伯醇的氧化和胺化的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及包括下述步驟的方法：提供下式的伯醇HO-(CH2)x-R1，其中R1選自–OH、-SH、-NH2和–COOR2，x是至少3且R2選自H、烷基和芳基，b)通過與NAD(P)+依賴性的醇脫氫酶接觸氧化所述伯醇，和c)使步驟a)的氧化產(chǎn)物與轉(zhuǎn)氨酶接觸，其中所述NAD(P)+依賴性的醇脫氫酶和/或所述轉(zhuǎn)氨酶是重組的或分離的酶，涉及用于實(shí)行該方法的全細(xì)胞催化劑和這種全細(xì)胞催化劑用于氧化伯醇的用途。
【專利說明】伯醇的氧化和胺化
[0001]本發(fā)明涉及包括下述步驟的方法:
a)提供下式的伯醇 HO-(CH2)x-R1,
其中R1選自-OH, -SH、-NH2和-COOR2，x是至少3且R2選自H、烷基和芳基，
b)通過與NA D(P) +依賴性的醇脫氫酶接觸氧化所述伯醇，和
c)使步驟a)的氧化產(chǎn)物與轉(zhuǎn)氨酶接觸，
其中所述NAD(P)+依賴性的醇脫氫酶和/或所述轉(zhuǎn)氨酶是重組的或分離的酶，
涉及用于施行所述方法的全細(xì)胞催化劑，和涉及這樣的全細(xì)胞催化劑用于氧化伯醇的用途。
[0002]聚酰胺是以重復(fù)的酰胺基為特征的一類聚合物。與化學(xué)上有關(guān)的蛋白不同，術(shù)語“聚酰胺”通常涉及合成的、商購可得的熱塑性塑料。聚酰胺衍生自伯胺或仲胺，其通常在烴裂解中得到。但是，也可以使用衍生物，更精確地講，氨基羧酸、內(nèi)酰胺和二胺，用于聚合物的生產(chǎn)。另外，短鏈氣態(tài)烷烴作為原料是令人感興趣的，其可以用生物技術(shù)方法從再生原料起始得到。
[0003]許多在商業(yè)上具有巨大需求的聚酰胺是從內(nèi)酰胺起始制備。例如，“聚酰胺6”可以通過聚合ε-己內(nèi)酰胺得到，而“聚酰胺12”可以通過聚合月桂內(nèi)酰胺得到。其它商業(yè)上感興趣的產(chǎn)物包括內(nèi)酰胺的共聚物，例如ε-己內(nèi)酰胺和月桂內(nèi)酰胺的共聚物。
[0004]胺類的常規(guī)化學(xué)工業(yè)生產(chǎn)依賴于化石原料的供給，是低效的，且在該過程中產(chǎn)生大量不希望的副產(chǎn)物，在某些合成步驟中最高達(dá)80%。這樣的方法的一個(gè)例子是月桂內(nèi)酰胺的制備，其通常通過丁二烯的三聚化而得到。氫化該三聚化產(chǎn)物環(huán)十二碳三烯，并將由此產(chǎn)生的環(huán)十二烷氧化成環(huán)癸酮，其隨后與羥胺反應(yīng)生成環(huán)十二烷酮肟(Cyclododecanonoxin ),其最后經(jīng)由貝克曼重排轉(zhuǎn)化成月桂內(nèi)酰胺。
[0005]考慮到這些缺點(diǎn)，已經(jīng)開發(fā)了使用生物催化劑從再生原料起始制備胺的方法。PCT/EP 2008/067447描述了使用細(xì)胞生產(chǎn)化學(xué)相關(guān)產(chǎn)物，更精確地講ω-氨基羧酸的生物體系，所述細(xì)胞具有一系列合適的酶活性且能夠?qū)Ⅳ人徂D(zhuǎn)化成相應(yīng)的ω-氨基。但是，在該方法中使用的得自惡臭假單胞菌iPsoudomorms putida) GPOl的AlkBGT-氧化酶體系的一個(gè)已知缺點(diǎn)是，它不能提供使脂族烷烴生成伯醇的選擇性氧化。相反，產(chǎn)生多種氧化產(chǎn)物；尤其是，更高度氧化的產(chǎn)物(諸如相應(yīng)的醛、酮或相應(yīng)的羧酸)的比例隨著反應(yīng)時(shí)間增加而增加(C.Grant, J.M.Woodley 和 F.Baganz (2011), Enzyme and MicrobialTechnology 48，480-486),這相應(yīng)地降低了期望的胺的收率。
[0006]在該背景下，本發(fā)明的目的在于，提供使用生物催化劑氧化醇的改進(jìn)方法。另一個(gè)目的是，如下改進(jìn)所述方法，即增加收率和/或降低副產(chǎn)物濃度。最后，需要這樣的方法，即其允許基于再生原料來生產(chǎn)聚酰胺或用于生產(chǎn)聚酰胺的原材料。
[0007]所述目的和其它目的通過本申請(qǐng)的主題和通過獨(dú)立權(quán)利要求的主題得以實(shí)現(xiàn)，其中由從屬權(quán)利要求得出實(shí)施方案。
[0008]根據(jù)本發(fā)明，所述目的在第一方面由包括下述步驟的方法實(shí)現(xiàn):a)提供下式的伯醇 HO-(CH2)x-R1,
其中R1選自-OH, -SH、-NH2和-COOR2，x是至少3且R2選自H、烷基和芳基，
b)通過與NAD(P) +依賴性的醇脫氫酶接觸氧化所述伯醇，和
c)使步驟a)的氧化產(chǎn)物與轉(zhuǎn)氨酶接觸，
其中所述NAD(P)+-醇脫氫酶和/或所述轉(zhuǎn)氨酶是重組的或分離的酶。
[0009]在所述第一方面的第一實(shí)施方案中，步驟a)通過下式的鏈烷 H- (CH2) χ-R1
通過單加氧酶的羥基化進(jìn)行，所述單加氧酶優(yōu)選是重組的或分離的。
[0010]在所述第一方面的第二實(shí)施方案(其也是第一實(shí)施方案的一個(gè)實(shí)施方案)中，所述NAD(P)+依賴性的醇脫氫酶是具有至少一個(gè)鋅原子作為輔因子的NAD(P)+依賴性的醇脫氫酶。
[0011]在所述第一方面的第三實(shí)施方案(其是第二實(shí)施方案的一個(gè)實(shí)施方案)中，所述醇驗(yàn)皇贏隹燒這嗜熱脂肪芽孢桿菌iBacillus stearothermophiIus )的醇脫氫酶(數(shù)據(jù)庫代碼P42328)或其變體。
[0012]在所述第一方面的第四實(shí)施方案(其是第一至第三實(shí)施方案的一個(gè)實(shí)施方案)中，所述單加氧酶選自:惡臭假單胞菌的AlkBGT,得自熱帶假絲酵母tropicalis'^得自鷹嘴豆(Cicer arietinum)的細(xì)胞色素P450。
·[0013]在所述第一方面的第五實(shí)施方案(其也是第一至第四實(shí)施方案的一個(gè)實(shí)施方案)中，所述轉(zhuǎn)氨酶選自特征如下的轉(zhuǎn)氨酶及其變體:在與青紫色素桿菌QChromobacteriumViοlaceum) ATCC 12472的轉(zhuǎn)氨酶(數(shù)據(jù)庫代碼NP_901695)的Val224對(duì)應(yīng)的氨基酸序列的位置處，其具有選自異亮氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸和亮氨酸的氨基酸，且在與青紫色素桿菌ATCC 12472的轉(zhuǎn)氨酶(數(shù)據(jù)庫代碼NP_901695)的Gly230對(duì)應(yīng)的氨基酸序列的位置處，其具有除了蘇氨酸以外的氨基酸，且優(yōu)選選自絲氨酸、半胱氨酸、甘氨酸和丙氨酸的氨基酸。
[0014]在所述第一方面的第六實(shí)施方案(其也是第一至第五實(shí)施方案的一個(gè)實(shí)施方案)中，在分離的或重組的丙氨酸脫氫酶和無機(jī)氮源存在下進(jìn)行步驟b)和/或步驟c)。
[0015]在所述第一方面的第七實(shí)施方案(其也是第一至第七實(shí)施方案的一個(gè)實(shí)施方案)中，在包含NAD (P) +依賴性的醇脫氫酶、轉(zhuǎn)氨酶、單加氧酶和丙氨酸脫氫酶的組中的至少一種酶是重組的，且以具有相應(yīng)酶的全細(xì)胞催化劑的形式提供。
[0016]在所述第一方面的第八實(shí)施方案(其也是第七實(shí)施方案的一個(gè)實(shí)施方案)中，所有酶以一種或多種全細(xì)胞催化劑的形式提供，其中，優(yōu)選地，一種全細(xì)胞催化劑具有所有必需的酶。
[0017]在所述第一方面的第九實(shí)施方案(其也是第一至第八實(shí)施方案的一個(gè)實(shí)施方案)中，在步驟b)時(shí)，優(yōu)選在步驟b)和c)時(shí)，存在有機(jī)共溶劑，其具有大于-1.38、優(yōu)選O至1.2的 1gP。
[0018]在所述第一方面的第十實(shí)施方案(其也是第九實(shí)施方案的一個(gè)實(shí)施方案)中，所述共溶劑選自不飽和脂肪酸，優(yōu)選油酸。
[0019]在所述第四方面的第十一實(shí)施方案(其也是第九實(shí)施方案的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案)中，所述共溶劑是式R3-O - (CH2)x-0-R4的化合物，其中R3和R4各自且彼此獨(dú)立地選自:甲基、乙基、丙基和丁基，且X是1-4，其中特別優(yōu)選R3和R4各自是甲基且X是2。
[0020]在所述第一方面的第十二實(shí)施方案(其也是第九實(shí)施方案的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案)中，所述共溶劑選自二烷基醚，并且優(yōu)選二甲醚。
[0021]根據(jù)本發(fā)明，所述目的在第二方面中通過全細(xì)胞催化劑得以實(shí)現(xiàn)，所述全細(xì)胞催化劑具有NAD(P)+依賴性的醇脫氫酶(優(yōu)選地，具有至少一個(gè)鋅原子作為輔因子)、轉(zhuǎn)氨酶、任選的單加氧酶和任選的丙氨酸脫氫酶，其中所述酶是重組酶。
[0022]根據(jù)本發(fā)明，所述目的在第三方面中通過根據(jù)本發(fā)明的第二方面的全細(xì)胞催化劑用于氧化和胺化式(HO)-(CH2)x-R1的伯醇的用途得以實(shí)現(xiàn)，其中R1選自-OH、-SH、-NH2和-COOR2，X是至少3，且R2選自H、烷基和芳基。
[0023]在第三方面的第一實(shí)施方案(其是第一實(shí)施方案的一個(gè)實(shí)施方案)中，所述用途進(jìn)一步包括有機(jī)共溶劑的存在，所述有機(jī)共溶劑具有大于-1.38、優(yōu)選O至1.2的logP，且優(yōu)選地為二甲醚。
[0024]在第三方面的第二實(shí)施方案(其是第二實(shí)施方案的一個(gè)實(shí)施方案)中，所述共溶劑選自不飽和脂肪酸，且優(yōu)選地是油酸。
[0025]所述第二和第三方面的其它實(shí)施方案包括本發(fā)明的第一方面的所有實(shí)施方案。
[0026]本發(fā)明的發(fā)明人已經(jīng)驚訝地發(fā)現(xiàn)，存在一組醇脫氫酶，其可以用于實(shí)現(xiàn)形成少量副產(chǎn)物伯醇的氧化。
[0027]本發(fā)明的發(fā)明人此外已驚訝地發(fā)現(xiàn)，存在可以使用生物催化劑將醇胺化而不形成大量副產(chǎn)物的酶活性級(jí)聯(lián)，其`中不必添加或除去還原當(dāng)量。
[0028]本發(fā)明的發(fā)明人此外已驚訝地發(fā)現(xiàn)了可以令人驚訝地使用全細(xì)胞催化劑并從再生原料出發(fā)生產(chǎn)聚酰胺的方法。
[0029]本發(fā)明的發(fā)明人此外已驚訝地發(fā)現(xiàn)，事先氧化后的伯醇的胺化可以特別有利地用以某些序列特性為特征的轉(zhuǎn)氨酶集合來進(jìn)行。
[0030]本發(fā)明的發(fā)明人此外已驚訝地發(fā)現(xiàn)，在包含醇脫氫酶、轉(zhuǎn)氨酶和丙氨酸脫氫酶的氧化和胺化伯醇的體系中使用不同于AlkJ類型的醇脫氫酶，尤其是使用NAD (P)+-依賴性醇脫氫酶對(duì)該方法的產(chǎn)率是有利的，尤其是在使用全細(xì)胞催化劑進(jìn)行時(shí)。
[0031]根據(jù)本發(fā)明的方法可以應(yīng)用于大量的工業(yè)相關(guān)的醇。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，其涉及可氧化和胺化成ω-氨基羧酸的ω-羥基羧酸或酯，優(yōu)選甲酯。在另一實(shí)施方案中，其涉及可氧化和胺化成二胺的二醇。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述伯醇是羥基烷基胺。在此，碳鏈的長度是可變的，并且X為至少3。所述碳鏈優(yōu)選具有多于3個(gè)的C-原子，即X=4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20 或更多。示例性化合物包括 ω-羥基月桂酸、ω-羥基月桂酸甲酯，和鏈烷二醇，尤其是1，8_辛二醇和1，10-癸二醇。
[0032]在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，R1選自-OH和-C00R2，χ是至少11，且R2選自H、甲基、乙基和丙基。在一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述伯醇是ω-羥基脂肪酸甲酯。
[0033]根據(jù)本發(fā)明，在所述方法的步驟b)中，使用NAD(P)+依賴性的醇脫氫酶用于氧化伯醇。在該情況下，與根據(jù)本發(fā)明使用的所有的酶活性多肽一樣，其可以是包含酶活性多肽的細(xì)胞或其裂解物、或處于所有純化階段(從粗制的裂解物至純的多肽)的多肽的制品。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知大量可以在合適的細(xì)胞中過表達(dá)酶活性多肽并進(jìn)行純化和/或分離的方法。因而，為表達(dá)多肽，可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員可得到的所有表達(dá)體系?？梢允褂蒙V方法用于純化，例如提供了標(biāo)記的重組蛋白的親和色譜使用固定化的配體的純化，所述固定化的配體為例如在組氨酸標(biāo)記的情況中鎳離子、在與靶蛋白融合的谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶的情況中使用固定化的谷胱甘肽或在包含麥芽糖結(jié)合蛋白的標(biāo)簽的情況中使用固定化的
麥芽糖。
[0034]可以以可溶形式或固定化地使用經(jīng)純化的酶活性多肽。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知可以將多肽共價(jià)地或非共價(jià)地固定至有機(jī)或無機(jī)固相上的合適方法，例如通過巰基偶聯(lián)化學(xué)(例如得自Pierce的試劑盒)。
[0035]在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述用作全細(xì)胞催化劑或用作表達(dá)體系的細(xì)胞是原核細(xì)胞，優(yōu)選細(xì)菌細(xì)胞。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，其是哺乳動(dòng)物細(xì)胞。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，其是低等真核細(xì)胞，優(yōu)選是酵母細(xì)胞。示例性的原核細(xì)胞包括埃希氏菌屬(Mscheri chi a ),特別是大腸桿菌(Mscheri chi a coli ),和假單胞菌屬 iPseudomorms )和棒狀桿菌屬(JJorynebeicterium)的菌株。示例性的低等真核細(xì)胞包括酵母屬(SaccAan謂Fees)、假絲酵母屬(Caflt/ii/a)、畢赤酵母屬CPicAia)、耶氏酵母屬(Jarrowia)、裂殖酵母iSchizoseiccheiromycos)屬,特別是熱帶假絲酵母(Candida tropicalis)、粟酒裂殖酵母(^^I'zosaccAairmj^ces pombe )> 巴斯德畢赤酵母 CPicAia解脂耶氏酵母(Farroiri'a lipolytica)和釀酒酵母菌cerivisiae)菌株。
[0036]在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述醇脫氫酶是含鋅的NAD(P)+依賴性的醇脫氫酶，即所述催化活性酶包含至少一個(gè)鋅原子作為輔因子，所述鋅原子通過包含半胱氨酸殘基的特征序列基序與所述多肽共價(jià)結(jié)合。在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述醇脫氫酶是嗜熱脂肪芽孢桿菌的醇脫氫酶(數(shù)據(jù)庫代碼P42328)或其變體。
[0037]本發(fā)明的教導(dǎo)不僅可以使用本文描述的生物大分子的精確氨基酸序列或核酸序列來完成，而且也可以使用這樣的大分子的變體來完成，所述變體可以通過一個(gè)或多于一個(gè)氨基酸或核酸的缺失、添加或置換而得到。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，表述核酸序列或氨基酸序列的“變體”(其在下文中與本文中使用的表述“同源體”同義地和可互換地使用)是指另一個(gè)核酸-或氨基酸序列，考慮到相應(yīng)的原始野生型-核酸-或-氨基酸序列，具有70、75、80、85、90、92、94、96、98、99%或更高百分比的同源性(在這里與同一性同義使用)，其中，優(yōu)選地，除了形成催化活性中心的那些氨基酸或者結(jié)構(gòu)或折疊必需的氨基酸以外的氨基酸被刪除或置換，或者后者僅僅是保守置換，例如谷氨酸替代天冬氨酸、或亮氨酸替代纈氨酸。現(xiàn)有技術(shù)描述了可以用于計(jì)算2個(gè)序列的同源性程度的算法，例如Arthur Lesk(2008), Introduction to bioinformatics,第3版。在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，氨基酸序列或核酸序列的所述變體，優(yōu)選地除了上述的序列同源性以外，基本上具有野生型分子或原始分子的相同的酶活性。例如，作為蛋白酶的酶活性多肽的變體具有與所述多肽酶相同的或基本上相同的蛋白水解活性，即催化肽鍵水解的能力。在一個(gè)特別的實(shí)施方案中，表述“基本上相同的酶活性”是指顯著高于背景活性或/和與相對(duì)于相同底物的野生型多肽所具有的KM_和/或kMt_值相差小于3個(gè)、更優(yōu)選2個(gè)、還更優(yōu)選I個(gè)數(shù)量級(jí)的相對(duì)于野生型-多肽的底物的活性。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，表述核酸序列或氨基酸序列的“變體”包含所述核酸-或氨基酸序列的至少一個(gè)活性部分/或片段。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本文中使用的表述“活性部分”是指這樣的氨基酸序列或核酸序列，其具有小于所述氨基酸序列的整個(gè)長度的長度，或者編碼比所述氨基酸序列的全長更短的長度，其中具有比野生型氨基酸序列更短長度的氨基酸序列或編碼的氨基酸序列基本上具有與所述野生型多肽或其變體相同的酶活性，例如作為醇脫氫酶、單加氧酶或轉(zhuǎn)氨酶。在一個(gè)特殊的實(shí)施方案中，表述核酸的“變體”是這樣的核酸，其互補(bǔ)鏈，優(yōu)選地在嚴(yán)格的條件下，結(jié)合在野生型核酸上。雜交反應(yīng)的嚴(yán)格性可由本領(lǐng)域技術(shù)人員容易地確定，并且通常取決于探針的長度、洗滌過程中的溫度和鹽濃度。通常，較長的探針需要較高的溫度才能雜交，而較短的探針需要低溫。雜交是否發(fā)生通常取決于變性DNA與存在于其環(huán)境中的互補(bǔ)鏈對(duì)合的能力，更精確地講，在解鏈溫度以下。雜交反應(yīng)的嚴(yán)格性和相應(yīng)的條件更詳細(xì)地描述在Ausubel等K，1995中。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本文中使用的表述核酸的“變體”是編碼與原始核酸相同的氨基酸序列，或者在遺傳密碼的簡(jiǎn)并性范圍內(nèi)編碼該氨基酸序列的變體的任意的核酸序列。
[0038]數(shù)十年來，醇脫氫酶是生物化學(xué)中與釀造發(fā)酵過程有關(guān)的受到強(qiáng)烈關(guān)注的且在生物技術(shù)上高度相關(guān)的生物化學(xué)酶類別，其包括多種異形體集合。因而，存在惡臭假單胞菌GPOl AlkJ型的膜結(jié)合的、黃素依賴性的醇脫氫酶，其使用黃素輔因子替代NAD(P)+。另一組包括含鐵的、對(duì)氧敏感的醇脫氫酶，其在細(xì)菌中且以無活性形式在酵母中被發(fā)現(xiàn)。另一組包括NAD (P) +依賴性的醇脫氫酶，包括含鋅的醇脫氫酶，其中活性中心具有半胱氨酸配位的鋅原子，所述鋅原子固定醇底物。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，將本文中使用的表述“醇脫氫酶”理解為是指將醛或酮氧化為相應(yīng)的伯醇或伯醇的酶。優(yōu)選地，在根據(jù)本發(fā)明的方法中的醇脫氫酶是NAD(P)+依賴性的醇脫氫酶，即使用NAD(P) +作為輔因子來氧化醇或使用NAD(P)H來還原相應(yīng)的醛或酮的醇脫氫酶。在最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述醇脫氫酶是NAD(P)+依賴性的、含鋅的醇脫氫酶。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本文中使用的表述“NAD (P) +依賴性的醇脫氫酶”表示NAD+-和/或NADP+依賴性的醇脫氫酶。
[0039]根據(jù)本發(fā)明，在步驟c)中，使用轉(zhuǎn)氨酶。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本文中使用的表述“轉(zhuǎn)氨酶”理解為催化α-氨基從供體(優(yōu)選氨基酸)向受體分子(優(yōu)選α-酮羧酸)轉(zhuǎn)移的酶。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述轉(zhuǎn)氨酶選自具有以下特征的轉(zhuǎn)氨酶及其變體:在與青紫色素桿菌(Chromobacterium violaceum) ATCC 12472的轉(zhuǎn)氨酶(數(shù)據(jù)庫代碼NP_901695)的Val224對(duì)應(yīng)的·氨基酸序列的位置處，其具有選自異亮氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸和亮氨酸的氨基酸，且在與青紫色素桿菌ATCC 12472的轉(zhuǎn)氨酶(數(shù)據(jù)庫代碼NP_901695)的Gly230對(duì)應(yīng)的氨基酸序列的位置處，其具有除了蘇氨酸以外的氨基酸，且優(yōu)選選自絲氨酸、半胱氨酸、甘氨酸和丙氨酸的氨基酸。在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述轉(zhuǎn)氨酶選自:青紫色素桿菌DSM30191的ω-轉(zhuǎn)氨酶，源自惡臭假單胞菌W619、銅綠假單抱菌 QPseudomonas aeruginosa ) PA01、天藍(lán)色鏈霉菌 kStreptomyces coelicolor) A3 (2)和除蟲鏈霉菌a vermi til is) MA 4680 的轉(zhuǎn)氨酶。
[0040]在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本文中使用的表述“與青紫色素桿菌ATCC 12472的轉(zhuǎn)氨酶的氨基酸序列的位置X對(duì)應(yīng)的位置”是指，在所研究的分子的比對(duì)中，顯得與青紫色素桿菌ATCC 12472的轉(zhuǎn)氨酶的氨基酸序列的位置X同源的對(duì)應(yīng)位置。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知眾多可以用于進(jìn)行氨基酸序列比對(duì)的軟件包和算法。示例性的軟件包方法包括由EMBL提供的程序包 ClustalW(Larkin et al., 2007; Goujon et al.2010)，或者列出和描述在Arthur M.Lesk (2008), Introduction to Bioinformatics,第 3 版中。[0041 ] 根據(jù)本發(fā)明使用的酶優(yōu)選地是重組酶。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，將本文中使用的表述“重組的”理解為相應(yīng)的核酸分子在自然界中不存在，和/或它使用基因工程方法產(chǎn)生。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，當(dāng)相應(yīng)的多肽由重組核酸編碼時(shí)，提及重組蛋白。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，將本文中使用的重組細(xì)胞理解為具有至少一個(gè)重組核酸或重組多肽的細(xì)胞。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知適合用于生產(chǎn)重組分子或細(xì)胞的方法，例如在Sambrook等人，1989中描述的那些。
[0042]根據(jù)本發(fā)明的教導(dǎo)可以使用分離的酶和使用全細(xì)胞催化劑來實(shí)行。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，將本文中使用的表述“全細(xì)胞催化劑”理解為提供所期望的酶活性的完整的、存活的且有代謝活性的細(xì)胞。所述全細(xì)胞催化劑可以將要代謝的底物(在本發(fā)明的情況中，醇)或由所述底物形成的氧化產(chǎn)物運(yùn)輸進(jìn)細(xì)胞內(nèi)部，在此處被細(xì)胞溶質(zhì)酶代謝，或者其可以將目標(biāo)酶呈遞到它的表面上，在此處直接暴露給培養(yǎng)基中的底物。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知眾多用于生產(chǎn)全細(xì)胞催化劑的體系，例如從DE 60216245中已知。 [0043]就許多應(yīng)用而言,推薦使用分離的酶。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本文中使用的表述“分離的”是指，所述酶以比它的天然來源更純和/或更濃的形式存在。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，如果酶是多肽酶且占相應(yīng)制品的質(zhì)量蛋白分?jǐn)?shù)多于60、70、80、90或優(yōu)選95%，則認(rèn)為所述酶是分離的。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知眾多用于測(cè)量溶液中的蛋白的質(zhì)量的方法，例如借助SDS-聚丙烯酰胺凝膠上的對(duì)應(yīng)蛋白帶的厚度的視覺估測(cè)、NMR光譜法或基于質(zhì)量-光譜測(cè)定法的方法。
[0044]根據(jù)本發(fā)明的方法的酶催化反應(yīng)通常在溶劑或具有高的水比例的溶劑混合物中進(jìn)行，優(yōu)選地在用于建立與酶活性相容的PH-值的合適緩沖體系的存在下進(jìn)行。但是，在疏水性原料的情況中，特別是在具有包含多于3個(gè)碳原子的碳鏈的醇中，有機(jī)共溶劑的額外存在是有利的，所述有機(jī)共溶劑可以介導(dǎo)酶與底物的接觸。一種或多于一種共溶劑以占溶劑混合物或低于溶劑混合物的 95、90、85、80、75、70、65、60、55、50、45、40、35、30、25、20、15、10或5體積％的總比例存在。
[0045]共溶劑的疏水性在這里起重要作用。它可以由1gP表示，所述1gP是正辛醇-水-分配系數(shù)的以10為底的對(duì)數(shù)。優(yōu)選的共溶劑具有大于-1.38、更優(yōu)選-1至+2、還更優(yōu)選O至1.5的logP。
[0046]正辛醇-水-分配系數(shù)K?或P是指示物質(zhì)在1-辛醇和水的兩相體系中的濃度的比例的無量綱分配系數(shù)(參見 J.Sangster, Octanol-Vater Partition Coefficients:Fundamentals and Physical Chemistry, Wiley Series in Solution Chemistry 的第 2卷，John Wiley & Sons, Chichester, 1997)。更精確地講,K?或P表示物質(zhì)在富含辛醇的相中的濃度與其在富含水的相中的濃度之比。
[0047]Kw值是物質(zhì)的親脂性(脂溶性)和親水性(水溶性)之間的比例的模型指數(shù)(Modellmafi)。預(yù)見到，使用物質(zhì)在辛醇-水體系中的分配系數(shù),也能夠估測(cè)該物質(zhì)在具有水相的其它體系中的分配系數(shù)。如果物質(zhì)可更好地溶于脂性溶劑諸如正辛醇中，那么K?大于I，如果物質(zhì)可更好地溶于水中，那么K?小于I。相應(yīng)地，親脂性物質(zhì)的LogP為正值，親水性物質(zhì)的LogP為負(fù)值。由于不能測(cè)量所有化學(xué)試劑的K°w，因此存在非常多樣化的預(yù)測(cè)模型，例如通過定量構(gòu)效關(guān)系(QSAR)或通過線性自由能關(guān)系(LFER)，例如描述于EugeneKellogg G, Abraham DJ: Hydrophobicity:1s LogP(o/w) more than the sum of itsparts?.Eur J Med Chem.2000 年 7-8 月；35 (7-8): 651-61 或Gudrun Wienke, “Messungund Vorausberechnung von n-Octanol/Wasser-Verteilungskoeffizienten，，,博士論文，Oldenburg 大學(xué)，1-172，1993。
[0048]在本申請(qǐng)范圍內(nèi)，根據(jù)Advanced Chemistry Development Inc., Toronto 的方法，借助程序模塊ACD/LogP DB確定log P。
[0049]優(yōu)選的共溶劑具有大于-1.38，更優(yōu)選-1至+2，還更優(yōu)選-0.75至1.5、或-0.5至0.5、或-0.4至0.4、或-0.3至-0.1的logP。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述共溶劑是式Alk1-O-Alk2的二烷基醚，其具有大于-1.38、更優(yōu)選-1至+2、還更優(yōu)選O至1.5的logP，其中所述2個(gè)烷基取代基Alk1和Alk2各自彼此獨(dú)立地選自甲基、乙基、丙基、丁基、異丙基和叔丁基。在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述共溶劑是甲基叔丁基醚(MTBE)。在最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述共溶劑是二甲氧基乙烷(DME)。在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述共溶劑是式R3-O- (CH2) x-0-R4的化合物，其中R3和R4各自且彼此獨(dú)立地選自甲基、乙基、丙基和丁基，且χ是1-4,其中優(yōu)選R3和R4各自是甲基且χ是2。
[0050]在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述共溶劑是羧酸或脂肪酸，優(yōu)選具有至少6個(gè)碳原子的脂肪酸，更優(yōu)選具有至少12個(gè)碳原子的脂肪酸。所述脂肪酸可以是飽和脂肪酸，例如月桂酸、肉豆蘧酸、棕櫚酸、十七烷酸、硬脂酸、花生酸或山崳酸，或不飽和脂肪酸，例如肉豆蘧腦酸、棕櫚油酸、巖芹酸、油酸、反油酸、異油酸、順-9-二十碳烯酸、二十碳-11-烯酸或芥酸。不同脂肪酸的混合物同樣是可能的，例如主要含有不飽和脂肪酸的藍(lán)刺頭油。由于并非所有的脂肪酸在室溫時(shí)都是顯著可溶的，可能需要求助于其它措施，例如升高溫度，或者，更優(yōu)選地，加入其它溶劑來使它可接近水相。在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，使用脂肪酸或其酯、優(yōu)選甲酯、最優(yōu)選月桂酸甲酯作為這樣的其它溶劑。
[0051 ] 根據(jù)本發(fā)明的酶級(jí)聯(lián)可以根據(jù)本發(fā)明在有丙氨酸脫氫酶存在下進(jìn)行。本發(fā)明的一個(gè)特別的長處是，該構(gòu)型能夠?qū)崿F(xiàn)還原當(dāng)量中性的反應(yīng)操作，即該反應(yīng)在沒有供給或除去還原當(dāng)量形式的電子的情況下進(jìn)行，因?yàn)樵诖佳趸^程中由醇脫氫酶產(chǎn)生的NADH在制備丙氨酸時(shí)被消耗，消耗無機(jī)氮供 體，優(yōu)選氨或氨源。
[0052]在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本文中使用的表述“丙氨酸脫氫酶”理解為這樣的酶:其催化L-丙氨酸的轉(zhuǎn)化，消耗水和NAD+，形成丙酮酸、氨和NADH。優(yōu)選地，所述丙氨酸脫氫酶是細(xì)胞內(nèi)的丙氨酸脫氫酶，還更優(yōu)選地，細(xì)菌全細(xì)胞催化劑的重組細(xì)胞內(nèi)的丙氨酸脫氫酶。
[0053]在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，將具有所有需要的活性的全細(xì)胞催化劑用于根據(jù)本發(fā)明的方法中，即NAD(P) +依賴性的醇脫氫酶、轉(zhuǎn)氨酶和任選的單加氧酶和/或丙氨酸脫氫酶。這樣的全細(xì)胞催化劑的應(yīng)用具有以下優(yōu)點(diǎn):以單一試劑的形式使用所有活性，并且不必大規(guī)模地準(zhǔn)備生物活性形式的酶。適合用于構(gòu)建全細(xì)胞催化劑的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，尤其是用于表達(dá)一種或多種重組蛋白的質(zhì)粒體系的構(gòu)建，或編碼所需重組蛋白的DNA向使用的宿主細(xì)胞的染色體DNA中的整合。
[0054]在先前的描述、權(quán)利要求書和附圖中公開的本發(fā)明的特征單獨(dú)地和以任意組合以本發(fā)明不同實(shí)施方案用于實(shí)現(xiàn)本發(fā)明可能是重要的。
[0055]圖1顯示了包含不同轉(zhuǎn)氨酶、尤其是青紫色素桿菌ATCC 12472的轉(zhuǎn)氨酶(數(shù)據(jù)庫代碼NP_901695，“TACV_co”)的示例性比對(duì)。在所有序列中，用下劃線標(biāo)記與后者的轉(zhuǎn)氨酶的位置Val224和Gly230對(duì)應(yīng)的氨基酸殘基。使用ClustalW2進(jìn)行所述比對(duì)。
[0056]實(shí)施例1:使用根據(jù)本發(fā)明的方法，與醇脫氫酶AlkJ相比，使用NAD+依賴性的醇脫氫酶的不同底物的胺化
底物:
使用的底物是環(huán)己烷-1，6-二醇(I)、6_氨基己烷-1-醇(2)和乙基-6-羥基己酸酯⑶。
[0057]酶:
丙氨酸脫氫酶:
在大腸桿菌中表達(dá)枯草芽孢桿菌的L-丙氨酸脫氫酶。首先，制備過夜培養(yǎng)物，然后將其用于接種主要培養(yǎng)物(LB-氨芐西林培養(yǎng)基)。將細(xì)胞在搖床上在30°C和120 Upm溫育24小時(shí)。然后，在無菌條件下加入IPTG (0.5 mM,異丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷，Sigma)進(jìn)行誘導(dǎo)，并將培養(yǎng)物在20°C振搖另外24小時(shí)。
[0058]將細(xì)胞離心出(8000 Upm, 20 min 4°C )，洗滌，并拋棄上清液。然后使用超聲(Is脈沖，4 s暫停，時(shí)間:10 min,振 幅:40%)破碎細(xì)胞,將混合物離心(20 min, 18000Upm, 40C ),并使用His-prep柱純化酶。
[0059]嗜熱脂肪芽孢桿菌的醇脫氫酶(ADH-hT; P42328.1))
為了制備嗜熱脂肪芽孢桿菌的NAD+依賴性的醇脫氫酶(Fiorentino G, Cannio R,Rossi M, Bartolucci S: Decreasing the stability and changing the substratespecificity of the Bacillus stearothermophiIus alcohol dehydrogenase by singleamino acid replacements.Protein Eng 1998, 11: 925-930),首先制備過夜培養(yǎng)物(10ml LB/氨芐西林培養(yǎng)基，氨芐西林lOOPg/ml，30°C，120 Upm)，然后將其用于接種培養(yǎng)容器，再將其在37°C和120 Upm振搖約12小時(shí)。將細(xì)胞離心出(8000 Upm, 20分鐘，4°C)，洗滌，拋棄上清液，并將沉淀物凍干。最后，使用超聲(I s脈沖，4 s暫停，時(shí)間:10 min，振幅:40%)破碎細(xì)胞，并將混合物離心(20 min，18000 Upm, 4°C )和用作粗提取物。借助SDS-PAGE估測(cè)蛋白濃度。
[0060]Alk.T—酉享月兌氧,酶(得自倉油{叚單胞菌oleovirans) Gpol):
除了使用質(zhì)粒pTZE03_AlkJ (SEQ ID NO 20)和使用卡那霉素作為抗生素(50μ8/πι1)
以外，在與嗜熱脂肪芽孢桿菌的醇脫氫酶相同的條件下制備該酶。同樣借助SDS-PAGE估測(cè)蛋白濃度。
[0061]得自青紫色素桿菌的轉(zhuǎn)氨酶CV- ω TA:
為了從青紫色素桿菌制備 CV-ω TA (U.Kaulmann, K.Smithies, Μ.Ε.B.Smith,
H.C.Hailes, J.M.Ward, Enzyme Microb.TecAnoL 2007，41, 628-637; b) M.S.Humble, Κ.E.Cassimjee, M.Hakansson, Y.R.Kimbung, B.ffalse, V.Abedi, H.-J.Federsel, P.Berglund, D.T.Logan, FEBS Journal 2012, 279, 779-792; c) D.Koszelewski, M.Goritzer, D.Clay, B.Seisser, ff.KroutiI, ChemCatChem2Q\Q, 2,73-77)，首先制備過夜培養(yǎng)物(LB/氨芐西林培養(yǎng)基，30°C，120 rpm)，然后將其用于接種含有相同培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶，將其在37°C和120 Upm下振搖約3小時(shí)，直到達(dá)到在600 nm為
0.7的光密度。然后，加入IPTG儲(chǔ)備溶液(0.5 mM)，在20°C和120 Upm誘導(dǎo)3小時(shí)。將細(xì)胞離心出，拋棄上清液，并在4°C儲(chǔ)存細(xì)胞。最后，使用超聲(I s脈沖，4 s暫停，時(shí)間:10min，振幅:40%)破碎細(xì)胞，將混合物離心(20min，18000 Upm, 4°C )，并將上清液用作粗提取物。
[0062]實(shí)駘操作:
實(shí)驗(yàn)溶液描述在表1中。
[0063]表1:實(shí)驗(yàn)溶液
【權(quán)利要求】
1.包括下述步驟的方法: a)提供下式的伯醇
HO-(CH2)x-R1, 其中R1選自-OH, -SH、-NH2和-COOR2，x是至少3且R2選自H、烷基和芳基， b)通過與NAD(P) +依賴性的醇脫氫酶接觸氧化所述伯醇，和 c)使步驟a)的氧化產(chǎn)物與轉(zhuǎn)氨酶接觸， 其中所述NAD(P)+依賴性的醇脫氫酶和/或所述轉(zhuǎn)氨酶是重組的或分離的酶。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中步驟a)通過下式的鏈烷的羥基化
H- (CH2) χ-R1 通過單加氧酶進(jìn)行，所述單加氧酶優(yōu)選是重組的或分離的。
3.根據(jù)權(quán)利要求1-2之一的方法，其中所述NAD(P)+依賴性的醇脫氫酶是具有至少一個(gè)鋅原子作為輔因子的NAD(P)+依賴性的醇脫氫酶。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中所述醇脫氫酶是得自營滿/彥展沒朦stearothermophiIus )的醇脫氫酶(數(shù)據(jù)庫代碼P42328)或其變體。
5.根據(jù)權(quán)利要求2-4之一的方法，其中所述選自惡臭假單胞菌的AlkBGT，得自熱帶假絲酵母或得自鷹嘴豆的細(xì)胞色素P450。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5之一的方法，其中所述轉(zhuǎn)氨酶選自這樣的轉(zhuǎn)氨酶及其變體，其特征在于，在與青紫色素桿菌ATCC 12472的轉(zhuǎn)氨酶(數(shù)據(jù)庫代碼NP_901695)的Val224對(duì)應(yīng)的氨基酸序列的位置處，其具有選自異亮氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸和亮氨酸的氨基酸，且在與青紫色素桿菌ATCC 12472的轉(zhuǎn)氨酶(數(shù)據(jù)庫代碼NP_901695)的Gly230對(duì)應(yīng)的氨基酸序列的位置處，其具有除了蘇氨酸以外的氨基酸，且優(yōu)選選自絲氨酸、半胱氨酸、甘氨酸和丙氨酸的氨基酸。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6之一的方法，其中在分離的或重組的丙氨酸脫氫酶和無機(jī)氮源存在下進(jìn)行步驟b)和/或步驟c)。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7之一的方法，其中由NAD(P)+依賴性的醇脫氫酶、轉(zhuǎn)氨酶、單加氧酶和丙氨酸脫氫酶組成的組中的至少一種酶是重組的，且以具有相應(yīng)酶的全細(xì)胞催化劑的形式提供。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中所有酶以一種或多種全細(xì)胞催化劑的形式提供，且優(yōu)選地，一種全細(xì)胞催化劑具有所有必要的酶。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-9之一的方法，其中在步驟b)中，優(yōu)選地在步驟b)和c)中，存在有機(jī)共溶劑，其具有大于-1.38、優(yōu)選O至1.2的logP。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的方法，其中所述共溶劑選自不飽和脂肪酸，優(yōu)選油酸。
12.根據(jù)權(quán)利要求10的方法，其中所述共溶劑是式R3-O-(CH2) X-O-R4的化合物，其中R3和R4各自且彼此獨(dú)立地選自甲基、乙基、丙基和丁基，且X是1-4，其中優(yōu)選地R3和R4各自是甲基且X是2。
13.全細(xì)胞催化劑，其具有NAD(P)+依賴性的醇脫氫酶、轉(zhuǎn)氨酶、任選的單加氧酶和任選的丙氨酸脫氫酶，所述NAD (P) +依賴性的醇脫氫酶優(yōu)選地具有至少一個(gè)鋅原子作為輔因子，其中所述酶是重組酶。
14.根據(jù)權(quán)利要求13的全細(xì)胞催化劑用于氧化和胺化下式的伯醇的用途HO-(CH2)x-R1, 其中R1選自-OH、-SH、-NH2和-COOR2，x是至少3，且R2選自H、烷基和芳基。
15.根據(jù)權(quán)利要求14的用途，進(jìn)一步包括有機(jī)共溶劑的存在，所述有機(jī)共溶劑具有大于-1.38、優(yōu)選O至1.2的1gP。
16.根據(jù)權(quán)利要求15的`用途，其中所述共溶劑選自不飽和脂肪酸，優(yōu)選油酸。
【文檔編號(hào)】C12P13/02GK103797124SQ201280045779
【公開日】2014年5月14日 申請(qǐng)日期:2012年7月17日 優(yōu)先權(quán)日:2011年7月20日
【發(fā)明者】M.佩特, T.哈斯, J.C.普費(fèi)弗, A.施克拉, W.克勞蒂爾, A.萊希納, J.H.薩特勒, S.沙費(fèi)爾, K.C.陶貝爾 申請(qǐng)人:贏創(chuàng)德固賽有限公司