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了用多不飽和脂肪酸(PUFA)合酶系統(tǒng)和一種或多種容許和/或改善PUFA在宿主生物體中生成的輔助蛋白質(zhì)遺傳修飾的重組宿主生物體。本發(fā)明還涉及生成和使用此類生物體的方法以及從此類生物體獲得的產(chǎn)物。
【專利說明】植物中DHA和其它LC-PUFA的生成
[0001]發(fā)明背景發(fā)明領(lǐng)域
[0002]本發(fā)明一般涉及用多不飽和脂肪酸(PUFA)合酶系統(tǒng)和一種或多種容許和/或改善PUFA在宿主生物體中生成的輔助蛋白質(zhì)遺傳修飾的重組宿主生物體(例如植物)。本發(fā)明還涉及生成和使用此類生物體(例如以獲得PUFA)的方法以及從此類生物體獲得的產(chǎn)物(例如油和種子)。
【背景技術(shù)】
[0003]認(rèn)為多不飽和脂肪酸(PUFA)可用于營養(yǎng)應(yīng)用，藥物應(yīng)用，工業(yè)應(yīng)用，及其它目的。然而，目前從天然來源(例如魚油)及從化學(xué)合成供應(yīng)PUFA對于長期商業(yè)需要是不充分的。
[0004]源自植物(例如含油種子作物)的植物油相對便宜，而且沒有與魚油有關(guān)的污染問題。然而，存在于商業(yè)開發(fā)的植物和植物油中的PUFA通常不包含較為飽和的或較長鏈的PUFA,而是通常僅包含脂肪酸,諸如亞油酸(在δ 9和12位置中具有2個(gè)雙鍵的18個(gè)碳，即 18:2 δ 9，12)和亞麻酸(18:3 δ 9，12，15)。
[0005]已經(jīng)描述了在 植物中生成較為不飽和的或較長鏈的PUFA，其通過修飾由植物內(nèi)源生成的脂肪酸進(jìn)行。例如，用編碼脂肪酸延長酶(elongase)和/或去飽和酶的各種單獨(dú)基因遺傳修飾植物已經(jīng)描述為導(dǎo)致葉或種子的生成，所述葉或種子含有顯著水平的較長鏈且較為不飽和的PUFA，諸如二十碳五烯酸(EPA)，而且還含有顯著水平的混合的較短鏈且較小程度不飽和的 PUFA (Qi 等，Nature Biotech.22:739(2004) ；W004/071467 ；Abbadi 等，Plant Celll6:1(2004) ;Napier 和 Sayanova, Proceedings of the Nutrition Society64:387-393(2005) ;Robert 等，F(xiàn)unctional Plant Biology32:473-479(2005);美國申請公開文本 N0.2004/0172682，美國申請 N0.61/345，537，2010 年 5 月 17 曰提交)。
[0006]殼斗科(Fabaceae)(或豆科(Leguminosae))是一種較大的且經(jīng)濟(jì)上重要的有花植物科，其通常稱為豆科作物(legume)科，豌豆(pea)科，扁豆(bean)科或豆(pulse)科。大豆屬(Glycine)是殼斗科中的屬，并且包括例如Glycine albicans,Glycine aphyonota, Glycine arenari, Glycine argyrea, Glycine canescens,滲湖大? (Glycine clandestine), Glycine curvata, Glycine cyrtoloba, Glycine falcate,Glycine gracei, Glycine hirticaulis, Glycine hirticaulis subsp.leptosa, Glycinelactovirens, Glycine latifolia, Glycine latrobeana, Glycine microphylla, Glycinemontis—douglas, Glycine peratosa, Glycine pescadrensis, Glycine pindanica, Gycinepullenii, Glycine rubiginosa, Glycine stenophita, Glycine syndetika,煙豆(Glycinetabacina),短絨野大豆(Glycine tomentella),勞豆(Glycine soja),和大豆(Glycinemax)(大豆)?？茪ざ房七€包括花生,扁豆(菜豆(Phaseolus vulgaris)),蠶豆(broad bean)(蠶豆(Viciafaba))或豌豆(豌豆(Pisum sativum))。[0007]大部分大豆油為生產(chǎn)用于人消費(fèi)的植物油形式。工業(yè)應(yīng)用中使用大豆油的市場也在不斷增加。
[0008]發(fā)明概述
[0009]本領(lǐng)域中需要相對便宜的方法來高效且有效生成植物、植物種子或植物油中大量(例如商業(yè)量)的較長鏈或較為不飽和的PUFA，以及植物、植物種子或植物油中此類PUFA中富含的大量脂質(zhì)(例如三酰甘油(TAG)和磷脂(PL))。通過提供用多不飽和脂肪酸(PUFA)合酶和一種或多種如本文中描述的輔助蛋白遺傳修飾的重組宿主生物體來提供并改善宿主生物體(例如植物)中PUFA生成的系統(tǒng)是本領(lǐng)域中辦法的一種有意義的備選。
[0010]本發(fā)明涉及經(jīng)遺傳修飾的植物(例如殼斗科或大豆屬的植物，諸如大豆)、其后代、種子、細(xì)胞、組織、或部分，其包含:(i)編碼生成至少一種多不飽和脂肪酸(PUFA)的多不飽和脂肪酸合酶(例如藻PUFA合酶)的核酸序列；和(ii)編碼磷酸泛酰巰基乙胺基轉(zhuǎn)移酶(PPT酶)的核酸序列，所述磷酸泛酰巰基乙胺基轉(zhuǎn)移酶(PPT酶)將磷酸泛酰巰基乙胺基輔因子轉(zhuǎn)移至PUFA合酶系統(tǒng)(例如藻PUFA合酶系統(tǒng))ACP域。
[0011]在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，PUFA合酶包含與氨基酸序列SEQ IDNO:1為80%至99%相同的氨基酸序列或者包含氨基酸序列SEQ ID NO:1。在一些實(shí)施方案中，編碼PUFA合酶的核酸序列包含與核酸序列SEQ ID NO:6為80%至99%相同的核酸序列或者包含核酸序列SEQ ID NO:6。在一些實(shí)施方案中，PUFA合酶包含與氨基酸序列SEQ ID NO:2為80%至99%相同的氨基酸序列或者包含氨基酸序列SEQ ID NO:2。在一些實(shí)施方案中，編碼PUFA合酶的核酸序列包含與核酸序列SEQ ID NO:7為80%至99%相同的核酸序列或者包含核酸序列SEQ ID NO:7。在一些實(shí)施方案中，PUFA合酶包含與氨基酸序列SEQ ID NO:3為80%至99%相同的氨基酸序列或者包含氨基酸序列SEQ ID NO:3。在一些實(shí)施方案中，編碼PUFA合酶的核酸序列包含與核 酸序列SEQ ID NO:8為80%至99%相同的核酸序列或者包含核酸序列SEQ ID NO:8。在一些實(shí)施方案中，PUFA合酶包含氨基酸序列SEQ ID NO:1，2，或3或其任何組合。在一些實(shí)施方案中，編碼PUFA合酶的核酸序列包含核酸序列SEQ ID NO:6，7或8或其任何組合。
[0012]在一些實(shí)施方案中，PPT酶包含與SEQ ID NO:5為80%至99%相同的氨基酸序列或者包含氨基酸序列SEQ ID NO:5。在一些實(shí)施方案中，編碼PPT酶的核酸序列與核酸序列SEQ ID NO: 10是80%至99%相同的或者包含核酸序列SEQ ID NO:10。
[0013]在一些實(shí)施方案中，(i)和(ii)的核酸序列包含在單一重組表達(dá)載體中。在一些實(shí)施方案中，(i)和(ii)的核酸序列包含在不同重組表達(dá)載體中。在一些實(shí)施方案中，(i)和/或(ii)的核酸序列與種子特異性啟動子可操作連接。在一些實(shí)施方案中，(i)和/或
(ii)的核酸序列與選自下組的啟動子可操作連接:PvDlec2, PvPhaseolin, LfKCS3, FAEI,BoACP和BnaNapinC。在一些實(shí)施方案中，(i)和/或(ii)的核酸序列與葉特異性啟動子可操作連接。在一些實(shí)施方案中，(i)和/或(ii)的核酸序列與泛素或CsVMV啟動子可操作連接。
[0014]在一些實(shí)施方案中，經(jīng)遺傳修飾的植物、其后代、種子、細(xì)胞、組織、或部分進(jìn)一步包含(iii)編碼?；?CoA合成酶(ACoAS)的核酸序列，所述酰基-CoA合成酶(ACoAS)催化長鏈PUFA游離脂肪酸(PFFA)轉(zhuǎn)化成?；?CoA。在一些實(shí)施方案中，ACoAS包含與SEQID NO:4為80%至99%相同的氨基酸序列或者包含氨基酸序列SEQ ID NO:4。在一些實(shí)施方案中，編碼ACoAS的核酸序列包含與核酸序列SEQ ID NO:9為80%至99%相同的核酸序列或者包含核酸序列SEQ ID NO:9。在一些實(shí)施方案中，編碼ACoAS的核酸序列包含核酸序列SEQ ID NO:34。在一些實(shí)施方案中，(i)，(ii)和/或(iii)的核酸序列包含在單一重組表達(dá)載體中。在一些實(shí)施方案中，(i)，(?)和(iii)的核酸序列包含在不同重組表達(dá)載體中。在一些實(shí)施方案中，(i)和(ii)的核酸序列包含在單一重組表達(dá)載體中，且(iii)的核酸序列包含在不同重組表達(dá)載體中。在一些實(shí)施方案中，(i)和(iii)的核酸序列包含在單一重組表達(dá)載體中，且(ii)的核酸序列包含在不同重組表達(dá)載體中。在一些實(shí)施方案中，(ii)和(iii)的核酸序列包含在單一重組表達(dá)載體中，且(i)的核酸序列包含在不同重組表達(dá)載體中。在一些實(shí)施方案中，(i)，(ii)和/或(iii)的核酸序列與種子特異性啟動子可操作連接。在一些實(shí)施方案中，(i)，(ii)和/或(iii)的核酸序列與選自下組的啟動子可操作連接:PvDlec2，LfKCS3，F(xiàn)AEl，BoACP 和 BnaNapinC。在一些實(shí)施方案中，(i)，(ii)和/或(iii)的核酸序列與葉特異性啟動子可操作連接。在一些實(shí)施方案中，(i)，(ii)和/或(iii)的核酸序列與泛素或CsVMV啟動子可操作連接。
[0015]在一些實(shí)施方案中，經(jīng)遺傳修飾的植物、其后代、細(xì)胞、組織或部分進(jìn)一步包含編碼乙酰CoA羧化酶(ACCase)的核酸序列和/或編碼2型二?；视王；D(zhuǎn)移酶(DGAT2)的核酸序列。
[0016]在一些實(shí)施方案中，經(jīng)遺傳修飾的植物，其后代、細(xì)胞、組織、種子或部分包含下列至少一項(xiàng):pDAB7361，pDAB7362, pDAB7363, pDAB7368, pDAB7369, pDAB7370, pDAB100518,PDAB101476, pDAB101477, pDAB9166, pDAB9167, pDAB7379, pDAB7380, pDAB9323,pDAB9330,PDAB9337,pDAB9338,pDAB9344,pDAB9396,pDAB101412, pDAB7733, pDAB7734, pDAB101493,PDAB109507, pDAB109508, pDAB109509, pDAB9151, pDAB108207, pDAB108208, pDAB108209,PDAB9159, pDAB9147,pDAB108224 和 pDAB108225。 [0017]在一些實(shí)施方案中，經(jīng)遺傳修飾的植物、其后代、細(xì)胞、組織、種子或部分或自經(jīng)遺傳修飾的植物、其后代、種子、細(xì)胞、組織、或部分獲得的油(例如種子油)包含可檢測量的DHA (二十二碳六烯酸(C22:6，n-3))，DPA (n_6) ( 二十二碳五烯酸(C22:5，n_6))和 / 或EPA( 二十碳五烯酸(C20:5，n-3))。在一些實(shí)施方案中，經(jīng)遺傳修飾的植物、其后代、細(xì)胞、組織、種子或部分或自經(jīng)遺傳修飾的植物、其后代、種子、細(xì)胞、組織、或部分獲得的油(例如種子油)包含按總脂肪酸重量計(jì)0.01%至15% DHA，按總脂肪酸重量計(jì)0.05%至10%DHA，或按總脂肪酸重量計(jì)0.05%至5% DHA。在一些實(shí)施方案中，經(jīng)遺傳修飾的植物、其后代、細(xì)胞、組織、種子或部分或自經(jīng)遺傳修飾的植物、其后代、種子、細(xì)胞、組織、或部分獲得的油(例如種子油)包含按總脂肪酸重量計(jì)0.01%至10%EPA，按總脂肪酸重量計(jì)0.05%至5% EPA，或按總脂肪酸重量計(jì)0.05%至1%EPA。在一些實(shí)施方案中，經(jīng)遺傳修飾的植物、其后代、細(xì)胞、組織、種子或部分或自經(jīng)遺傳修飾的植物、其后代、種子、細(xì)胞、組織、或部分獲得的油(例如種子油)包含按總脂肪酸重量計(jì)0.01%至10%0?4(11-6)，按總脂肪酸重量計(jì)0.01%至5% DPA (n-6)，或按總脂肪酸重量計(jì)0.01%至1% DPA(n_6)。在一些實(shí)施方案中，經(jīng)遺傳修飾的植物、其后代、細(xì)胞、組織、種子或部分或自經(jīng)遺傳修飾的植物、其后代、種子、細(xì)胞、組織、或部分獲得的油(例如種子油)包含按總脂肪酸重量計(jì)1:1至1: 30或1:1至1: 3的EPA: DHA比率。一些實(shí)施方案中，經(jīng)遺傳修飾的植物、其后代、細(xì)胞、組織、種子或部分或自經(jīng)遺傳修飾的植物、其后代、種子、細(xì)胞、組織、或部分獲得的油(例如種子油)包含按總脂肪酸重量計(jì)1:1至1: 10或1:1至1: 3的DPA (n-6): DHA比率。在-些實(shí)施方案中，自經(jīng)遺傳修飾的植物、其后代、細(xì)胞、組織、種子或部分獲得的油(例如種子油)包含按油重量計(jì)70%至99%甘油三酯。
[0018]在一些實(shí)施方案中，可檢測量的DHA，DPA (n-6)和/或EPA也存在于自經(jīng)遺傳修飾的植物、其后代、組織、種子、或部分獲得的谷物和/或粗粉中。
[0019]本發(fā)明涉及自本文中描述的經(jīng)遺傳修飾的植物(例如大豆)、其后代、細(xì)胞、組織或部分獲得的油(例如種子油)或種子。本發(fā)明涉及食物產(chǎn)品，其包含自本文中描述的經(jīng)遺傳修飾的植物(例如大豆)、其后代、細(xì)胞、組織或部分獲得的油(例如種子油)。本發(fā)明還涉及功能性食物，其包含自本文中描述的經(jīng)遺傳修飾的植物(例如大豆)、其后代、細(xì)胞、組織或部分獲得的油(例如種子油)或種子。本發(fā)明涉及藥用產(chǎn)品，其包含自本文中描述的經(jīng)遺傳修飾的植物(例如大豆)、其后代、細(xì)胞、組織或部分獲得的油(例如種子油)或種子。
[0020]本發(fā)明涉及生成包含至少一種LC-PUFA的油的方法，其包括從本文中描述的經(jīng)遺傳修飾的植物(例如大豆)、其后代、細(xì)胞、組織或部分或從本文中描述的經(jīng)遺傳修飾的植物(例如大豆)、其后代、細(xì)胞、組織或部分的種子回收油。本發(fā)明還涉及生成包含至少一種LC-PUFA的油的方法，其包括種植本文中描述的經(jīng)遺傳修飾的植物(例如大豆)、其后代、細(xì)胞、組織或部分。本發(fā)明還涉及生成種子油中的至少一種LC-PUFA的方法，其包括從本文中描述的經(jīng)遺傳修飾的植物(例如大豆)、其后代、細(xì)胞、組織或部分的種子回收油。
[0021]本發(fā)明涉及生成種子油中的至少一種LC-PUFA的方法，其包括種植本文中描述的經(jīng)遺傳修飾的植物(例如大豆)、其后代、細(xì)胞、組織或部分。本發(fā)明還涉及對個(gè)體提供含有至少一種PUFA的補(bǔ)充物或治療性產(chǎn)品的方法，其包括對個(gè)體提供本文中描述的經(jīng)遺傳修飾的植物(例如大豆)、其后代、細(xì)胞、組織或部分，本文中描述的油，本文中描述的種子，本文中描述的食物產(chǎn)品，本文中描述的功能性食物，或本文中描述的藥用產(chǎn)品。在一些實(shí)施方案中，此類實(shí)施方案中含有的PUFA是DHA，DPA (n-6)和/或EPA。
[0022]本發(fā)明涉及生成本文中描述的經(jīng)遺傳修飾的植物(例如大豆)、其后代、細(xì)胞、組織或部分的方法，其包括用(i)編碼生成至少一種多不飽和脂肪酸(PUFA)的PUFA合酶(例如藻PUFA合酶)的核酸序列；和(ii)編碼將磷酸泛酰巰基乙胺基輔因子轉(zhuǎn)移至PUFA合酶(例如藻PUFA合酶)ACP域的磷酸泛酰巰基乙胺基轉(zhuǎn)移酶(PPT酶)的核酸序列轉(zhuǎn)化植物或植物細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，所述方法進(jìn)一步包括用(iii)編碼?；?CoA合成酶(ACoAS)的核酸序列轉(zhuǎn)化植物或植物細(xì)胞，所述?；?CoA合成酶(ACoAS)催化長鏈PUFA游離脂肪酸(FFA)轉(zhuǎn)化成?；?CoA。
[0023]附圖簡述
[0024]通過以下詳細(xì)描述、圖、和所附序列描述(其形成本申請的一部分)可以更全面了解本發(fā)明的各個(gè)實(shí)施方案。
[0025]圖1描繪了編碼PUFA OrfA的9個(gè)重復(fù)域中每個(gè)的重新設(shè)計(jì)的DNA序列的ClustalW (Vector NTI 中的比對)。
[0026]圖2是pDAB7362的質(zhì)粒圖。[0027]圖3是pDAB7361的質(zhì)粒圖。
[0028]圖4是pDAB7363的質(zhì)粒圖。[0029]圖5是pDAB7365的質(zhì)粒圖。
[0030]圖6是pDAB7368的質(zhì)粒圖。
[0031 ]圖7是pDAB7369的質(zhì)粒圖。
[0032]圖8是pDAB7370的質(zhì)粒圖。
[0033]圖9是pDAB100518的質(zhì)粒圖。
[0034]圖10 是 pDAB101476 的質(zhì)粒圖。
[0035]圖11 是 pDAB101477 的質(zhì)粒圖。
[0036]圖12顯示了來自源自用pDAB7362轉(zhuǎn)化的兩個(gè)大豆事件的Tl植物的單一 T2大豆種子的DHA和LC-PUFA含量。
[0037]圖13顯示了 T2大豆種子蛋白質(zhì)提取物中PUFA合酶OrfA，PUFA合酶OrfB，和PUFA合酶嵌合OrfC的Western印跡檢測。
[0038]圖14是pDAB9166的質(zhì)粒圖。
[0039]圖15是pDAB9167的質(zhì)粒圖。
[0040]圖16是pDAB7379的質(zhì)粒圖。
[0041]圖17是pDAB7380的質(zhì)粒圖。
[0042]圖18是pDAB9323的質(zhì)粒圖。
[0043]圖19是pDAB9330的質(zhì)粒圖。
[0044]圖20是pDAB9337的質(zhì)粒圖。
[0045]圖21是pDAB9338的質(zhì)粒圖。
[0046]圖22是pDAB9344的質(zhì)粒圖。
[0047]圖23是pDAB9396的質(zhì)粒圖。
[0048]圖24 是 pDAB101412 的質(zhì)粒圖。
[0049]圖25是pDAB7733的質(zhì)粒圖。
[0050]圖26是pDAB7734的質(zhì)粒圖。
[0051]圖27 是 pDAB101493 的質(zhì)粒圖。
[0052]圖28 是 pDAB109507 的質(zhì)粒圖。
[0053]圖29 是 pDAB109508 的質(zhì)粒圖。
[0054]圖30 是 pDAB109509 的質(zhì)粒圖。
[0055]圖31是pDAB9151的質(zhì)粒圖。
[0056]圖32 是 pDAB108207 的質(zhì)粒圖。
[0057]圖33 是 pDAB108208 的質(zhì)粒圖。
[0058]圖34 是 pDAB108209 的質(zhì)粒圖。
[0059]圖35是pDAB9159的質(zhì)粒圖。
[0060]圖36是pDAB9147的質(zhì)粒圖。
[0061]圖37 是 pDAB108224 的質(zhì)粒圖。
[0062]圖38 是 pDAB108225 的質(zhì)粒圖。
[0063]圖 39 顯示了來自用 pDAB101493，pDAB7362，pDAB7369，pDAB101412 或pDAB7380 轉(zhuǎn)化的個(gè)體轉(zhuǎn)基因擬南芥事件的T2種子的DHA和LC-PUFA含量。
[0064]發(fā)明詳述[0065]如本文中使用的，術(shù)語“多不飽和脂肪酸”或“PUFA”指具有至少16個(gè)碳，至少18個(gè)碳，至少20個(gè)碳，或22或更多個(gè)碳的碳鏈長度，且具有至少3或更多個(gè)雙鍵，4或更多個(gè)雙鍵，5或更多個(gè)雙鍵，或6或更多個(gè)雙鍵的脂肪酸，其中所有雙鍵為順式構(gòu)型。
[0066]如本文中使用的，術(shù)語“長鏈多不飽和脂肪酸”或“LC-PUFA”指含有3或更多個(gè)雙鍵的20和更多個(gè)碳鏈長度，或具有至少3或更多個(gè)雙鍵，4或更多個(gè)雙鍵，5或更多個(gè)雙鍵，或6或更多個(gè)雙鍵的22或更多個(gè)碳的脂肪酸。omega-6系列的LC-PUFA包括但不限于二-高-λ -亞麻酸(d1-homo-gamma-亞麻酸,C20:3n_6),花生四烯酸(C20:4n_6),腎上腺酸(又稱作二十二碳四烯酸或DTA) (C22:4n-6)，和二十二碳五烯酸(C22:5n_6)。omega-3系列的LC-PUFA包括但不限于二十碳三烯酸(C20: 3n-3)，二十碳四烯酸(C20:4n_3)，二十碳五烯酸(C20:5n-3)，二十二碳五烯酸(C22:5n_3)，和二十二碳六烯酸(C22:6n_3)。LC-PUFA還包括具有大于22個(gè)碳和4或更多個(gè)雙鍵的脂肪酸，包括但不限于C28:8 (n-3)。
[0067]如本文中使用的，術(shù)語“PUFA合酶”指生成多不飽和脂肪酸(PUFA)且特別是長鏈PUFA(LC-PUFA)的酶以及復(fù)合物中此類酶的任何域。術(shù)語PUFA合酶包括但不限于用于生成PUFA的PUFA PKS系統(tǒng)或PKS樣系統(tǒng)。一些特定的PUFA合酶在本文中通過別的符號指定，例如，“SzPUFA”合酶或“hSzThPUFA”合酶，如本申請中定義的。術(shù)語“PUFA合酶系統(tǒng)”包括PUFA合酶和在異源生物體中表達(dá)時(shí)可以影響PUFA合酶功能的任何輔助酶(例如PPT酶或ACS)。
[0068]如本文中使用的，術(shù)語“磷酸泛酰巰基乙胺基轉(zhuǎn)移酶”和“PPT酶”指通過將輔因子(例如4-磷酸泛酰巰基乙胺)從輔酶A (CoA)轉(zhuǎn)移至PUFA合酶中存在的一個(gè)或多個(gè)ACP域而活化PUFA合酶的酶。能活化本文中描述的PUFA合酶的一個(gè)或多個(gè)ACP域的PPT酶的一個(gè)例子是念珠藻(Nostoc sp.)PCC7120(以前稱作魚腥藻(Anabaena sp.)PCC7120)的Het I蛋白，本文中稱為“N oHetI ”。
[0069]如本文中使用的，術(shù)語“?；?Cok合成酶”、“ACoAS”和“ACS”指催化將長鏈多不飽和游離脂肪酸(FFA)轉(zhuǎn)化成?；?CoA的酶。一些特定的?；?CoA合成酶在本文中以別的符號指定，例如“SzACS-2”，如本申請中定義的。
[0070]如本文中使用的，術(shù)語“植物”包括其任何后代、細(xì)胞、組織、種子、種子油、或部分。
[0071]“保健食品(nutraceutical) ”意指從提供生理學(xué)益處或提供保護(hù)免于疾病的植物分離，純化，濃縮，或生成的產(chǎn)品，包括補(bǔ)充有此類產(chǎn)品的加工食物，以及從已經(jīng)遺傳工程化改造為含有增強(qiáng)的此類生理學(xué)活性組分水平的作物生成的食物。
[0072]“功能性食物”意指如下的食物，該食物(a)與作為日常飲食一部分消耗的常規(guī)食物外觀相似或者可以是該常規(guī)食物，且(b)基于通常存在于未修飾食物中的組分的比例修改，具有增強(qiáng)的營養(yǎng)價(jià)值和/或特定的飲食益處。
[0073]術(shù)語“多核苷酸”和“核酸”意圖涵蓋單數(shù)個(gè)核酸及復(fù)數(shù)個(gè)核酸，核酸分子或其片段、變體、或衍生物，或構(gòu)建體，例如信使RNA (mRNA)或質(zhì)粒DNA (pDNA)。多核苷酸或核酸可以含有全長cDNA序列的核苷酸序列，或其片段，包括非翻譯5’和3’序列和編碼序列。多核苷酸或核酸可以由任何多核糖核苷酸或多脫氧核糖核苷酸構(gòu)成，其可以是未修飾的RNA或DNA或經(jīng)修飾的RNA或DNA。例如，多核苷酸或核酸可以由單鏈和雙鏈DNA，作為單鏈和雙鏈區(qū)的混合物的DNA，單鏈和雙鏈RNA，和作為單鏈和雙鏈區(qū)的混合物的RNA，包含可以為單鏈或更通常為雙鏈或單鏈和雙鏈區(qū)的混合物的DNA和RNA的雜合分子組成。這些術(shù)語還涵蓋多核苷酸或核酸的化學(xué)、酶法、或代謝修飾的形式。
[0074]多核苷酸或核酸序列可以稱為“分離的”，其中它已經(jīng)從其天然環(huán)境中取出。例如，出于本發(fā)明的目的，認(rèn)為載體中含有的編碼具有二羥酸脫水酶活性的多肽或多肽片段的異源多核苷酸或核酸是分離的。分離的多核苷酸或核酸的其它例子包括異源宿主細(xì)胞中維持的重組多核苷酸或溶液中的(部分或基本上)純化的多核苷酸或核酸。依照本發(fā)明的分離的多核苷酸或核酸進(jìn)一步包含合成生成的此類分子。DNA聚合物形式的分離的多核苷酸或核酸可以由cDNA、基因組DNA或合成DNA的一個(gè)或多個(gè)區(qū)段組成。
[0075]術(shù)語“基因”指能夠以特定蛋白質(zhì)表達(dá)的核酸或其片段，任選地包括編碼序列之前(5，非編碼序列)和之后(3’非編碼序列)的調(diào)節(jié)序列。 [0076]如本文中使用的，術(shù)語“編碼區(qū)”指編碼特定氨基酸序列的DNA序列?！昂线m的調(diào)節(jié)序列”指位于編碼序列上游(5，非編碼序列)，之內(nèi)，或下游(3’非編碼序列)，且影響關(guān)聯(lián)編碼序列的轉(zhuǎn)錄、RNA加工或穩(wěn)定性、或翻譯的核苷酸序列。調(diào)節(jié)序列可以包括啟動子、翻譯前導(dǎo)序列、內(nèi)含子、多聚腺苷酸化識別序列、RNA加工位點(diǎn)、效應(yīng)器結(jié)合位點(diǎn)、和莖-環(huán)結(jié)構(gòu)。
[0077]如本文中使用的，術(shù)語“多肽”意圖涵蓋單數(shù)個(gè)“多肽”及復(fù)數(shù)個(gè)“多肽”及其片段，且指通過酰胺鍵(又稱為肽鍵)線性連接的單體(氨基酸)組成的分子。術(shù)語“多肽”指任何一條或多條具有兩個(gè)或更多個(gè)氨基酸的鏈，而不是指特定長度的產(chǎn)物。如此，肽、二肽、三肽、寡肽、蛋白質(zhì)、氨基酸鏈、或用于指一條或多條具有兩個(gè)或更多個(gè)氨基酸的鏈的任何其它術(shù)語包括在“多肽”的定義內(nèi)，且術(shù)語“多肽”可以替換這些中任一項(xiàng)術(shù)語使用，或者與這些中任一項(xiàng)術(shù)語可互換使用。多肽可以源自天然生物學(xué)來源或者通過重組技術(shù)生成，但是不一定從指定的核酸序列翻譯。它可以以任何方式生成，包括通過化學(xué)合成?！胺蛛x的”多肽或其片段、變體或衍生物意圖指不在其天然環(huán)境中的多肽。不需要特定的純化水平。例如，分離的多肽可以從其天然或自然環(huán)境中取出。出于本發(fā)明的目的，認(rèn)為在宿主細(xì)胞中表達(dá)的重組生成的多肽和蛋白質(zhì)是分離的，已經(jīng)通過任何合適的技術(shù)分離，分級，或部分或?qū)嵸|(zhì)性純化的天然或重組多肽亦然。
[0078]如本文中使用的，“天然的”指如自然存在的具有其自身調(diào)節(jié)序列(若存在的話)的多核苷酸、基因或多肽形式。
[0079]如本文中使用的，“內(nèi)源”指在生物體中或在生物體的基因組中在其天然位置中的多核苷酸、基因或多肽的天然形式。“內(nèi)源多核苷酸”包括在生物體的基因組中其天然位置中的天然多核苷酸?！皟?nèi)源基因”包括生物體的基因組中其天然位置中的天然基因?！皟?nèi)源多肽”包括生物體中其天然位置中的天然多肽。
[0080]如本文中使用的，“異源”指通常不存在于宿主生物體中，但是引入宿主生物體中的多核苷酸，基因或多肽?！爱愒炊嗪塑账帷卑ㄒ耘c相應(yīng)的天然多核苷酸不同的形式再引入來源生物體中的天然編碼區(qū)，或其部分。“異源基因”包括以與相應(yīng)的天然基因不同的形式再引入來源生物體中的天然編碼區(qū)，或其部分。例如，異源基因可以包括作為再引入天然宿主中的嵌合基因的一部分的天然編碼區(qū)，所述嵌合基因包含非天然調(diào)節(jié)區(qū)?！爱愒炊嚯摹卑ㄒ耘c相應(yīng)的天然多肽不同的形式再引入來源生物體中的天然多肽。
[0081]如本文中使用的，術(shù)語“修飾”指導(dǎo)致由多核苷酸編碼的多肽的活性降低、基本上消除或消除的本文公開的多核苷酸中的變化，以及導(dǎo)致多肽的活性降低、基本上消除或消除的本文公開的多肽中的變化。此類變化可以通過本領(lǐng)域中公知的方法做出，包括但不限于缺失、突變(例如自發(fā)誘變，隨機(jī)誘變，由增變基因引起的誘變，或轉(zhuǎn)座子誘變)，取代，插入，下調(diào)，改變細(xì)胞位置，改變多核苷酸或多肽的狀態(tài)(例如甲基化，磷酸化或泛素化)，除去輔因子，引入反義RNA/DNA，引入干擾RNA/DNA，化學(xué)修飾，共價(jià)修飾，用UV或X射線照射，同源重組，有絲分裂重組，啟動子置換方法，和/或其組合。測定哪些核苷酸或氨基酸殘基可以修飾的指導(dǎo)可以如下找到，即比較特定多核苷酸或多肽的序列與同源多核苷酸或多肽(例如酵母或細(xì)胞的)序列，并使高同源性的區(qū)域(保守區(qū))或共有序列中做出的修飾的數(shù)目最大化/最小化。
[0082]如本文中使用的，術(shù)語“衍生物”指本發(fā)明中公開的序列的修飾。此類修飾的例示會是保持，略微改變，或提高含油種子作物物種中本文中公開的編碼序列的功能的一個(gè)或多個(gè)堿基的取代、插入和/或缺失，所述堿基涉及本文中公開的編碼序列的核酸序列。例如，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以使用用于預(yù)測和優(yōu)化序列結(jié)構(gòu)的計(jì)算機(jī)建模技術(shù)容易地確定此類衍生物。如此，術(shù)語“衍生物”還包括與本文中公開的編碼序列具有實(shí)質(zhì)性序列同源性，使得它們能夠具有公開的功能性以用于生成本發(fā)明的LC-PUFA的核酸序列。
[0083]如本文中使用的，術(shù)語“變體”指通過使用例如重組DNA技術(shù)，諸如誘變創(chuàng)建的氨基酸插入、缺失、突變和取代而與本發(fā)明的明確敘述的多肽有差別的多肽。測定哪些氨基酸殘基可以在不消除感興趣的活性的情況下替換、添加或刪除的指導(dǎo)可以如下找到，即比較特定多肽的序列與同源多肽的序列，并且使高同源性區(qū)域(保守區(qū))中進(jìn)行的氨基酸序列變化數(shù)目最小化或通過用共有序列替換氨基酸。
[0084]或者，可以通過利用遺傳密碼中的“冗余”合成或選擇編碼這些相同或相似的多肽的重組多核苷酸變體?？梢詫⒏鞣N密碼子取代，諸如生成各種限制性位點(diǎn)的沉默變化引入以優(yōu)化對表達(dá)用的質(zhì)粒或病毒載體的克隆。多核苷酸序列的突變可以在多肽或添加至多肽以修飾多肽的任何部分的 性質(zhì)的其它肽的域中得到反映。
[0085]氨基酸“取代”可以是將一種氨基酸用具有相似結(jié)構(gòu)和/或化學(xué)特性的另一種氨基酸替換的結(jié)果，即保守氨基酸替換，或者它們可以是將一種氨基酸用具有不同結(jié)構(gòu)和/或化學(xué)特性的氨基酸替換的結(jié)果，即非保守氨基酸替換?！氨Ｊ氐摹卑被崛〈梢曰谏婕皻埢臉O性、電荷、溶解度、疏水性、親水性、或兩親性性質(zhì)的相似性進(jìn)行。例如，非極性(疏水性)氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、和甲硫氨酸；極性中性氨基酸包括甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、和谷氨酰胺；帶正電荷的(堿性)氨基酸包括精氨酸、賴氨酸、和組氨酸；且?guī)ж?fù)電荷的(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸?；蛘撸胺潜Ｊ亍卑被崛〈梢酝ㄟ^選擇這些中任一種氨基酸的極性、電荷、溶解度、疏水性、親水性、或兩親性性質(zhì)的差異進(jìn)行?！安迦搿被颉叭笔А笨梢栽谥亟M蛋白在結(jié)構(gòu)上或功能上容許的變異范圍內(nèi)。容許的變異可以通過對多肽分子中的氨基酸系統(tǒng)性進(jìn)行插入、缺失或取代經(jīng)實(shí)驗(yàn)確定，其使用重組DNA技術(shù)并對所得的重組變體測定活性進(jìn)行。
[0086]術(shù)語“啟動子”指能夠控制編碼序列或功能性RNA的表達(dá)的DNA序列。一般地，編碼序列位于啟動子序列的3’。啟動子完全源自天然基因，或者由源自自然存在的不同啟動子的不同元件組成，或者甚至包含合成的DNA區(qū)段。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，不同啟動子可以指導(dǎo)基因在不同組織或細(xì)胞類型中，或者在發(fā)育的不同階段，或者響應(yīng)不同環(huán)境或生理學(xué)條件表達(dá)。引起基因在大多數(shù)時(shí)間在大多數(shù)細(xì)胞類型中表達(dá)的啟動子通常稱為“組成型啟動子”。進(jìn)一步認(rèn)可由于在大多數(shù)情況中，調(diào)節(jié)序列的精確邊界尚未完全限定，不同長度的DNA片段可以具有相同的啟動子活性。
[0087]術(shù)語“可操作連接的”指單一核酸片段上核酸序列的關(guān)聯(lián)，使得一種核酸序列的功能受到另一種影響。例如，在啟動子能夠影響編碼序列表達(dá)時(shí)(例如編碼序列在啟動子的轉(zhuǎn)錄控制下)，啟動子與所述編碼序列可操作連接。編碼序列可以以有義或反義取向與調(diào)節(jié)序列可操作連接。
[0088]如本文中使用的，術(shù)語“表達(dá)”指源自本發(fā)明的核酸片段的有義(mRNA)或反義RNA的轉(zhuǎn)錄和穩(wěn)定積累。表達(dá)還可以指mRNA翻譯成多肽。
[0089]如本文中使用的，術(shù)語“過表達(dá)”指高于相同或相關(guān)基因的內(nèi)源表達(dá)的表達(dá)。異源基因在其表達(dá)聞于相當(dāng)?shù)膬?nèi)源基因的表達(dá)時(shí)是過表達(dá)的。
[0090]如本文中使用的，術(shù)語“轉(zhuǎn)化”指將核酸或片段轉(zhuǎn)移至宿主生物體中，導(dǎo)致遺傳穩(wěn)定的遺傳力。含有經(jīng)轉(zhuǎn)化的核酸片段的宿主生物體稱為“轉(zhuǎn)基因”或“重組”或“經(jīng)轉(zhuǎn)化的”生物體。
[0091]如本文中使用的，術(shù)語“質(zhì)粒”和“載體”指經(jīng)常攜帶不作為細(xì)胞中心代謝一部分的基因，且通常為環(huán)狀雙鏈DNA分子形式的染色體外元件。此類元件可以是源自任何來源的單鏈或雙鏈DNA或RNA的自主復(fù)制序列，基因組整合序列，噬菌體或核苷酸序列(線性或環(huán)狀)，其中許多核苷酸 序列已經(jīng)連接或重組成獨(dú)特的構(gòu)造，其能夠與合適的3’非翻譯序列一起將啟動子片段和選定基因產(chǎn)物的DNA序列導(dǎo)入細(xì)胞中。
[0092]如本文中使用的，術(shù)語“密碼子簡并”指在不影響編碼多肽的氨基酸序列的情況中容許核苷酸序列變異的遺傳密碼性質(zhì)。熟練技術(shù)人員完全知道特定宿主細(xì)胞在使用核苷酸密碼子以規(guī)定給定氨基酸中展現(xiàn)的“密碼子偏愛”。因此，在合成基因以在宿主細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)改善的表達(dá)時(shí)，期望設(shè)計(jì)基因，使得其密碼子選擇頻率接近宿主細(xì)胞的優(yōu)選密碼子選擇的頻率。
[0093]術(shù)語“經(jīng)密碼子優(yōu)化的”在其提及用于轉(zhuǎn)化各種宿主的核酸分子的基因或編碼區(qū)時(shí)指改變核酸分子的基因或編碼區(qū)中的密碼子以在不改變由DNA編碼的多肽的情況中反映宿主生物體的典型密碼子選擇。此類優(yōu)化包括用更通常用于所述生物體基因的一種或多種密碼子替換至少一種，超過一種，或大量的密碼子。
[0094]包含編碼任何多肽鏈的氨基酸的密碼子的核苷酸序列的偏差容許編碼基因的序列的變異。由于每個(gè)密碼子由三個(gè)核苷酸組成，且構(gòu)成DNA的核苷酸限于4種特定的堿基，存在有64種可能的核苷酸組合，其中61種編碼氨基酸(剩余3種密碼子編碼結(jié)束翻譯的信號)。顯示哪些密碼子編碼哪些氨基酸的“遺傳密碼”在本文中以表1再現(xiàn)。因此，許多氨基酸以超過一種密碼子指定。例如，氨基酸丙氨酸和脯氨酸由四種三聯(lián)體編碼，絲氨酸和精氨酸由6種編碼，而色氨酸和甲硫氨酸僅由一種三聯(lián)體編碼。此簡并性容許DNA堿基組成在較寬的范圍里變化而不影響由DNA編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列。
[0095]表1:標(biāo)準(zhǔn)遺傳密碼
[0096]
【權(quán)利要求】
1.一種經(jīng)遺傳修飾的大豆植物、其后代、細(xì)胞、組織、種子或部分，其包含: (i)包含核酸序列的核酸分子，所述核酸序列編碼生成至少一種多不飽和脂肪酸(PUFA)的多不飽和脂肪酸合酶；和 (ii)包含編碼磷酸泛酰巰基乙胺基轉(zhuǎn)移酶(PPT酶)的序列的核酸分子。
2.權(quán)利要求1的經(jīng)遺傳修飾的大豆植物、其后代、細(xì)胞、組織、種子或部分，其中所述PUFA合酶包含與SEQ ID NO:1的氨基酸序列至少80%相同的氨基酸序列。
3.權(quán)利要求2的經(jīng)遺傳修飾的大豆植物、其后代、細(xì)胞、組織、種子或部分，其中所述PUFA合酶包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列。
4.權(quán)利要求1的經(jīng)遺傳修飾的大豆植物、其后代、細(xì)胞、組織、種子或部分，其中所述編碼PUFA合酶的核酸序列包含與SEQ ID NO:6的核酸序列至少80%相同的核酸序列。
5.權(quán)利要求4的經(jīng)遺傳修飾的大豆植物、其后代、細(xì)胞、組織、種子或部分，其中所述編碼PUFA合酶的核酸序列包含SEQ ID NO:6的核酸序列。
6.權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)的經(jīng)遺傳修飾的大豆植物、其后代、細(xì)胞、組織、種子或部分，其中所述PUFA合酶包含與SEQ ID NO:2的氨基酸序列至少80%相同的氨基酸序列。
7.權(quán)利要求6的經(jīng)遺傳修飾的大豆植物、其后代、細(xì)胞、組織、種子或部分，其中所述PUFA合酶包含SEQ ID NO: 2的氨基酸序列。
8.權(quán)利要求1至5 中任一項(xiàng)的經(jīng)遺傳修飾的大豆植物、其后代、細(xì)胞、組織、種子或部分，其中所述編碼PUFA合酶的核酸序列包含與SEQ ID NO:7的核酸序列至少80%相同的核酸序列。
9.權(quán)利要求8的經(jīng)遺傳修飾的大豆植物，其后代、細(xì)胞、組織、種子或部分，其中所述編碼PUFA合酶的核酸序列包含SEQ ID NO:7的核酸序列。
10.權(quán)利要求1至9中任一項(xiàng)的經(jīng)遺傳修飾的大豆植物、其后代、細(xì)胞、組織、種子或部分，其中所述PUFA合酶包含與SEQ ID NO:3的氨基酸序列至少80%相同的氨基酸序列。
11.權(quán)利要求10的經(jīng)遺傳修飾的大豆植物、其后代、細(xì)胞、組織、種子或部分，其中所述PUFA合酶包含SEQ ID NO: 3的氨基酸序列。
12.權(quán)利要求1至9中任一項(xiàng)的經(jīng)遺傳修飾的大豆植物、其后代、細(xì)胞、組織、種子或部分，其中所述編碼PUFA合酶的核酸序列包含與SEQ ID NO:8的核酸序列至少80%相同的核酸序列。
13.權(quán)利要求12的經(jīng)遺傳修飾的大豆植物、其后代、細(xì)胞、組織、種子或部分，其中所述編碼PUFA合酶的核酸序列包含SEQ ID NO:8的核酸序列。
14.權(quán)利要求1的經(jīng)遺傳修飾的大豆植物、其后代、細(xì)胞、組織、種子或部分，其中所述PUFA合酶包含SEQ ID NO:1_3的氨基酸序列。
15.權(quán)利要求1的經(jīng)遺傳修飾的大豆植物、其后代、細(xì)胞、組織、種子或部分，其中所述編碼PUFA合酶的核酸序列包含SEQ ID NO:6_8的核酸序列。
16.權(quán)利要求1至15中任一項(xiàng)的經(jīng)遺傳修飾的大豆植物、其后代、細(xì)胞、組織、種子或部分，其中所述PPT酶包含與SEQ ID NO:5至少80%相同的氨基酸序列。
17.權(quán)利要求16的經(jīng)遺傳修飾的大豆植物、其后代、細(xì)胞、組織、種子或部分，其中所述PPT酶包含SEQ ID NO: 5的氨基酸序列。
18.權(quán)利要求1至17中任一項(xiàng)的經(jīng)遺傳修飾的大豆植物、其后代、細(xì)胞、組織、種子或部分，其中所述編碼PPT酶的核酸序列與SEQ ID NO:10的核酸序列至少80%相同。
19.權(quán)利要求18的經(jīng)遺傳修飾的大豆植物、其后代、細(xì)胞、組織、種子或部分，其中所述編碼PPT酶的核酸序列包含SEQ ID NO:10的核酸序列。
20.權(quán)利要求1至19中任一項(xiàng)的經(jīng)遺傳修飾的大豆植物、其后代、細(xì)胞、組織、種子或部分，其中(i)和(ii)的所述核酸序列包含在單一重組表達(dá)載體中。
21.權(quán)利要求1至20中任一項(xiàng)的經(jīng)遺傳修飾的大豆植物、其后代、細(xì)胞、組織、種子或部分，其中(i)或(ii)的所述核酸序列與種子特異性啟動子或葉特異性啟動子可操作連接。
22.權(quán)利要求1至20中任一項(xiàng)的經(jīng)遺傳修飾的大豆植物、其后代、細(xì)胞、組織、種子或部分，其中Q)或Qi)的所述核酸序列與PvDlec2、LfKCS3、FAEl、BoACP、BnaNapinC、泛素或CsVMV啟動子可操作連接。
23.權(quán)利要求1至22中任一項(xiàng)的經(jīng)遺傳修飾的大豆植物、其后代、細(xì)胞、組織、種子或部分，其進(jìn)一步包含: (iii)包含編碼?；?CoA合成酶(ACoAS)的核酸序列的核酸分子。
24.權(quán)利要求23的經(jīng)遺傳修飾的大豆植物、其后代、細(xì)胞、組織、種子或部分，其中所述ACoAS包含與SEQ ID NO:4至少80%相同的氨基酸序列。
25.權(quán)利要求24的經(jīng)遺傳修飾的大豆植物、其后代、細(xì)胞、組織、種子或部分，其中所述ACoAS包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列。
26.權(quán)利要求23的經(jīng)遺傳修飾的大豆植物、其后代、細(xì)胞、組織、種子或部分，其中所述編碼ACoAS的核酸序列包含與SEQ ID NO:9的核酸序列至少80%相同的核酸序列。
27.權(quán)利要求26的經(jīng)遺傳修飾的大豆植物、其后代、細(xì)胞、組織、種子或部分，其中所述編碼ACoAS的核酸序列包含SEQ ID NO:9的核酸序列。
28.權(quán)利要求23至27中任一項(xiàng)的經(jīng)遺傳修飾的大豆植物、其后代、細(xì)胞、組織、種子或部分，其中(i)、(ii)和(iii)的所述核酸序列包含在單一重組表達(dá)載體中。
29.權(quán)利要求23至27中任一項(xiàng)的經(jīng)遺傳修飾的大豆植物、其后代、細(xì)胞、組織、種子或部分，其中或(iii)的所述核酸序列與種子特異性啟動子或葉特異性啟動子可操作連接。
30.權(quán)利要求23至27中任一項(xiàng)的經(jīng)遺傳修飾的大豆植物、其后代、細(xì)胞、組織、種子或部分，其中或(iii)的所述核酸序列與PvDlec2、LfKCS3、FAEl、BoACP、BnaNapinC、泛素或CsVMV啟動子可操作連接。
31.權(quán)利要求1至30中任一項(xiàng)的經(jīng)遺傳修飾的大豆植物、其后代、細(xì)胞、組織、種子或部分，其進(jìn)一步包含編碼乙酰CoA羧化酶(ACC酶)的核酸序列或編碼2型二酰基甘油?；D(zhuǎn)移酶(DGAT2)的核酸序列。
32.—種經(jīng)遺傳修飾的大豆植物、其后代、細(xì)胞、組織、種子或部分，其包含下列至少一項(xiàng):pDAB7361， pDAB7362, pDAB7363, pDAB7368, pDAB7369, pDAB7370, pDAB100518,PDAB101476,pDAB101477, pDAB9166, pDAB9167, pDAB7379, pDAB7380, pDAB9323, pDAB9330,PDAB9337, pDAB9338, pDAB9344,pDAB9396, pDAB101412, pDAB7733, pDAB7734, pDAB101493,PDAB109507, pDAB109508, pDAB109509, pDAB9151, pDAB108207, pDAB108208, pDAB108209,PDAB9159, pDAB9147, pDAB108224，和 pDAB108225。
33.權(quán)利要求1至32中任一項(xiàng)的經(jīng)遺傳修飾的大豆植物、其后代、細(xì)胞、組織、種子或部分，其中所述植物、其后代、細(xì)胞、組織、種子或部分包含可檢測量的DHA(二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid) (C22:6, n_3)), DPA(n_6) ( 二十二碳五稀酸(docosapentaenoicacid) (C22:5, n_6)),或 EPA (二十碳五稀酸(eicosapentaenoic acid) (C20:5, n_3))。
34.權(quán)利要求33的經(jīng)遺傳修飾的大豆植物、其后代、細(xì)胞、組織、種子或部分，其中所述植物、其后代、細(xì)胞、組織、種子或部分包含按總脂肪酸重量計(jì)的0.01%至15% DHA。
35.權(quán)利要求34的經(jīng)遺傳修飾的大豆植物、其后代、細(xì)胞、組織、種子或部分，其中所述植物、其后代、細(xì)胞、組織、種子或部分包含按總脂肪酸重量計(jì)的0.05%至10% DHA。
36.權(quán)利要求35的經(jīng)遺傳修飾的大豆植物、其后代、細(xì)胞、組織、種子或部分，其中所述植物、其后代、細(xì)胞、組織、種子或部分包含按總脂肪酸重量計(jì)的0.05%至5% DHA。
37.權(quán)利要求1至36中任一項(xiàng)的經(jīng)遺傳修飾的大豆植物、其后代、細(xì)胞、組織、種子或部分，其中所述植物、其后代、細(xì)胞、組織、種子或部分包含按總脂肪酸重量計(jì)的0.01%至10% EPA。
38.權(quán)利要求37的經(jīng)遺傳修飾的大豆植物、其后代、細(xì)胞、組織、種子或部分，其中所述植物、其后代、細(xì)胞、組織、種子或部分包含按總脂肪酸重量計(jì)的0.05%至5% EPA。
39.權(quán)利要求38的經(jīng)遺傳修飾的大豆植物、其后代、細(xì)胞、組織、種子或部分，其中所述植物、其后代、細(xì)胞、組織、種子或部分包含按總脂肪酸重量計(jì)的0.05%至1% EPA。
40.權(quán)利要求1至39中任一項(xiàng)的經(jīng)遺傳修飾的大豆植物、其后代、細(xì)胞、組織、種子或部分，其中所述植物、其后代、細(xì)胞、組織、種子或部分包含按總脂肪酸重量計(jì)的0.01%至10% DPA(n-6)。
41.權(quán)利要求40的經(jīng)遺傳修飾的大豆植物、其后代、細(xì)胞、組織、種子或部分，其中所述植物、其后代、細(xì)胞、組織、種子或部分包含按總脂肪酸重量計(jì)的0.01%至5% DPA(n-6)。
42.權(quán)利要求1-34和39-47中任一項(xiàng)的經(jīng)遺傳修飾的大豆植物、其后代、細(xì)胞、組織、種子或部分，其中所述植物、其后代、細(xì)胞、組織、種子或部分包含按總脂肪酸重量計(jì)的0.01%M I % DPA (n-6)。
43.權(quán)利要求1至33中任一項(xiàng)的經(jīng)遺傳修飾的大豆植物、其后代、細(xì)胞、組織、種子或部分，其中所述植物、其后代、細(xì)胞、組織、種子或部分包含按總脂肪酸重量計(jì)1:1至1: 30的EPA: DHA比率。
44.權(quán)利要求43的經(jīng)遺傳修飾的大豆植物、其后代、細(xì)胞、組織、種子或部分，其中所述植物、其后代、細(xì)胞、組織、種子或部分包含按總脂肪酸重量計(jì)1:1至1: 3的EPA: DHA比率。
45.權(quán)利要求1至33中任一項(xiàng)的經(jīng)遺傳修飾的大豆植物、其后代、細(xì)胞、組織、種子或部分，其中所述植物、其后代、細(xì)胞、組織、種子或部分包含按總脂肪酸重量計(jì)1:1至1: 10的 DPA (n-6): DHA 比率。
46.權(quán)利要求45的經(jīng)遺傳修飾的大豆植物、其后代、細(xì)胞、組織、種子或部分，其中所述植物、其后代、細(xì)胞、組織、種子或部分包含按總脂肪酸重量計(jì)1:1至1: 3的DPA (n-6): DHA 比率。
47.一種自權(quán)利要求1至46中任一項(xiàng)的經(jīng)遺傳修飾的大豆植物、其后代、細(xì)胞、組織、種子或部分獲得的油。
48.一種自權(quán)利要求1至46中任一項(xiàng)的經(jīng)遺傳修飾的大豆植物、其后代、細(xì)胞、組織、或部分獲得的種子。
49.一種食物產(chǎn)品，其包含自權(quán)利要求1至46中任一項(xiàng)的經(jīng)遺傳修飾的大豆植物、其后代、細(xì)胞、組織、種子或部分獲得的油，或自權(quán)利要求1至46中任一項(xiàng)的經(jīng)遺傳修飾的大豆植物、其后代、細(xì)胞、組織、或部分獲得的種子。
50.一種功能性食物，其包含自權(quán)利要求1至46中任一項(xiàng)的經(jīng)遺傳修飾的大豆植物、其后代、細(xì)胞、組織、種子或部分獲得的油，或自權(quán)利要求1至46中任一項(xiàng)的經(jīng)遺傳修飾的大豆植物、其后代、細(xì)胞、組織、或部分獲得的種子。
51.一種藥用產(chǎn)品，其包含自權(quán)利要求1至46中任一項(xiàng)的經(jīng)遺傳修飾的大豆植物、其后代、細(xì)胞、組織、種子或部分獲得的油，或自權(quán)利要求1至46中任一項(xiàng)的經(jīng)遺傳修飾的大豆植物、其后代、細(xì)胞、組織、或部分獲得的種子。
52.一種生成包含至少一種PUFA的油的方法，其包括從權(quán)利要求1至46中任一項(xiàng)的經(jīng)遺傳修飾的大豆植物、其后代、細(xì)胞、組織、種子或部分或者從權(quán)利要求1至46中任一項(xiàng)的經(jīng)遺傳修飾的大豆植物、其后代、細(xì)胞、組織、或部分的種子回收油。
53.一種生成包含至少一種PUFA的油的方法，其包括種植權(quán)利要求1至46中任一項(xiàng)的經(jīng)遺傳修飾的大豆植物、其后代、細(xì)胞、組織、種子或部分。
54.一種在種子油中生成至少一種PUFA的方法，其包括從權(quán)利要求1至46中任一項(xiàng)的經(jīng)遺傳修飾的大豆植物、其后代、細(xì)胞、組織、或部分的種子回收油。
55.一種在種子油中生成至少一種PUFA的方法，其包括種植權(quán)利要求1至46中任一項(xiàng)的經(jīng)遺傳修飾的大豆植物、其后代、細(xì)胞、組織、種子或部分。
56.—種對個(gè)體提供含有至少一種PUFA的補(bǔ)充物或治療性產(chǎn)品的方法，其包括對所述個(gè)體提供權(quán)利要求1至46中任一項(xiàng)的經(jīng)遺傳修飾的大豆植物、其后代、細(xì)胞、組織、種子或部分，權(quán)利要求47的油，權(quán)利要求48的種子，權(quán)利要求49的食物產(chǎn)品，權(quán)利要求50的功能性食物，或權(quán)利要求51的藥用產(chǎn)品。
57.權(quán)利要求53至56中任一項(xiàng)的方法，其中所述PUFA是DHA。
58.權(quán)利要求53至56中任一項(xiàng)的方法，其中所述PUFA是EPA。
59.權(quán)利要求53至56中任一項(xiàng)的方法，其中所述PUFA是DPA(n_6)。
60.一種生成權(quán)利要求1至46中任一項(xiàng)的經(jīng)遺傳修飾的大豆植物、其后代、細(xì)胞、組織、或部分的方法，其包括用⑴包含編碼藻PUFA合酶的序列的核酸分子；和(ii)包含編碼磷酸泛酰巰基乙胺基轉(zhuǎn)移酶(PPT酶)的序列的核酸分子轉(zhuǎn)化大豆植物或植物細(xì)胞。
61.權(quán)利要求60的方法，其進(jìn)一步包括用(iii)包含編碼酰基-CoA合成酶(ACoAS)的序列的核酸分子轉(zhuǎn)化所述大豆植物或植物細(xì)胞。
62.一種大豆油，其包含按總脂肪酸重量計(jì)0.05%至15%DHA。
63.權(quán)利要求62的大豆油，其進(jìn)一步包含按總脂肪酸重量計(jì)0.05%至5% EPA。
64.權(quán)利要求62或63的大豆油，其進(jìn)一步包含按總脂肪酸重量計(jì)0.01%至5%DPA (n-6)。
65.一種大豆油，其包含按總脂肪酸重量計(jì)1:1至1: 30的EPA: DHA比率。
66.權(quán)利要求65的大豆油，其包含按總脂肪酸重量計(jì)1:1至1: 3的EPA: DHA比率。
67.一種大豆油，其包含按總脂肪酸重量計(jì)1:1至1: 10的DPA (n-6): DHA比率。
68.權(quán)利要求67的大豆油，其包含按總脂肪酸重量計(jì)1:1至1: 3的DPA(n-6): DHA比率。
69.一種組合物，其包含權(quán)利要求47和58至68中任一項(xiàng)的油。
70.一種生成權(quán)利要求1至42中任一項(xiàng)的經(jīng)遺傳修飾的大豆植物、其后代、細(xì)胞、組織、種子或部分的方法，其包括用表達(dá)盒轉(zhuǎn)化大豆植物或植物細(xì)胞，所述表達(dá)盒包含:(i)包含編碼PUFA合酶的核酸序列的核酸分子；(ii)包含編碼?；?CoA合成酶(ACoAS)的核酸序列的核酸分子；和(iii)包含編碼磷酸泛酰巰基乙胺基轉(zhuǎn)移酶(PPT酶)的序列的核酸分子。
71.一種油混合物，其包含權(quán)利要求47和58至68中任一項(xiàng)的油，和另外的油。
72.權(quán)利要求71的油混合物，其中所述另外的油是植物油，魚油，微生物油或其混合物。
73.一種飼料或 粗粉(meal)組合物，其包含權(quán)利要求47和58至68中任一項(xiàng)的油。
【文檔編號】C12N5/04GK104024403SQ201280046860
【公開日】2014年9月3日 申請日期:2012年7月26日 優(yōu)先權(quán)日:2011年7月26日
【發(fā)明者】T.A.瓦爾什, D.加喬特, A.O.莫羅, D.R.帕雷迪, J.梅茨, S.貝萬, J.庫納 申請人:陶氏益農(nóng)公司, Dsm Ip資產(chǎn)公司