益生菌組合物和方法
【專利摘要】本發(fā)明的特征在于用于調(diào)節(jié)粘膜免疫系統(tǒng)的組合物和方法。所述組合物包括益生菌微生物，副干酪乳桿菌CBA?L74（國際保藏號LMG?P-24778），所發(fā)酵的食品?？蛇x擇地，所述組合物可以包含副干酪乳桿菌CBA?L74和生理上可接受的載體。在一些實施例中，副干酪乳桿菌CBA?L74可以是不復制的。所述組合物可以施用于患有免疫系統(tǒng)不成熟相關(guān)的胃腸道病癥，感染或疾病或者處于免疫系統(tǒng)不成熟相關(guān)的胃腸道病癥，感染或疾病的風險的受試者。
【專利說明】益生菌組合物和方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及益生菌生物，用益生菌生物制備的食物產(chǎn)品和包含益生菌生物的藥物組合物。這些組合物可用于刺激粘膜免疫系統(tǒng)并用于治療與粘膜免疫系統(tǒng)不成熟有關(guān)的病癥。
【背景技術(shù)】
[0002]腸上皮持續(xù)暴露于可能對宿主有害或有益的外來物質(zhì)。因此，腸道免疫系統(tǒng)必須在下列之間找到平衡點:1)由腸道病原體或毒素誘導的保護性免疫應(yīng)答和2)避免針對食物抗原和通常存在于腸道的IO14種共生有益微生物的免疫反應(yīng)。無論保護性應(yīng)答還是耐受性應(yīng)答的破壞都可導致各種各樣的疾病，包括例如感染、炎癥、食物變態(tài)反應(yīng)、食物超過敏反應(yīng)、炎性腸病、克羅恩病、腹腔疾病、牙周疾病、類風濕性關(guān)節(jié)炎、動脈粥樣硬化和結(jié)腸癌。
[0003]包括腸道免疫系統(tǒng)的免疫調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)隨年齡改變。所述網(wǎng)絡(luò)在人類新生兒中發(fā)育不良并在生命的最初幾年逐漸建立。免疫系統(tǒng)的不成熟在嬰兒和幼兒中感染和食物相關(guān)病癥的患病率中起到重要作用。相反，腸道免疫系統(tǒng)響應(yīng)于新挑戰(zhàn)的能力在老年人中下降。
[0004]胃腸道病癥例如感染、炎性病癥和食物相關(guān)病癥諸如食物變態(tài)反應(yīng)、食物不耐受或食物超敏反應(yīng)對兒童和成人的健康和生活質(zhì)量均有顯著影響。傳染性胃腸炎是最常見的兒科胃腸道病癥。全世界每年有大約十億次發(fā)作，最常見于發(fā)展中國家5歲以下兒童。傳染性胃腸炎的全世界死亡率在平均每年300至600萬兒童的范圍內(nèi)。在美國，每年發(fā)生2500至3500萬新發(fā)病例，造成300至400人死亡。此外，在美國傳染性胃腸炎導致估計200，000人住院和150萬門診人次，花費超過十億美元。食物相關(guān)病癥例如變態(tài)反應(yīng)也對兒童和成人的健康有重大影響。食物變態(tài)反應(yīng)的癥狀可以根據(jù)變態(tài)反應(yīng)的嚴重程度而變化并且范圍可以從嘴部和嘴唇周圍輕微刺痛感到危及生命的過敏反應(yīng)。據(jù)估計，在美國食物變態(tài)反應(yīng)影響1-10%之間的人口。疾病控制中心發(fā)現(xiàn)在2007年約300萬年齡18歲以下的兒童(3.9%)被報道在之前的12個月患有食物或消化變態(tài)反應(yīng)。對于有些兒童來說，食物變態(tài)反應(yīng)隨著年齡變得不太嚴重，對于其他人，它們成了終生的憂慮。在生命早期患有變態(tài)反應(yīng)的嬰兒有可能發(fā)展“變態(tài)反應(yīng)推進”。例如，在嬰兒期對牛奶有嚴重變態(tài)反應(yīng)的許多個體隨后在兒童期有發(fā)展哮喘的風險。種種跡象表明食物變態(tài)反應(yīng)的患病率在世界范圍內(nèi)不斷增加。
[0005]無論病因是什么，胃腸道病癥不僅對兒童的健康產(chǎn)生不利影響而且可能對家庭經(jīng)濟、社會交往以及學校和家長工作的出勤率具有嚴重影響。有對于促進胃腸健康(尤其是在有胃腸道病癥風險或患有胃腸道病癥的個體中)的治療策略的持續(xù)需求。
[0006]發(fā)明概沭
[0007]本發(fā)明提供包含發(fā)酵食物產(chǎn)品的組合物，其中所述食物產(chǎn)品已經(jīng)被益生菌細菌，副干酪乳桿菌CBA L74，國際保藏號LMG P - 24778，所發(fā)酵。所述食物產(chǎn)品可以是乳制品或谷物產(chǎn)品。還提供了包含益生菌細菌，副干酪乳桿菌CBAL74，國際保藏號LMG P - 24778，和生理上可接受的載體的組合物。生理學上可接受的載體可以是食物產(chǎn)品或藥學載體。還提供了制造營養(yǎng)組合物的方法，所述方法包括:提供食物產(chǎn)品；將所述食物產(chǎn)品與有效量的益生菌，副干酪乳桿菌CBA L74，國際保藏號為LMG P - 24778，以及任選的共接種物組合以形成混合物；以及將所述混合物在足以發(fā)生發(fā)酵的溫度和時間孵育。營養(yǎng)組合物可被干燥。營養(yǎng)組合物可以與一種或多種另外的食物產(chǎn)品組合。對于本文描述的組合物和方法中的任一種，副干酪乳桿菌CBA L74細胞可經(jīng)受使得它們不復制的處理。組合物中副干酪乳桿菌CBAL74的濃度可根據(jù)預(yù)期用途而變化，例如，作為營養(yǎng)組合物或藥物組合物。有用的范圍包括約IXlO2個菌落形成單位每克(“cfu/g”)至約IXlO12個菌落形成單位每克(“cfu/g”)干重的當量
[0008]還提供了治療有發(fā)展胃腸道病癥的風險的受試者的方法，所述方法包括:鑒定有發(fā)展胃腸道病癥的風險的受試者；施用有效量的包含食物產(chǎn)品的組合物，其中所述食物產(chǎn)品已經(jīng)由益生菌細菌，副干酪乳桿菌CBA L74，國際保藏號LMG P-24778，所發(fā)酵。胃腸道病癥可以是粘膜免疫系統(tǒng)缺陷例如不成熟的免疫系統(tǒng)、食物變態(tài)反應(yīng)、腹瀉相關(guān)疾病、細菌或病毒感染、腸易激綜合征、炎性腸病、克羅恩病、壞死性小腸結(jié)腸炎或老化，特別是胃腸道系統(tǒng)老化。
[0009]本發(fā)明還提供治療患有胃腸道病癥的受試者的方法。所述方法包括:鑒定患有胃腸道病癥的受試者；施用有效量的包含食物產(chǎn)品的組合物，其中所述食物產(chǎn)品已經(jīng)被益生菌細菌，副干酪乳桿菌CBA L74，國際保藏號LMG P-24778，所發(fā)酵。在一些實施方案中，所述方法包括:鑒定患有胃腸道病癥的受試者；施用有效量的藥物組合物，其包含益生菌細菌，副干酪乳桿菌CBA L74，國際保藏號LMG P-24778。胃腸道病癥可以是粘膜免疫系統(tǒng)缺陷，例如不成熟的免疫系統(tǒng)、食物變態(tài)反應(yīng)、腹瀉相關(guān)疾病、細菌或病毒感染、腸易激綜合征、炎性腸病、克羅恩病或壞死性小腸結(jié)腸炎。
[0010]還提供了調(diào)節(jié)受試者中免疫系統(tǒng)的方法。所述方法包括:鑒定需要免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)的受試者和施用有效量的包含食物產(chǎn)品的組合物，其中所述食物產(chǎn)品已經(jīng)被益生菌細菌，副干酪乳桿菌CBA L74，國際保藏號LMG P-24778，所發(fā)酵。
[0011]還提供制造的物品。這些可以包括包含測定量的包含發(fā)酵的食物產(chǎn)品的營養(yǎng)組合物和選自由包裝材料、包括使用說明的包裝插頁、無菌流體和無菌容器組成的組的一項或多項的試劑盒，其中所述食物產(chǎn)品已經(jīng)被益生菌細菌，副干酪乳桿菌CBA L74，國際保藏號LMG P-24778，所發(fā)酵。在一些實施方案中，所述試劑盒可以包括測定量的包含副干酪乳桿菌CBA L74，國際保藏號LMGP-24778的藥物組合物和選自由包裝材料、包括使用說明的包裝插頁、無菌流體和無菌容器組成的組的一項或多項的。
[0012]本發(fā)明的一個或多個實施方案的細節(jié)闡述于附圖和下文說明中。本發(fā)明的其它特征、目的和優(yōu)點將因說明書描述和附圖以及權(quán)利要求書而顯而易見。
[0013]附圖簡沭
[0014]本發(fā)明的這些和其它特征和優(yōu)點將更充分地公開于以下本發(fā)明的優(yōu)選實施方案的詳細描述或因以下本發(fā)明的優(yōu)選實施方案的詳細描述而變得明顯，其應(yīng)當與附圖一起考慮，其中相同的數(shù)字表示相同的部分并且進一步地其中:
[0015]圖1是顯示分析副干酪乳桿菌CBA L74對DC細胞表型的影響的表格。
[0016]圖2a是描述在與暴露于副干酪乳桿菌CBA L74的Caco2共培養(yǎng)的DC中IL-10產(chǎn)生的圖表。圖2b是描述在與暴露于副干酪乳桿菌CBA L74的Caco2共培養(yǎng)的DC中IL-12產(chǎn)生的圖表。[0017]圖3是描述在暴露于與Caco2細胞共培養(yǎng)的DC的T細胞的增殖的圖表。
[0018]圖4是描述在補充副干酪乳桿菌CBA L74的小鼠的腸粘膜中IL-1 β產(chǎn)生的圖表。
[0019]圖5是描述在補充副干酪乳桿菌CBA L74的小鼠的腸粘膜中IL_4產(chǎn)生的圖表。
[0020]圖6是描述在補充副干酪乳桿菌CBA L74的小鼠的腸粘膜中IgA產(chǎn)生的圖表。
[0021]圖7描述對補充副干酪乳桿菌CBA L74的小鼠的腸粘膜中TLR2、TLR4和TLR9的水平的分析。
[0022]圖8描述對補充副干酪乳桿菌CBA L74的小鼠的腸粘膜中PPAR Y的水平的分析。
[0023]圖9a是描述在補充副干酪乳桿菌CBA L74的小鼠中血清IL-1 β水平的圖表。圖9b是描述在補充副干酪乳桿菌CBA L74的小鼠中血清IL-4水平的圖表。
[0024]圖10是顯示分析副干酪乳桿菌CBA L74對補充副干酪乳桿菌CBA L74的小鼠中DC表型的影響的表格。
[0025]圖1la是描述補充副干酪乳桿菌CBA L74的小鼠中腸⑶4+淋巴細胞表型的圖表。圖1lb是描述補充副干酪乳桿菌CBA L74的小鼠中腸CD8+淋巴細胞表型的圖表。
[0026]圖12是描述在補充用副干酪乳桿菌CBA L74發(fā)酵的奶的小鼠的腸粘膜中IL-10產(chǎn)生的圖表。
[0027]圖13是描述在補充用副干酪乳桿菌CBA L74發(fā)酵的奶的小鼠的腸粘膜中IL-1 β產(chǎn)生的圖表。
[0028]圖14是描述在補充用副干酪乳桿菌CBA L74發(fā)酵的奶的小鼠的腸粘膜中IgA產(chǎn)生的圖表。
[0029]圖15描述對補充用副干酪乳桿菌CBA L74發(fā)酵的奶的小鼠的腸粘膜中TLR2、TLR4、TLR9和PPAR Y的水平的分析。
[0030]圖16描述對補充用副干酪乳桿菌CBA發(fā)酵的奶的小鼠的腸粘膜中pNF-κ B和IKBa的水平的分析。
[0031]圖17描述對補充用副干酪乳桿菌CBA發(fā)酵的奶的小鼠中副干酪乳桿菌CBA L74對DC細胞表型的影響的分析。
[0032]圖18是對補充用副干酪乳桿菌CBA發(fā)酵的奶的小鼠中暴露于LPS或CpG后副干酪乳桿菌CBA L74對DC細胞表型的影響的分析。
[0033]圖19是描述補充用副干酪乳桿菌CBA L74發(fā)酵的奶的小鼠中腸CD4+淋巴細胞表型的圖表。
[0034]圖20是描述補充用副干酪乳桿菌CBA L74發(fā)酵的奶的小鼠中腸CD8+淋巴細胞表型的圖表。
[0035]圖21顯示補充用副干酪乳桿菌CBA L74發(fā)酵的奶的小鼠中回腸粘膜的組織學評估。
[0036]圖22是描述補充用副干酪乳桿菌CBA L74發(fā)酵的稻米的小鼠的腸粘膜中IL-1 β和IL-4產(chǎn)生的圖表。
[0037]圖23是描述補充用副干酪乳桿菌CBA L74發(fā)酵的稻米的小鼠的腸粘膜中IL-10產(chǎn)生的圖表。
[0038]圖24是對補充用副干酪乳桿菌CBA L74發(fā)酵的稻米的小鼠的腸粘膜中TLR2和TLR4水平的分析。[0039]圖25a是對補充用副干酪乳桿菌CBA L74發(fā)酵的稻米的小鼠的腸粘膜中PPAR Y水平的分析。圖25b是對補充用副干酪乳桿菌CBA L74發(fā)酵的稻米的小鼠的腸粘膜中pNF-κ B和IKBa水平的分析。
[0040]圖26是顯示對補充用副干酪乳桿菌CBA L74發(fā)酵的稻米的小鼠中副干酪乳桿菌CBA L74對DC表型的影響的分析的表格。
[0041]圖27是顯示對補充用副干酪乳桿菌CBA L74發(fā)酵的稻米的小鼠中暴露于LPS或CpG后副干酪乳桿菌CBA L74對DC表型的影響的分析的表格。
[0042]圖28是描述補充用副干酪乳桿菌CBA L74發(fā)酵的稻米的小鼠中腸CD4+淋巴細胞表型的圖表。
[0043]圖29是描述補充用副干酪乳桿菌CBA L74發(fā)酵的稻米的小鼠中腸CD8+淋巴細胞表型的圖表。
[0044]圖30是描述對鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)存在時人MoDC中副干酪乳桿菌CBA L74細胞和細胞上清液對IL-1O產(chǎn)生的影響的分析的圖表
[0045]圖31是描述對鼠傷寒沙門氏菌存在時人MoDC中副干酪乳桿菌CBA L74細胞和細胞上清液對IL-12p70產(chǎn)生的影響的分析的圖表。
[0046]圖32是描述對鼠傷寒沙門氏菌存在時人MoDC中副干酪乳桿菌CBA L74細胞發(fā)酵的奶對IL-1O產(chǎn)生的影響和鼠傷寒沙門氏菌存在時人MoDC中副干酪乳桿菌CBA L74的失活對IL-1O產(chǎn)生的影響的分析的圖表。
[0047]圖33是描述對鼠傷寒沙門氏菌存在時人MoDC中副干酪乳桿菌CBA L74發(fā)酵的奶對IL-12p70產(chǎn)生的影響和鼠傷寒沙門氏菌存在時人MoDC中副干酪乳桿菌CBA L74的失活對IL-12p70產(chǎn)生的影響的分析的圖表。
[0048]圖34是描述對鼠傷寒沙門氏菌存在時腸道組織移植模型中副干酪乳桿菌CBA L74發(fā)酵的稻米對IL-1 β、TNF-α和IL-1O的影響的分析的圖表。
[0049]發(fā)明詳沭
[0050]本發(fā)明基于，部分地，本發(fā)明人的經(jīng)益生菌生物副干酪乳桿菌發(fā)酵，菌株CBA L74，所發(fā)酵的食物可具有免疫調(diào)節(jié)特性的發(fā)現(xiàn)。這一菌株由發(fā)明人分離并且根據(jù)國際承認用于專利程序的微生物保存布達佩斯條約于2008年9月9日保存在LAB0RAT0RIUM voorMicrobiologie (LMG) , Ghent, Belgium的比利時微生物協(xié)作保藏中心(BCCM)0由國際保存單位提供的保藏號為LMGP-24778。為了便于閱讀，我們不會每次都重復短語“保藏號為LMG P-24778”。但是應(yīng)當理解的是當我們提及副干酪乳桿菌菌株CBA L74時我們是指具有保藏號LMGP-24778的保藏菌株。
[0051]本發(fā)明的組合物包括益生菌生物副干酪乳桿菌CBA L74。世界衛(wèi)生組織定義益生菌為:“當以足量施用時給予宿主健康益處的活的微生物”。在一些實施方案中，副干酪乳桿菌CBA L74可經(jīng)受使得它們不復制的處理，例如暴露于熱、干燥、Y射線輻照或紫外線輻照。不復制的副干酪乳桿菌CBA L74可以是死細胞或已使得無法細胞分裂的活細胞。不復制的副干酪乳桿菌CBA L74可以是完整的細胞或已經(jīng)歷部分或完全溶解的細胞。在一些實施方案中，不復制的細胞可以包括完整的和溶解的細胞的混合物。
[0052]雖然我們相信我們理解在施用包含使用副干酪乳桿菌CBA L74的發(fā)酵物或使用副干酪乳桿菌CBA L74的發(fā)酵物制成的組合物時發(fā)生某些事件，但本發(fā)明的組合物并不限于通過影響任何特定的細胞機制起作用的那些。我們的作用假設(shè)是益生菌生物或用益生菌生物發(fā)酵的組合物可提供增加的屏障以將細菌和細菌產(chǎn)物易位穿過粘膜，競爭性排除潛在病原體，修改宿主對微生物產(chǎn)品的反應(yīng)并以抑制病原體生長的方式加強腸內(nèi)營養(yǎng)。包含不復制的益生菌生物的組合物的有益效果可來自于，例如發(fā)酵過程中產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物，諸如有機酸例如乳酸、丁酸或乙酸?？蛇x擇地或另外地，微生物DNA例如未甲基化的CpG 二核苷酸，細菌細胞壁片段和其他亞細胞細菌成分例如蛋白質(zhì)、碳水化合物和脂類可發(fā)揮對粘膜免疫系統(tǒng)的免疫調(diào)節(jié)作用。
[0053]本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)體外和體內(nèi)測定時分離的副干酪乳桿菌CBA L74調(diào)節(jié)的促炎性標志物和抗炎性標志物兩者的水平。此外，免疫調(diào)節(jié)作用也在施用已被副干酪乳桿菌CBAL74發(fā)酵的食物時觀察到。即使在發(fā)酵食物已被處理，例如通過熱，以使得副干酪乳桿菌CBAL74不復制時，仍注意到這些免疫調(diào)節(jié)作用。因此，本發(fā)明的特征在于可用于刺激腸道免疫系統(tǒng)的組合物和方法。所述組合物可包括已經(jīng)被副干酪乳桿菌CBA L74發(fā)酵的食物產(chǎn)品。食物產(chǎn)品可以是適合于副干酪乳桿菌CBA L74發(fā)酵的各種各樣食物中的任一種。在一些實施方案中，所述組合物可包括分離的副干酪乳桿菌CBA L74和生理學載體。所述載體可以是食物產(chǎn)品，但本發(fā)明并不限于此，并且在一些實施方案中，載體可以是藥理學的載體。本發(fā)明還提供制造和使用所述組合物的方法。本發(fā)明的方法包括產(chǎn)生包含副干酪乳桿菌CBAL74的組合物的方法，用副干酪乳桿菌CBA L74發(fā)酵食物產(chǎn)品的方法和施用所述組合物以在受試者中產(chǎn)生免疫調(diào)節(jié)應(yīng)答的方法。所述組合物可被施用于具有未成熟免疫系統(tǒng)的受試者、處于患有胃腸道病癥風險或患有胃腸道病癥的受試者。所述方法可以用于人受試者例如嬰兒和兒童或獸醫(yī)學中。不管受試者(無論人類或非人類)如何，本發(fā)明方法中的任一個可以包括鑒定所述受試者的步驟。例如，所述方法可以包括確定受試者是否是需要治療的步驟。
[0054]組合物
[0055]發(fā)酵的食物
[0056]本發(fā)明的組合物包括營養(yǎng)組合物，即由益生菌生物，副干酪乳桿菌CBAL74，所發(fā)酵的食物。可使用適合于副干酪乳桿菌CBA L74發(fā)酵的任何食物產(chǎn)品。所述食物產(chǎn)品可以是乳制品，例如奶或基于奶的產(chǎn)品。示例性奶源包括但不限于牛、綿羊、山羊、牦牛、水牛、馬、驢、鹿和駱駝。不論來源如何，奶或奶產(chǎn)品可以是適于副干酪乳桿菌CBA L74發(fā)酵的任何形式。例如，奶可以是全脂奶或已處理以除去部分或全部乳脂的奶，例如，2%奶，1%奶或無脂奶?？蛇x擇地或另外地，奶可以預(yù)先巴氏消毒和或均質(zhì)化，干燥和重構(gòu)，冷凝或蒸發(fā)。也可使用包括酪蛋白、乳清蛋白或乳糖的乳產(chǎn)品餾分。在一些實施方案中，乳產(chǎn)品可以是從約1%至約30%重構(gòu)脫脂奶粉，例如約2%、約5%、約7%、約9%、約10%、約12%、約15%、約20%、約25%、約30%的重構(gòu)脫脂奶粉。發(fā)酵前，奶產(chǎn)品可與下列中一種或多種組合:a)碳水化合物(例如二糖諸如葡萄糖或淀粉；b)脂質(zhì)；c)維生素和d)礦物。例如，脫脂奶粉可與葡萄糖組合至約2%，例如約0.25%、約0.50%、約0.75%、約1.0%、約1.5%或約2.0%。
[0057]所述食物產(chǎn)品可以是谷物產(chǎn)品,例如稻米、小麥、燕麥、大麥、玉米、黑麥、高粱、小米或黑小麥。谷物產(chǎn)品可以是整個谷物或者被研磨成粉。所述食物產(chǎn)品可以是單一種類的谷物或兩種或更多種谷物的混合物，例如燕麥粉加上發(fā)芽大麥面粉。谷物產(chǎn)品可以具有適合人類食用的級別和類型或可以式適于家畜食用的產(chǎn)品。一般地，谷物產(chǎn)品在發(fā)酵之前水合。谷物的濃度可以變化，但是可用的范圍包括從約5%至約50%重量/體積，例如約8%重量/體積、約10%重量/體積、約12%重量/體積、約15%的重量/體積、約18%重量/體積、約20%重量/體積、約22%重量/體積、約25%重量/體積、約30%重量/體積、約35%重量/體積、約40%重量/體積、約45%重量/體積或約50%重量/體積。示例性濃度包括15%重量/體積的稻或18.5%重量/體積的燕麥粉加上5%重量/體積的發(fā)芽大麥面粉的混合物。水合谷物的PH可以使用適合于食用的酸來調(diào)節(jié)。所述酸可以是例如有機磺酸。有用的有機酸包括乙酸、檸檬酸、乳酸、己二酸、蘋果酸和酒石酸?？梢允褂脙煞N或更多種酸的任何組合。在一些實施方案中，可以使用檸檬酸將PH調(diào)節(jié)至約4.0。
[0058]食物產(chǎn)品也可以是蔬菜或水果產(chǎn)品，例如果汁、果泥、濃縮液、糊狀物、醬、咸菜或ketchup。示例性的蔬菜和水果包括但不限于南瓜類例如西葫蘆、黃南瓜、筍瓜、南瓜；土豆類，蘆筍，甘藍，抱子甘藍，豆類例如綠豆、蠟豆、利馬豆、蠶豆、大豆，白菜，胡蘿卜，菜花，黃瓜，大頭菜，韭菜，大蔥，洋蔥，蜜糖豆(sugar pea),青豆(English pea)，辣椒，蘿卜，蕪菁甘藍，西紅柿，蘋果，梨，桃子，李子，草莓，覆盆子，黑莓，藍莓，越橘，波森莓，醋栗，葡萄，紅醋栗，橘子，檸檬，葡萄柚，香蕉，芒果，獼猴桃和楊桃。
[0059]所述食物產(chǎn)品也可以是從谷物(大麥、燕麥或斯卑爾脫小麥“奶”)，堅果(杏仁、腰果、椰子、榛子或核桃“奶”)，豆類(大豆、花生、豌豆或扁豆“奶”)或種子(藜，芝麻或葵花籽“奶”)制得的“奶”。
[0060]還預(yù)期的是食物產(chǎn)品，其包含動物蛋白，例如肉，諸如香腸、干肉、魚和干魚產(chǎn)品。
[0061]無論所用的食物產(chǎn)品的類型如何，產(chǎn)品與副干酪乳桿菌CBA L74組合并以發(fā)酵足以發(fā)生的溫度和的時間孵育?？梢允褂帽绢I(lǐng)域中已知的任何標準發(fā)酵方法。特定發(fā)酵條件將根據(jù)許多因素變化，包括例如食物產(chǎn)品的類型，食物產(chǎn)品的濃度，所使用的儀器，樣品體積，副干酪乳桿菌CBA L74接種物的初始濃度，共同接種物(如果有)的存在，所發(fā)酵的食物的感官特性和所發(fā)酵食物的預(yù)期用途。
[0062]儀器和底物(S卩，有待發(fā)酵的食物產(chǎn)品)在用副干酪乳桿菌CBA L74接種之前滅菌以便降低存活細菌和/或真菌和/或感染性的病毒的水平或者消除存活細菌和/或真菌和/或感染性的病毒。所述儀器可使用標準方法或根據(jù)制造商的說明進行滅菌。對底物滅菌的特定方法的選擇將取決于，部分地，所述底物對滅菌方法的穩(wěn)定性。例如，底物可以通過蒸汽和壓力滅菌，例如通過高壓滅菌、加熱和冷卻的重復循環(huán)(例如間歇滅菌)、暴露于高壓力(例如超高壓滅菌(pascalization))、超濾或福射(例如，反復循環(huán)暴露于Y _、X_，電子束和 / 或紫外線(IOnm 至 320nm,例如 50nm 至 320nm、IOOnm 到 320nm、150nm 到 320nm、180nm至320nm或200nm至300nm的波長))。底物的等份試樣可進行下列處理并且和鋪板在合適的培養(yǎng)基上以確認沒有細菌和/或真菌污染物存在。如果底物已通過暴露于高溫來滅菌，它應(yīng)該在用副干酪乳桿菌CBA L74接種前冷卻到至少37°C下。.[0063]底物可以按照標準方法用副干酪乳桿菌CBA L74接種，例如來自新鮮液體培養(yǎng)物或在接種前已重新懸浮在水介質(zhì)中很短時間的冷凍干燥的培養(yǎng)物。通常，副干酪乳桿菌 CBA L74 以約 0.5X IO6 至約 I X 106cfu/ml，例如，約 I X 106cfu/ml、約 2X 106cfu/ml、約5X 106cfu/ml,7X 106cfu/ml,8X 106cfu/ml的濃度加至底物。培養(yǎng)物應(yīng)被充分地攪拌以產(chǎn)生菌和底物的相對均勻的分布但不會過度，因為副干酪乳桿菌CBA L74是厭氧細菌。例如，五升的培養(yǎng)物可在約150rpm下進行攪拌。發(fā)酵溫度一般在37°C。各種參數(shù)，例如pH值、O2的局部壓力、攪拌速度、溫度、氣體的混合、發(fā)泡水平和底物濃度，在發(fā)酵過程中可以被監(jiān)測并相應(yīng)調(diào)整。副干酪乳桿菌CBA L74的生長可以使用標準的微生物學方法進行監(jiān)測。進行發(fā)酵直到副干酪乳桿菌CBA L74的濃度為約108/ml和約109/ml之間。根據(jù)底物和其它條件，所述濃度可以在接種后約10至約30小時，例如約12小時、約15小時、約18小時、約24小時、約30小時達到。
[0064]底物的樣品可以使用標準的微生物學方法在發(fā)酵之前、期間和之后進行測定以確保質(zhì)量。示例性的方法包括但不限于，Rogosa瓊脂上副干酪乳桿菌CBAL74的生長、平板計數(shù)瓊脂(PCA)上總需氧菌的生長、McConkay瓊脂上大腸菌類的生長、強化的梭菌瓊脂(RCM)上梭菌的生長，除了菌落計數(shù)，還可以觀察菌落形態(tài)并與參考樣本比較。
[0065]在一些實施方案中，共接種物可隨副干酪乳桿菌CBA L74—起加入以幫助起始發(fā)酵。對奶產(chǎn)品發(fā)酵有用的共接種物包括，例如但不限于嗜熱鏈球菌(Streptococcusthermophilus)、副干酪乳桿菌、唾液乳酸桿菌(Lactobacillus salivarious)、鼠李糖乳桿菌(Lactobacillus rhamnosu)、干釀乳桿菌(Lactobacillus casei )、乳酸乳桿菌(Lactobacillus Iactis)、德氏乳桿菌(Lactobacillus delbrueckii )、保加利亞亞種、嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus)、短乳桿菌(Lactobacillusbrevis)或明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)。通常，共接種物的濃度將低于副干酪乳桿菌CBA L74的濃度，例如，約I X IO 4/ml X 105/ml。嗜熱鏈球菌的最終濃度可在約0.5 X 108/ml至約2.5 X IO8/ml的范圍內(nèi)。
[0066]食物產(chǎn)品
[0067]一旦已經(jīng)達到副干酪乳桿菌CBA L74的適合濃度，可將發(fā)酵食物進一步加工以供使用。在一些實施方案中，發(fā)酵食物產(chǎn)品的PH值可以通過加入NaOH或KOH來調(diào)節(jié)，例如從約3.0至接近中性諸如6.5。在一些實施方案中，可干燥發(fā)酵食物產(chǎn)品。發(fā)酵食物產(chǎn)品可以通過本領(lǐng)域已知的任何方法進行干燥，這將導致對發(fā)酵食物免疫調(diào)節(jié)特性的保持。示例性的干燥方法包括噴霧干燥、冷凍干燥例如凍干或轉(zhuǎn)鼓干燥。發(fā)酵食物產(chǎn)品的最終含水量可以變化但可以在約1%至約10%之間或更多。在一些實施方案中，干燥加工可以使副干酪乳桿菌CBA L74不復制。
[0068]干燥的發(fā)酵食物可在使用前水合。取決于水合中使用的液體的量，發(fā)酵食物產(chǎn)品可含有約IO2和1012cfu/ml當量的副干酪乳桿菌CBA L74。干燥后的副干酪乳桿菌CBA L74不形成菌落，所以可以理解的是這一量是基于干燥步驟前發(fā)酵食物中存在的活細菌的數(shù)目計算的。在一些實施方案中，發(fā)酵食物產(chǎn)品可以包括約IO7到約1012cfu/g，例如約5X IO7Cfu/g,約 I X 108cfu/g,約 5 X 108cfu/g,約 I X 109cfu/g,約 5 X 109cfu/g,約 I X IO10Cfu/g,約5X101Qcfu/g，約 lX10ncfu/g，約 5X10ncfu/g 的干重的當量。
[0069]本發(fā)明的方法制備的兩種或更多種發(fā)酵食物產(chǎn)品可在施用前組合。例如，發(fā)酵的奶產(chǎn)品可與發(fā)酵的谷類產(chǎn)品組合?？蛇x擇地，所述發(fā)酵食物產(chǎn)品可以與其它食物產(chǎn)品例如非發(fā)酵食物產(chǎn)品或使用其它菌株發(fā)酵的食物產(chǎn)品組合?？梢允褂萌魏谓M合，只要保留發(fā)酵食物的免疫調(diào)節(jié)特性。示例性的食物產(chǎn)品包括但不限于，奶制品，例如奶、酸奶、凝乳、奶酪、基于干奶酪的產(chǎn)品、發(fā)酵乳、基于奶的發(fā)酵產(chǎn)品、基于奶的粉末、嬰幼兒配方奶粉、基于奶的去渣嬰幼兒食物、雪糕、冰淇淋、布丁、湯、醬汁、果泥或調(diào)味品、老年人營養(yǎng)配方；谷物產(chǎn)品，例如pablum、基于谷類的去渣嬰幼兒食物、燕麥片、谷粉、小麥粉、玉米粥、面條、餅干、薄脆餅干、能量條；蔬菜產(chǎn)品，例如菜泥，基于蔬菜的去渣嬰幼兒食物，腌制蔬菜包括黃瓜、白菜、胡蘿卜、豆角、辣椒，或調(diào)味品；水果產(chǎn)品，例如基于水果的去渣嬰幼兒食物、番茄產(chǎn)品、果漿、醬汁劑、糊劑、ketchup、果泥；或基于蛋白的產(chǎn)品，例如豆類、香腸、午餐肉、熱狗或肉泥。在一些實施方案中，發(fā)酵食物可與寵物食物或動物飼料組合。
[0070]在一些實施方案中，所述組合物可以包含副干酪乳桿菌CBA L74的發(fā)酵物，已經(jīng)從其除去所有或基本上所有的副干酪乳桿菌CBA L74細胞。從生長培養(yǎng)基中分離細胞的方法是本領(lǐng)域眾所周知的并且可以依靠物理方法例如離心以產(chǎn)生細胞沉淀和培養(yǎng)上清液、過濾、超濾、切向流過濾、正常流動過濾或反滲透?？蛇x擇地或另外地，所述分離方法可以是基于配體的并包括，例如與副干酪乳桿菌CBA L74特異性結(jié)合的抗體。所述抗體可以被偶聯(lián)到固相支持物例如磁性珠上。
[0071]所分離的副干酪乳桿菌CBA L74
[0072]在一些實施方案中，本發(fā)明的組合物包括從它們生長的培養(yǎng)基部分或基本上分離的副干酪乳桿菌CBA L74。副干酪乳桿菌CBA L74可以是活的或是不復制的，例如滅活的，諸如通過熱處理。所述細胞可以在維持細胞生存力的條件下被凍干或冷凍干燥。凍干的方法是本領(lǐng)域內(nèi)熟知的。
[0073]生理學載體
[0074]在一些實施方案中，本發(fā)明的組合物可包括與生理上可接受的載體的組合的分離的副干酪乳桿菌CBA L74。副干酪乳桿菌CBA L74可以是活的或是不復制的，例如滅活的，諸如通過熱處理。劑量可變化但范圍可以在約102cfu/g約至約1012cfu/g,例如IXlO2Cfu/g、5X 102cfu/g、l X 103cfu/g、5X 103cfu/g、lX 104cfu/g、5X 104cfu/g、l X 105cfu/g、5X 105cfu/g、lX 106cfu/g、5X 106cfu/g、lX 107cfu/g、5 X 107cfu/g、I X 108cfu/g、5X 108cfu/g、lX 109cfu/g、5X 109cfu/g、lX 10lclcfu/g、5X 101Qcfu/g、lX 10ucfu/g、5 X 10ncfu/g、I X 1012cfu/g 的干重的當量。
[0075]生理學上可接受的載體可以是食物或食物產(chǎn)品。分離的副干酪乳桿菌CBAL74可在包裝或加工之前添加到食物或食物產(chǎn)品?？蛇x擇地或另外地，分離的副干酪乳桿菌CBAL74可在食用前添加到食物或食物產(chǎn)品。例如，分離的副干酪乳桿菌CBA L74可以與上述食物或食物產(chǎn)品中的任一種組合。食物產(chǎn)品可以是發(fā)酵食物產(chǎn)品或未發(fā)酵食物產(chǎn)品，例如，分離的副干酪乳桿菌CBA L74可被添加到未發(fā)酵的奶制品或谷物產(chǎn)品，在一些實施方案中，副干酪乳桿菌CBA L74可以添加到食物或食物產(chǎn)品以包括約IO7的到約1012cfu/g，例如約 5X107cfu/g、約 I X 108cfu/g、約 5X108cfu/g、約 I X 109cfu/g、約 5 X 109cfu/g、約lX101Qcfu/g、約 5X1010cfu/g、約 lX10ncfu/g、約 5X10ncfu/g 的干重的當量。.[0076]藥物載體
[0077]所述組合物還包含藥學上可接受的載體。我們使用的術(shù)語“藥學上可接受的”(或“藥理學上可接受的”)是指，適當?shù)兀┯糜趧游锘蛉藭r不產(chǎn)生不利的、變應(yīng)性的或其它不良反應(yīng)時的分子實體和組合物。術(shù)語“藥學上可接受的載體”，如本文所用，包括任何和所有溶劑、分散介質(zhì)、包衣、抗菌劑、等滲劑和吸收延遲劑、緩沖劑、賦形劑、粘合劑、潤滑劑、凝膠齊U、表面活性劑等，其可以作為介質(zhì)用于藥學上可接受的物質(zhì)。
[0078]本發(fā)明還包括含有與一種或多種藥學上可接受的載體組合的作為活性成分的本文所描述的副干酪乳桿菌CBA L74的藥物組合物。在一些實施方案中，副干酪乳桿菌CBAL74可在其與藥學上可接受的載體組合之前或之后用常規(guī)滅菌技術(shù)進行滅菌。在制造本發(fā)明的組合物時，副干酪乳桿菌CBA L74通常與賦形劑混合，用賦形劑稀釋或包封在例如膠囊、片劑、囊劑，紙或其他容器形式的載體內(nèi)。當賦形劑用作稀釋劑時，它可以是固體，半固體或液體材料(如生理鹽水)，其起到活性成分的賦形劑、載體或介質(zhì)的作用。因此，組合物可以是片劑、丸劑、粉末、錠劑、囊劑、扁囊劑、酏劑、懸浮液、乳液、溶液、糖漿、氣霧劑(作為固體或在液體介質(zhì)中)、軟膏、軟的和硬的明膠膠囊、栓劑、無菌注射溶液和無菌包裝粉末的形式。如本領(lǐng)域已知的，稀釋劑的類型可以根據(jù)施用的預(yù)期途徑而變化。所得到的組合物可以包括另外的劑，例如防腐劑。賦形劑或載體在施用模式和途徑的基礎(chǔ)上選擇。合適的藥物載體以及用于在藥物制劑中使用的藥劑必需品描述于Remington’s PharmaceuticalSciences (E.ff.Martin),本領(lǐng)域熟知的參考文本,和 USP/NF (United States Pharmacopeiaand the National Formulary)。適合的賦形劑的一些實例包括乳糖、葡萄糖、鹿糖、山梨糖醇、甘露糖醇、淀粉、阿拉伯膠、磷酸鈣、藻酸鹽、西黃蓍膠、明膠、硅酸鈣、微晶纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、纖維素、水、糖漿和甲基纖維素。所述制劑可以另外包括:潤滑劑例如滑石粉、硬脂酸鎂和礦物油；潤濕劑；乳化劑和懸浮劑；防腐劑例如甲基-和丙基羥基-苯甲酸酯；增甜劑以及調(diào)味劑?？梢耘渲扑鏊幬锝M合物以便通過使用本領(lǐng)域已知的程序施用于患者后提供活性組分的快速、持續(xù)或延遲釋放。
[0079]本發(fā)明方法中使用的藥學上可接受的組合物，包括其中副干酪乳桿菌CBAL74被包埋在用于口服遞送的膠體中的那些，可以根據(jù)標準技術(shù)來制備。副干酪乳桿菌CBA L74可被干燥并通過研磨或粉碎壓制，并插入膠囊用于口服施用。在一些實施方案中，副干酪乳桿菌CBA L74可與一種或多種賦形劑組合，例如崩解劑、填充劑、助流劑或防腐劑。適合的膠囊包括硬膠囊殼或軟殼膠囊兩者。任何基于脂質(zhì)或基于聚合物的膠體可被用于形成膠囊。對膠體制品有用的示例性的聚合物包括明膠、植物多糖或它們的衍生物例如卡拉膠和修飾形式的淀粉和纖維素諸如羥丙甲纖維素。任選地，其它組分可以被添加到所述膠凝劑溶液，例如增塑劑諸如甘油和/或山梨糖醇以減少膠囊的硬度、著色劑、防腐劑、崩解劑、潤滑劑和表面處理。在一些實施方案中，所述膠囊不包括明膠。在其它實施方案中，膠囊不包括植物多糖或它們的衍生物。
[0080]不論它們的原始來源或獲得它們的方式如何，本發(fā)明的副干酪乳桿菌CBAL74可以根據(jù)它們的用途來配制。這些組合物可以以制藥領(lǐng)域中熟知的方式來制備并且可以是通過各種途徑施用，其取決于是否需要局部或全身治療以及有待治療的區(qū)域。施用可以是口服或局部的(包括眼部和粘膜，包括鼻內(nèi)、陰道和直腸遞送)。在一些實施方案中，施用可以是肺部的(例如，通過粉末或氣霧劑的吸入或吹入，包括通過噴霧器；氣管內(nèi)、鼻內(nèi)、表皮和透皮)或經(jīng)眼的。用于經(jīng)眼遞送的方法可包括局部施用(滴眼液)，結(jié)膜下、眼周或玻璃體內(nèi)注射，或通過手術(shù)放置在結(jié)膜囊中的氣囊導管或眼用插入物引入。胃腸外施用包括靜脈內(nèi)、動脈內(nèi)、皮下、腹膜內(nèi)或肌內(nèi)注射或輸注；或顱內(nèi)，例如鞘內(nèi)或腦室內(nèi)施用。胃腸外施用可以是單次推注劑量的形式或者可以是例如通過連續(xù)灌注泵。用于局部施用的藥物組合物和制劑可以包括透皮貼劑、軟膏、洗劑、霜劑、凝膠、滴劑、栓劑、噴霧劑、液體、粉末等。常規(guī)的藥物載體，水性、粉末或油性基質(zhì)，增稠劑等可能是必要的或期望的。
[0081]所述組合物可以以單位劑型配制，每個劑型含有例如約0.005mg至約2000mg的副干酪乳桿菌CBA L74每每日劑量。術(shù)語“單位劑型”指適于作為單一劑量用于人類受試者和其它哺乳動物的物理上分離的單位，每個單位含有經(jīng)計算產(chǎn)生所期望的治療效果的預(yù)定量的活性物質(zhì)，與適合的藥物賦形劑相關(guān)。對于制備固體組合物例如片劑，將主要的活性成分與藥物賦形劑混合以形成含有本發(fā)明的化合物的均勻混合物的固體預(yù)制劑組合物。當提及這些預(yù)制劑組合物為均勻的時，活性成分通常均勻地分散在整個組合物中以使得所述組合物可以容易地細分成等效的單位劑型如片劑、丸劑和膠囊劑。這種固體預(yù)制劑之后細分成上述類型的單位劑型，其含有例如0.005mg至約IOOOmg的本發(fā)明的副干酪乳桿菌CBA L74。
[0082]組合物可以單位劑型配制，每個劑量含有例如約0.1mg至約50mg、約0.1mg至約40mg、約 0.1mg 至約 20mg、約 0.1mg 至約 10mg、約 0.2mg 至約 20mg、約 0.3mg 至約 15mg、約0.4mg 至約 10mg、約 0.5mg 至約 Img ;約 0.5mg 至約 lOOmg、約 0.5mg 至約 50mg、約 0.5mg 至約 30mg,、約 0.5mg 至約 20mg、約 0.5mg 至約 10mg、約 0.5mg 至約 5mg ；約 Img 至約 50mg、約Img至約30mg,、約Img至約20mg、約Img至約10mg、約Img至約5mg ;約5mg至約50mg、約5mg至約20mg、約5mg至約IOmg ;約IOmg至約lOOmg、約20mg至約200mg、約30mg至約150mg、約40mg至約lOOmg、約50mg至約IOOmg的活性成分。
[0083]在一些實施方案中，本發(fā)明的片劑或丸劑可以被包被或以另外方式混合以提供給予延長作用的優(yōu)點的劑型。例如，片劑或丸劑可以包含內(nèi)部劑量和外部劑量組分，后者是包裹整個前者的形式，這兩個組分可被抵抗在胃中崩解和允許內(nèi)部組分完整通過進入十二指腸或延遲釋放的腸溶層分開。各種材料可用于這樣的腸溶層或包衣，這些材料包括許多聚合酸以及聚合酸與例如紫膠、十六烷醇和乙酸纖維素的材料的混合物。
[0084]其中可摻入本發(fā)明的組合物用于口服或注射施用的液體形式包括水溶液、適當調(diào)味的糖漿、水性或油性懸浮液和用食用油例如棉籽油、芝麻油、椰子油或花生油調(diào)味的乳液以及酏劑和類似的藥物媒介物。
[0085]藥物組合物中本發(fā)明的組合物的比例或濃度可以隨許多因素變化，包括劑量、化學特性(例如疏水性)和施用途徑。例如，本發(fā)明的副干酪乳桿菌CBA L74可以提供在膠囊中，其含有約0.005mg克至約IOOOmg用于口服施用?？蛇x擇地或另外地，所述劑量可以表示為cfu/g干重。劑量可以變化，但是范圍可在約IO2至約1012cfu/g，例如IXlO2Cfu/g、5X 102cfu/g、l X 103cfu/g、5X 103cfu/g、lX 104cfu/g、5X 104cfu/g、l X 105cfu/g、5X 105cfu/g、lX 106cfu/g、5X 106cfu/g、lX 107cfu/g、5 X 107cfu/g、I X 108cfu/g、5X 108cfu/g、lX 109cfu/g、5X 109cfu/g、lX 10lclcfu/g、5X 101Qcfu/g、lX 10ucfu/g、5 X 10ncfu/g、I X 1012cfu/g 的干重。
[0086]使用方法
[0087]本文所公開的組合物通常并且不同地用于刺激粘膜免疫系統(tǒng)的免疫調(diào)節(jié)應(yīng)答。這些刺激有益的受試者包括具有粘膜免疫系統(tǒng)缺陷的那些例如具有不成熟免疫系統(tǒng)的那些諸如嬰兒或年幼兒童；具有受到抑制的免疫系統(tǒng)的那些例如老年人，接受免疫抑制藥物，輻射或化療的患者；具有歸因于變態(tài)反應(yīng)或自身免疫性病癥的超激活免疫系統(tǒng)的那些和患有胃腸道病癥的那些。胃腸道病癥可包括感染，其歸因于病毒例如輪狀病毒，致病性細菌例如沙門氏菌(Salmonella)、耶爾森氏菌(Yersinia)、志賀氏菌(Shigella)、李斯特氏菌(Listeria)、梭菌(Clostridium)、大腸桿菌(E.coli)、坂崎腸桿菌(E.sakazaki)、幽門螺旋桿菌(H, pylori);或致病原生動物,例如,溶組織內(nèi)阿米巴(Entamoeba histolytica),隱孢子蟲屬(Cryptosporidium spp),彎曲桿菌屬(Campylobacter spp)。胃腸道病癥也可包括，例如食物變態(tài)反應(yīng)、食物超過敏反應(yīng)、過敏性腸綜合征、腸易激綜合征、炎性腸病、結(jié)腸袋炎、克羅恩病、潰瘍性結(jié)腸炎、腹腔疾病、壞死性小腸結(jié)腸炎和老化，特別是胃腸系統(tǒng)的老化。
[0088]無論臨床上有利的結(jié)果隨后何時發(fā)生受試者都是被有效治療的。這可能意味著，例如與粘膜免疫系統(tǒng)缺陷有關(guān)的癥狀完全消退，與粘膜免疫系統(tǒng)缺陷有關(guān)的癥狀的嚴重程度的降低或與粘膜免疫系統(tǒng)缺陷有關(guān)的癥狀的進行的緩解。這些方法可以進一步包括下列步驟:a)識別患有粘膜免疫系統(tǒng)缺陷的受試者(例如，患者并且更具體地人類患者)；和b)向受試者提供包含本文所描述的副干酪乳桿菌CBA L74的組合物，例如在生理學上可接受的載體中包含副干酪乳桿菌CBA L74的任何發(fā)酵的食品產(chǎn)品或組合物。向受試者提供導致與粘膜免疫系統(tǒng)缺陷有關(guān)的癥狀完全消退，與粘膜免疫系統(tǒng)缺陷有關(guān)的癥狀的嚴重程度的降低或與粘膜免疫系統(tǒng)缺陷有關(guān)的癥狀的進行的緩解的這樣的組合物的量被認為是治療上有效的量。本發(fā)明的方法還可以包括監(jiān)測步驟以幫助優(yōu)化給藥和時間安排以及預(yù)測的結(jié)果O
[0089]本文公開的方法可應(yīng)用于廣泛范圍的物種，例如人類，非人類的靈長類(例如猴)，馬、豬、?；蚱渌倚螅鳛閷櫸镲曫B(yǎng)的狗、貓或其他哺乳動物，大鼠、小鼠或其它實驗室動物。本文所述的組合物是治療性組合物和治療方案中或用于在本文描述的病況(例如，歸因于不成熟的粘膜免疫系統(tǒng)缺陷、老化、感染、食物變態(tài)反應(yīng)、炎性或自身免疫性病癥)的治療中使用的藥物的制造中。
[0090]本文所述的營養(yǎng)組合物可以作為受試者的普通的日常飲食的一部分口服施用。食品組合物可以作為營養(yǎng)支持施用給兒童和成人。當配制成藥物時，所述組合物可以施用于宿主身體的任何部分以便隨后遞送至靶細胞。組合物可被遞送到，但不限于哺乳動物的腦、腦脊液、關(guān)節(jié)、鼻腔粘膜、血液、肺、腸、肌肉組織、皮膚或腹膜腔。在遞送路線方面，組合物可通過靜脈內(nèi)、顱內(nèi)、腹膜內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、肌肉內(nèi)、直腸內(nèi)、陰道內(nèi)、鞘內(nèi)、氣管內(nèi)、皮內(nèi)或經(jīng)皮注射施用，經(jīng)口或經(jīng)鼻施用，或通過隨時間逐步灌注，在另外的實例中，組合物的氣霧劑制品可以通過吸入提供給宿主。
[0091]不論組合物配制成食物產(chǎn)品還是藥品，所需的劑量將取決于施用途徑，制劑的性質(zhì)，受試者病況例如免疫系統(tǒng)的不成熟或胃腸道病癥的性質(zhì)，受試者的大小、重量、表面積、年齡和性別，施用的其他藥物和主治醫(yī)生的判斷。適合的劑量是在0.01-1, 000mg/kg的范圍內(nèi)。一些典型的劑量范圍是從約I μ g/kg至約lg/kg體重每天。在一些實施方案中，劑量范圍是從約0.01mg/kg到約100mg/kg體重每天。在一些實施方案中，劑量可以是,例如，lmg/kg、2mg/kg、5mg/kg、10mg/kg、20mg/kg、50mg/kg 或 100mg/kg。劑量可能取決于例如疾病或病癥的進行的類型和程度，具體患者的總體健康狀況，所選擇的化合物的相對生物效能，賦形劑的制劑以及其施用途徑的變量。
[0092]有效劑量可以從來自于體外或動物模型測試系統(tǒng)的劑量反應(yīng)曲線推斷。例如，經(jīng)由外周血單核細胞(PBMC)的細胞因子產(chǎn)生的體外分析可以分別對測定促炎性響應(yīng)和抗炎性響應(yīng)例如IL-1 β、IL-12、IL-4、TNF-α或IL-10的分泌有用的。也可分析組合物在動物模型中對例如IgA產(chǎn)生，經(jīng)由派伊爾淋巴集結(jié)外植體的細胞因子產(chǎn)生以及樹突狀細胞和T細胞響應(yīng)的作用。
[0093]鑒于各種細胞靶和各種施用途徑的不同效率，所需劑量的巨大變化是可以預(yù)期的。如本領(lǐng)域公知的，在這些劑量水平的變化可以使用標準的實驗程序調(diào)整以便優(yōu)化。施用可以是單次或多次的(例如，2-或3-、4-、6-、8-、10-、20-、50-、100-、150-或更多倍)。合適的遞送媒介物(例如聚合物微粒或植入裝置)中化合物的封裝可以提高遞送效率。
[0094]用本文所提供的任一種組合物治療的持續(xù)時間可以是時間從短至一天到長至宿主的生命周期(例如許多年)的任何時間長度。例如,組合物可以每周施用一次(例如,4周至多個月或多年)；每月一次(例如，三到十二個月或多年)，或每年一次為期5年、十年或更長的時間。還應(yīng)當注意，治療的頻率是可變的。例如，本發(fā)明組合物可以每日、每周、每月或每年施用一次(或兩次、三次等)。當將組合物配制成食品產(chǎn)品時，例如，所述組合物可以每天每餐施用。
[0095]任何本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法都可以被用于確定特定的響應(yīng)是否被誘導。可評估的特定疾病狀態(tài)的程度的臨床方法可以用來確定響應(yīng)是否被誘導。例如，可以監(jiān)測受治療者的癥狀緩解，例如從絞痛、腹瀉、便秘、惡心、嘔吐、腹痛、痙攣、胃灼熱、腹脹、脹氣或失禁緩解?？蛇x擇地或另外地，血清標志物、成像技術(shù)例如超聲、X射線和內(nèi)窺鏡方法都可以使用。
[0096]所述組合物也可與其他治療模式組合施用。其他治療方法將根據(jù)具體病癥而變化，但可包括，例如抗腹瀉藥、止吐藥、抗膽堿能劑、消炎劑、抗生素抗組胺和其他飲食治療，例如低變應(yīng)原嬰幼兒配方奶粉。兩種或多種治療劑同時施用不需要的有待施用的劑同時或通過相同的途徑施用，只要在藥物發(fā)揮它們治療作用器件在時間段上有重疊。同時或順序施用是預(yù)期的，正如在不同天或周施用。
[0097]制造的物品
[0098]本文描述的組合物也可以連同使用說明書一起組裝在套件中。因此，包裝的產(chǎn)品(例如，包含本文所描述副干酪乳桿菌CBA L74組合物中的一個或多個并被包裝以便以濃縮或隨時可用的濃度儲存、運輸或銷售的容器)和包括本發(fā)明的至少一種化合物和使用說明的試劑盒也在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。在包裝的產(chǎn)品或試劑盒中任一種中，副干酪乳桿菌CBAL74組合物可包括已經(jīng)使得不復制的副干酪乳桿菌CBA L74。例如，所述試劑盒可包括測定量的營養(yǎng)組合物，其包括副干酪乳桿菌CBA L74發(fā)酵的一種或多種食物產(chǎn)品。使用說明可以通過任何合適的介質(zhì)來傳達。例如，它們可以以一種或多種語言印刷在紙插頁上或者可聽或可視地(例如，在光盤上)提供。包裝材料可包括包裝材料，例如小瓶、包、容器。在一些實施方案中，所述試劑盒可以包括測定量的組合物，其包括在生理上可接受的載體中的副干酪乳桿菌CBA L74以及包裝材料和上述格式中任一種的使用說明。在一些實施方案中，所述試劑盒可以包括容器，其包含一種或多種副干酪乳桿菌CBA L74組合物，例如副干酪乳桿菌CBA L74和藥用載體，以及適合的穩(wěn)定劑、載體分子、調(diào)味劑和/或類似物中的一種或多種，如適于預(yù)期的用途的。產(chǎn)品可以包括含有一種或多種副干酪乳桿菌CBA L74組合物的容器(例如，小瓶、罐、瓶、袋或類似物)。此外，制造的物品可進一步包括，例如包裝材料、使用說明書、注射器、緩沖劑或其他對照試劑，以便治療或監(jiān)測需要預(yù)防或治療的病況。所述產(chǎn)品還可以包括圖例(例如描述該產(chǎn)品的用途的印刷標簽或插頁或其他介質(zhì)(例如音頻或錄像帶))。圖例可與容器相關(guān)聯(lián)(例如，固定于容器)，并且可以描述其中的化合物應(yīng)當被施用的方式(例如頻率和施用途徑)，其適應(yīng)癥和其它用途。所述試劑盒的組件可以適合于直接使用。所述化合物可以是隨時施用的(例如，以適合劑量的單位存在)，并且可包括藥學上可接受的佐劑、載體或其他稀釋劑和/或其它治療劑。然而，本發(fā)明包括試劑盒包括可能需要在使用前稀釋的濃縮的制劑和/或材料。可選擇地，所述化合物可以以濃縮的形式與稀釋劑和稀釋說明一起提供。所述試劑盒的組件可以適合于直接使用。然而，本發(fā)明包括試劑盒包括可能需要在使用前稀釋的濃縮的制劑和/或材料。
實施例
[0099]實施例1:副干酪乳桿菌CBA-174的分離和表征
[0100]我們分析了乳桿菌不同菌株的發(fā)酵含有不同濃度的稻米粉或面粉的含水懸浮液的能力?；诘蚿H值和高CFU計數(shù)選出副干酪乳桿菌CBA L74進一步分析。所述菌株根據(jù)國際承認用于專利程序的微生物保存布達佩斯條約于2008年9月9日保存在LAB0RAT0RIUMvoor Microbiologie (LMG)，Ghent, Belgium的比利時微生物協(xié)作保藏中心(BCCM)。由國際保存單位提供的保藏號為LMGP-24778。
[0101]實施例2:副干酪乳桿菌CBA L74發(fā)酵奶的制備
[0102]條件
[0103].底物9%重構(gòu)的脫脂奶粉，以0.25%添加葡萄糖
[0104].底物加熱處理:UHT - 135°C 3S或當量H)
[0105].共接種物:5X IO6的副干酪乳桿菌CBA-L74
[0106]5 X IO4 的嗜熱鏈球菌(為發(fā)酵狀態(tài))(as starter of the fermentation)
[0107].發(fā)酵溫度:37°C
[0108].發(fā)酵時間:15小時
[0109]?發(fā)酵期間的pH:未調(diào)節(jié)
[0110].發(fā)酵結(jié)束時用NaOH溶液將pH調(diào)節(jié)至6.5
[0111]?以190°C的進口溫度和90°C的出口溫度噴霧干燥。.[0112].分析:對發(fā)酵物細胞計數(shù)以確定嗜熱鏈球菌和副干酪乳桿菌CBA-L74
[0113]鋪板:乳酸桿菌選擇性瓊脂(LBS)被用于檢測副干酪乳桿菌CBA-L74。L-M17瓊脂用于嗜熱鏈球菌計數(shù)。兩者都于37°C厭氧。平板計數(shù)瓊脂(PCA)被用于檢測的污染物并在30°C需氧孵育。
[0114]發(fā)酵:副干酪乳桿菌CBA L74和嗜熱鏈球菌1773共接種物作為新鮮培養(yǎng)物加入。進行發(fā)酵15小時至以108cfu/mL的副干酪乳桿菌CBA-L74濃度。初始pH為6.6。在發(fā)酵結(jié)束時的pH為5.1。pH通過加入2.5N NaOH調(diào)節(jié)至6.5。副干酪乳桿CB-74的初始濃度為5X106CFU/mL ;最終濃度高于108CFU/mL。嗜熱鏈球菌的初始濃度為5X 104CFU/mL ;最終濃度為I X 108CFU/mL。接種之前以及在TO奶中PCA上最初的細菌計數(shù)為O而15小時發(fā)酵期后菌落太少而無法計數(shù)(TFTC)。為5X 104CFU/mL ;最終濃度為I X 108CFU/mL。
[0115]干燥:將發(fā)酵物以190°C的進口溫度和90°C的出口溫度干燥。噴霧干燥后粉末的含濕量為4.87%。
[0116]實施例3:副干酪乳桿菌CBA L74發(fā)酵的燕麥和大麥面粉的制備
[0117]我們用185克燕麥粉和9.25克大麥麥芽粉制備了 18.5% (w/vol)燕麥粉+5% (w/w)麥芽粉的一升溶液。用0.5M檸檬酸將面粉與水的混合物調(diào)節(jié)至pH4.00。在發(fā)酵罐通過高壓滅菌滅菌。然后將面粉+水+檸檬酸的混合物加入到發(fā)酵罐中。[0118]將混合物在80°C加熱處理30分鐘，然后冷卻至37°C。測試了三組不同的發(fā)酵條件。16小時后終止所有發(fā)酵，這一時間與對數(shù)期生長的結(jié)束一致。
[0119]試驗# 1:將副干酪乳桿菌CBA L74加入到熱處理過的谷物溶液至2.3X106CFU/ml的最終濃度并和在37°C下伴隨攪拌孵育。16小時后MRS中計數(shù)板為7.6X 108UFC/ml(乳酸菌)，在PCA、MC和SB中測量到的污染物均低于1000UFC/ml。最終的pH為3.8。20小時后MRS中計數(shù)板為1.2X 108UFC/ml(乳酸菌);無污染物。24小時后MRS中計數(shù)板為5 X IO8UFC/ml (乳酸菌)；無污染物。因為16小時后對數(shù)生長期結(jié)束，因此優(yōu)選在16小時停止發(fā)酵。
[0120]試驗# 2 (pH值穩(wěn)定化)通過用2N NaOH將pH保持在4進行這一發(fā)酵。將副干酪乳桿菌CBA L74加入到熱處理過的谷物溶液至2.1 X 106CFU/ml的終濃度并在37°C伴隨攪拌孵育。16小時后MRS中計數(shù)板為7.5X108UFC/ml (乳酸菌)，在PCA、MC和SB中測量到的污染物均低于1000UFC/ml。
[0121]試驗# 3 (pH值穩(wěn)定化)通過用2N NaOH將pH保持在4進行這一發(fā)酵。將副干酪乳桿菌CBA L74加入到熱處理過的谷物溶液至5.1 X 106CFU/ml的終濃度并在37°C伴隨攪拌孵育。16小時后MRS中計數(shù)板為2.1 X 109UFC/ml (乳酸菌)，在PCA、MC和SB中測量到的污染物均低于1000UFC/ml。.[0122]實施例4:副干酪乳桿菌CBA L74發(fā)酵的稻米和小麥粉的制備
[0123]我們通過將150g稻米和900ml水混合制備15%重量/體積的稻米的一升溶液。在室溫下制備混合物并通過在1000-1300rpm振蕩數(shù)分鐘混合。稻米混合物通過在70°C下加熱儀器內(nèi)部的混合物間歇滅菌，每20-30分鐘在70°C饑餓，冷卻至30-37°C，每20-30分鐘在30-37 V饑餓，70 V加熱，，每20-30分鐘在70 V饑餓，在發(fā)酵溫度(37°C )冷卻同時以150-600rpm振蕩來處理。
[0124]加入來自冷凍干燥樣品的副干酪乳桿菌CBA L74至I X 106CFU/ml的終濃度。將冷凍干燥樣品重懸于水中并在37°C短暫孵育以活化細菌。接種后將混合物通過在300-600rpm短暫振蕩來均質(zhì)化；發(fā)酵期間以150rpm振蕩溶液。發(fā)酵反應(yīng)在〈15%的p02于37°C進行24小時。在接種時間(T0)、16時(Τ16)、18小時(Τ18)、21小時(Τ21)和24小時(Τ24)收集等份試樣.發(fā)酵后，谷物伴隨連續(xù)攪拌加熱至50°C。加熱的谷物然后在T空氣人口 80°C，T空氣出口 210°C噴霧干燥。最終的含水率為6%。
[0125]在Rogosa瓊脂(+萬古霉素12微克/ml) (48小時于37°C )上分析樣品的副干酪乳桿菌CBA-174定量，PCA上(24小時于37°C )的總需氧菌，McConkay瓊脂上的大腸桿菌和RCM瓊脂上的梭菌。
[0126]這一發(fā)酵的結(jié)果如下:
[0127]接種物(副干酪乳桿菌CBA-174):1 X IO6 (+/_l/21og) CFU/ml (在儀器上)發(fā)酵24小時后副干酪乳桿菌CBA L74濃度:1 X IO8 (+/-l/21og) CFU/ml
[0128]接種前PCA上的污染物:〈104CFU/ml
[0129]接種前McConkay 上的污染物:〈104CFU/ml
[0130]接種前RCM上的污染物:〈10CFU/ml
[0131]接種后上的污染物PCA:<104CFU/ml
[0132]發(fā)酵24小時后PCA上的污染物:〈104CFU/ml
[0133]加入接種物之前的pH:6 (+/-0.20)[0134]16-18 小時的 pH:3.70(+/-0.20)
[0135]24 小時的 pH: 3.60 (+/-Ο.20)。
[0136]實施例5:在CAC02細胞共培養(yǎng)系統(tǒng)中副干酪乳桿菌CBA對樹突狀細胞的影響L74
[0137]我們分析了腸上皮細胞(Caco2細胞)和人樹突狀細胞(DC)的共培養(yǎng)物中活的和不復制的副干酪乳桿菌CBA L74的作用。Caco2細胞接種于Transwell膜并且在約3周后，當跨膜電阻抗足夠時，補充副干酪乳桿菌CBA L7496小時。人DC是從外周血單核細胞分化的并接種在共培養(yǎng)腔室的基底室中。實驗過程中跨膜電阻抗保持不變。
[0138]為了表征DC表型，我們通過細胞熒光分析監(jiān)測共刺激分子(⑶80和⑶86)、MHC-1I和粘附分子(⑶40)的DC細胞表面表達。為了確定與腸上皮細胞共培養(yǎng)的DC產(chǎn)生的細胞因子譜暴露于副干酪乳桿菌CBA L74，我們收集培養(yǎng)基并通過ELISA量化IL-1O和IL-12p70。為了驗證暴露于副干酪乳桿菌CBA L74的Caco2細胞調(diào)節(jié)DC以促進T細胞增殖的能力，我們進行FACS分析并且混合淋巴細胞培養(yǎng)物。
[0139]如圖1的表所示，將Caco2細胞與活的或失活的(熱滅活)副干酪乳桿菌CBA L74孵育24小時改變共培養(yǎng)的樹突狀細胞的表型。此外副干酪乳桿菌CBA L74的存在調(diào)節(jié)DC表型中LPS介導的變化。
[0140]之后我們將從與用副干酪乳桿菌(活的或滅活的)處理的Caco2細胞共培養(yǎng)的DC釋放的細胞因子定量。如圖2a中所示，與暴露于活的或滅活的副干酪乳桿菌CBA L74的Caco2共培養(yǎng)的DC顯示統(tǒng)計學上顯著的IL-1O產(chǎn)生的增加。在沒有LPS時，我們并沒有觀察到IL-12產(chǎn)生的顯著增加(圖2b)。然而，DC保留經(jīng)由增強IL-12產(chǎn)生響應(yīng)于LPS激發(fā)的能力，這表明暴露于副干酪乳桿菌CBA L74并沒有影響DC響應(yīng)于病原體的整體能力。
[0141]然后，我們進行了功能測定來驗證暴露于在培養(yǎng)基或補充副干酪乳桿菌的培養(yǎng)基存在時培養(yǎng)的Caco2細胞的DC調(diào)節(jié)T細胞在混合淋巴細胞反應(yīng)后增殖的能力的能力。如圖3所示，我們沒有觀察到與CaCo2細胞共培養(yǎng)的DC在改變T細胞增殖的能力上的顯著差
巳升。
[0142]綜合來看，在體外數(shù)據(jù)表明，副干酪乳桿菌CBA L74，活的或者熱失活的，影響腸道上皮細胞所產(chǎn)生的環(huán)境，其反過來調(diào)節(jié)其他免疫細胞例如DC的活性?？傮w情況表明,暴露于Caco2處理的培養(yǎng)基的DC降低活化標記的表達，產(chǎn)生抗炎細胞因子例如IL-10，同時保留通過增強IL-12產(chǎn)生響應(yīng)于LPS的能力。
[0143]實施例6:副干酪乳桿菌CBA L74對整個腸粘膜中形態(tài)學，細胞因子的表達和先天性免疫性的影響
[0144]我們通過作為小鼠中的膳食補充施用副干酪乳桿菌CBA L74 (活的和熱失活的)來檢測體內(nèi)影響。補充兩周后，將動物處死并分析整個腸粘膜。
[0145]粘膜形態(tài):我們進行石蠟包埋的回腸切片的蘇木精和曙紅染色。補充劑中無一對腸結(jié)構(gòu)有顯著作用或引起炎性細胞浸潤。
[0146]細胞因子和IgA的表達:之后我們確定副干酪乳桿菌CBA L74 (活的或失活的)的施用是否會影響腸粘膜中抗炎性細胞和促炎性細胞因子的水平。如圖4所示，活的或失活的副干酪乳桿菌CBA L74的施用顯著降低小鼠腸粘膜中IL-1 β，一種強效的促炎介質(zhì)，的水平。正如圖5所示，我們還觀察到施用活的或失活的副干酪乳桿菌CBA L74之后基底粘膜IL-4水平的減少。最后，我們確定了不同方案的補充對粘膜IgA水平的影響。飲食補充副干酪乳桿菌CBA L74兩周后，處死動物并收集和勻漿化腸粘膜。然后通過ELISA測量總IgA并將值對總粘膜蛋白標準化。如圖6中所示，加熱殺死的副干酪乳桿菌CBA L74顯著增加粘膜 IgA。
[0147]先天免疫:我們分析了飲食補充對Toll樣受體2、4和9水平的影響。這些受體參與識別保守的細菌結(jié)構(gòu)并因此在調(diào)節(jié)免疫和非免疫細胞對微生物保守結(jié)構(gòu)的反應(yīng)性中起到關(guān)鍵作用。如圖7所示，飲食補充活的或熱失活的副干酪乳桿菌CBA L74增加TLR2和TLR4的蛋白表達水平。我們也測定了飲食補充對粘膜中PPARy水平的影響。如圖8所示，活的副干酪乳桿菌CBA L74顯著增加PPAR Y的水平。
[0148]實施例7:副干酪乳桿菌CBA L74對循環(huán)細胞因子水平的影響
[0149]為了測定飲食補充是否能改變循環(huán)細胞因子的水平，我們測量所述菌株(活的或失活的)的飲食施用對血清中抗炎細胞因子和促炎細胞因子水平的影響。如圖9A和9b所示，活的副干酪乳桿菌CBA L74分別誘導IL-1 β統(tǒng)計學上顯著的減少和循環(huán)IL-4的適度增加。
[0150]實施例8:副干酪乳桿菌CBA L74對樹突狀細胞和T淋巴細胞活性的影響
[0151]接下來，我們專注飲食補充副干酪乳桿菌CBA L74對與粘膜相關(guān)免疫系統(tǒng)的活性有關(guān)的免疫細胞，即樹突狀細胞和淋巴細胞，的影響。我們評估了派伊爾淋巴集結(jié)(PP)中DC的表型，因為這些細胞在確立抗原命運上有幫助并有助于將決定適應(yīng)性免疫應(yīng)答的性質(zhì)的環(huán)境。
[0152]如圖10中的表所示，副干酪乳桿菌CBAL74補充劑(活的或失活的)降低了共刺激分子CD80和粘附分子CD40的表達而MHCII表達上調(diào)，這些數(shù)據(jù)顯示來自補充副干酪乳桿菌CBA L74的動物的DC似乎并未準備好與T細胞相互作用并發(fā)動免疫反應(yīng)，但它們加工和呈遞抗原的能力被保留。
[0153]之后，我們確定飲食補充副干酪乳桿菌CBA L74改變DC對促炎刺激(例如細菌LPS和CpG)的反應(yīng)性的能力。來自對照小鼠的DC對LPS或CpG的暴露在對照DC中誘導⑶80的強烈上調(diào)。補充熱失活副干酪乳桿菌CBA L74沒有改變DC對炎癥刺激的反應(yīng)性。補充活細菌顯著降低LPS和CpG誘導的⑶80上調(diào)。
[0154]最后，我們研究飲食補充副干酪乳桿菌CBA L74 (活的或失活的)是否影響腸道T-淋巴細胞(⑶4+和⑶8+)朝Thl或Th2表型的極化。為了這些研究，將派伊爾淋巴集結(jié)暴露于PHA，一種強的非特異性刺激物，并且之后通過對IL-4和IFN- Y的內(nèi)部因子(intrakine)染色評價淋巴細胞極化。如圖1la所示，⑶4+淋巴細胞中不存在PHA (“基礎(chǔ)條件”)時，IL-4和IFN幾乎處于平衡狀態(tài)。約10-12%的細胞對于這些細胞因子是陽性的。如圖1lb所示，對于基礎(chǔ)條件下的⑶8+淋巴細胞，IL-4對IFN表達細胞有輕微優(yōu)勢。⑶4+或⑶8+淋巴細胞暴露于PHA導致偏向IFN- Y產(chǎn)生的IL-4和IFN- Y的細胞內(nèi)染色的強勁增加。
[0155]在⑶4+細胞中，飲食補充活的副干酪乳桿菌CBA L74增加基礎(chǔ)條件的IFN- Y水平。PHA暴露之后，補充的組中無響應(yīng)上的顯著差異(圖11a)。在⑶8+淋巴細胞中，口服補充失活的副干酪乳桿菌CBA L74有利于IL-4產(chǎn)生超過IFN- Y產(chǎn)生的Th2概況(圖1lb)抗炎概況進一步得到對PHA的遲鈍響應(yīng)的支持。類似的趨勢在從補充活的副干酪乳桿菌CBA-L74的小鼠中分離的⑶8+淋巴細胞中也是明顯的，雖然不是顯著的。[0156]實施例9:通過副干酪乳桿菌CBA L74發(fā)酵的奶對腸粘膜中免疫系統(tǒng)標志物的影響
[0157]小鼠每日兩次補充下列之一兩周:1)對照(PBS) ;2)脫脂奶(未發(fā)酵的)；3)用副干酪乳桿菌CBA L74 (lX108cfu/ml)發(fā)酵的脫脂奶；4)用嗜熱鏈球菌(6.7xl06cfu/ml)發(fā)酵的脫脂奶；5)用副干酪乳桿菌CBAL74 (lX108cfu/ml)和嗜熱鏈球菌(1.18xl07cfu/ml)發(fā)酵的脫脂奶；6)用副干酪乳桿菌CBA L74 (1.9X 108cfu/ml)和嗜熱鏈球菌(2.2xl08cfu/ml)發(fā)酵的脫脂奶。在處理結(jié)束時處死動物并收集和加工腸粘膜和派伊爾淋巴集結(jié)以便如下所述進行分析。
[0158]腸粘膜中的細胞因子水平。如圖12所示，補充副干酪乳桿菌CBA L74發(fā)酵的脫脂奶導致腸粘膜中顯著增加的IL-10水平。施用嗜熱鏈球菌發(fā)酵的脫脂奶誘導與對照相比輕微的減少。以較高劑量施用兩種菌株發(fā)酵的奶誘導粘膜IL-10的2.1倍的增加。沒有處理對粘膜IL-1 β有任何顯著作用，盡管補充副干酪乳桿菌CBA L74發(fā)酵的脫脂奶引導致這一細胞因子粘膜水平的輕微增加。
[0159]腸粘膜中髓過氧化物酶活性。測定腸粘膜組織勻漿中的髓過氧化物酶(MPO)活性。施用未發(fā)酵的或用不同的細菌發(fā)酵的奶沒有誘導髓過氧化物酶活性的統(tǒng)計學上顯著的差異，盡管在接受非發(fā)酵奶的動物的粘膜中觀察到MPO活性輕微增加。
[0160]腸粘膜中的IgA水平。如圖14所示，補充未發(fā)酵脫脂奶導致腸粘膜IgA的顯著增力口。補充用副干酪乳桿菌CBA L74或嗜熱鏈球菌單獨發(fā)酵的脫脂奶的動物中沒有觀察到這一增加。以較高劑量施用兩種菌株發(fā)酵的奶誘導粘膜IgA的增加。
[0161]腸粘臘中TLR2、TLR4、TLR9和PPAR Y的水平。梓下來我們通i寸免瘡印跡(TO)確定先天免疫系統(tǒng)的關(guān)鍵受體的粘膜水平。如圖15所示，沒有一種處理對TLR4受體表達有任何顯著影響。未發(fā)酵的奶引起TLR2的適度增加。以較低劑量施用副干酪乳桿菌CBA L74或嗜熱鏈球菌單獨或組合發(fā)酵的脫脂奶的防止這種作用。與單獨的奶相比，TLR2的適度增長在以較高劑量接受兩種菌株發(fā)酵的奶的小鼠中也是明顯的。施用僅脫脂奶對TLR9水平產(chǎn)生很大影響，而施用兩種菌株發(fā)酵的奶與對照相比重新確立粘膜水平。如圖15所示，施用未發(fā)酵的奶本身導致粘膜PPARy的強勁增長，類似的作用在補充副干酪乳桿菌CBAL74發(fā)酵的脫脂奶和低劑量的兩種菌株發(fā)酵的奶的小鼠中是明顯的。
[0162]腸粘膜中PNF-K B和IKB的水平。我們測定NF-K B，參與腸道炎癥和上皮細胞存活兩者的一種關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，的活化狀態(tài)。如圖16所示，在對照，正常粘膜，中活化的NF-K B(pNF-κΒ)是可檢測的。不同的處理后，我們僅觀察到pNF-κ B的水平在用副干酪乳桿菌CBA L74或嗜熱鏈球菌單獨發(fā)酵的脫脂奶處理的小鼠的粘膜中輕微增加，而在接受用兩種菌株發(fā)酵的脫脂奶的小鼠中，PNF-K B與對照相當。pNF-κ B的增加與在補充用副干酪乳桿菌CBA L74或嗜熱鏈球菌單獨發(fā)酵的脫脂奶的小鼠的粘膜中是不可檢測的NF-κ B的抑制性亞基，IKB，的消失平行。接受用兩種菌株發(fā)酵的脫脂奶的小鼠表現(xiàn)出與對照相當?shù)腎KB水平。
[0163]實施例10:用副干酪乳桿菌CBA L74發(fā)酵的奶對腸粘膜中樹突狀細胞表型的影響
[0164]樹突狀細胞的表型是從派伊爾淋巴集結(jié)提取的。我們研究了飲食補充對腸道DC表型的影響。這一分析的結(jié)果示于圖17。于對照小鼠相比以較低和較高劑量施用用副干酪乳桿菌單獨以及副干酪乳桿菌和嗜熱鏈球菌發(fā)酵的奶產(chǎn)生統(tǒng)計學上顯著的CD80和CD86表達的減少(*表示P〈0.05對比對照組)，而HLAII和⑶40水平總體保持穩(wěn)定。圖17中的數(shù)據(jù)表示為三個獨立實驗的平均值土標準偏差。
[0165]暴露于LPS/CpG的樹突狀細胞的響應(yīng)。我們測定飲食補充改變DC對促炎刺激(例如細菌LPS和CpG)的反應(yīng)性的能力。如圖18所示，分離自對照動物的分離的DC暴露于LPS和CpG導致⑶80表達顯著增加(*表示P〈0.05對比來自對照小鼠的未刺激的DC)。在從接收用未發(fā)酵的奶處理的小鼠純化的DC中觀察到的類似的作用(°表示P〈0.05對比來自用未發(fā)酵的奶處理的小鼠的未刺激的DC)。施用用副干酪乳桿菌CBA L74單獨發(fā)酵的脫脂奶完全阻止了未發(fā)酵的奶處理的小鼠中LPS介導的作用，但是它對CpG誘導的⑶80表達上調(diào)不太有效。用嗜熱鏈球菌單獨發(fā)酵的脫脂奶阻止LPS和CpG的作用，并減少⑶80表達。最后，施用用兩種菌株發(fā)酵的脫脂奶抑制LPS和CpG誘導的CD80上調(diào)和將CD80表達維持在基底水平。在圖18中的數(shù)據(jù)表示為三個獨立實驗的平均值土標準偏差。
[0166]實施例11:用副干酪乳桿菌CBA L74發(fā)酵的奶對腸粘膜中T淋巴細胞表型的作用
[0167]暴露于PHA的腸道淋巴細胞⑶4+e⑶8+的反應(yīng)。我們想知道飲食補充奶(發(fā)酵或不發(fā)酵的)是否會影響腸道T淋巴細胞(⑶4+和⑶8+)朝向Thl或Th2表型的極化。派伊爾淋巴集結(jié)來源的淋巴細胞暴露于PHA，然后通過細胞內(nèi)IL-4和IFN-Y的染色評價淋巴細胞極化。
[0168]如圖19中所示，暴露于PHA顯著增加來自對照小鼠的⑶4+淋巴細胞中IL_4和IFNy的產(chǎn)生(*表示P〈0.05，對比來自對照小鼠的未刺激的淋巴細胞)。這種誘導在用未發(fā)酵或發(fā)酵的奶處理的小鼠中均未觀察到。補充未發(fā)酵的奶之后，與對照動物相比CD4+淋巴細胞顯示IL4和IFN-Y的提高的基礎(chǔ)水平(°表示P〈0.05，對比來自對照小鼠的未刺激的淋巴細胞)。這些數(shù)據(jù)表明，補充發(fā)酵的奶阻止非特異性活化并且將IL4和IFN-Y產(chǎn)生保持在基礎(chǔ)水平。
[0169]如圖20中所示，來自對照小鼠的⑶8+腸道淋巴細胞中暴露于PHA增加IL4和IFNy的產(chǎn)量(*表示P〈0.05，對比來自對照小鼠的未刺激的淋巴細胞)。這種誘導在用未發(fā)酵或發(fā)酵的奶處理的小鼠中均未觀察到。以較高劑量施用副干酪乳桿菌和嗜熱鏈球菌發(fā)酵的奶減少了基本的IL4產(chǎn)生，然而用PHA刺激后，IL4和IFNy的水平與來自對照小鼠的刺激的淋巴細胞相比減少(§表示P〈0.05)實施例12:用副干酪乳桿菌CBA L74發(fā)酵的奶對腸粘膜組織學的影響
[0170]為了確定腸粘膜中增殖細胞的分布，我們進行了 Ki67，分裂中細胞表達的一種抗原，的免疫組化分析。在對照組小鼠中，小腸隱窩有清楚的免疫反應(yīng)而在絨毛上無染色。在接收未發(fā)酵的奶的老鼠組織中，在隱窩有較強的表達，但是沒有抗原的異位表達小鼠組織。在接收不同類型的發(fā)酵奶的老鼠組織中，我們觀察到類似的染色模式。我們已經(jīng)進行了不同的實驗組的回腸粘膜的組織學評價。本研究的結(jié)果示于圖21。施用未發(fā)酵的奶減少了小腸絨毛的數(shù)目和長度，然而腸形態(tài)在接收的各種形式的發(fā)酵奶的動物中被保持。
[0171]實施例13:副干酪乳桿菌CBA L74發(fā)酵的稻米對腸粘膜免疫系統(tǒng)中的標志物影響
[0172]設(shè)計這些實驗以評估副干酪乳桿菌CBA-L74發(fā)酵的谷物的免疫調(diào)節(jié)特性。研究包括每日胃內(nèi)施用下列兩周:1)未發(fā)酵的稻米；2)發(fā)酵的稻米(用副干酪乳桿菌CBA L74)IOOmg每天(相當于2X IO8CfVL的副干酪乳桿菌CBA-L74);和3)發(fā)酵的稻米(用副干酪乳桿菌CBA L74)500mg每天(相應(yīng)于109cfu/L的副干酪乳桿菌CBA-L74)。處理期間小鼠沒有表現(xiàn)生病或腹瀉的任何跡象。在處理結(jié)束時處死小鼠并無菌收集派伊爾淋巴集結(jié)(PP)。通過在無Ca2+加EDTA的HBSS中孵育從PP移除上皮細胞并且之后組織經(jīng)受酶消化。清洗單細胞懸浮液、重懸于冷的RMPI并用于以下試驗。
[0173]我們最初檢查不同飲食補充對整個腸道粘膜的效果。首先，我們進行石蠟包埋回腸切片的蘇木精和曙紅染色。所使用的飲食補充中沒有一種對腸道結(jié)構(gòu)有顯著作用或引起炎癥細胞浸潤。
[0174]之后，我們測定施用副干酪乳桿菌CBA L74發(fā)酵的稻米是否會影響腸道粘膜中抗炎性細胞因子和促炎性細胞因子的水平。如圖22所示，施用稻米或發(fā)酵的稻米都增加粘膜IL-1 β和IL-4。以最高劑量補充發(fā)酵的稻米導致IL-10減少，如圖23中所示。
[0175]之后，我們測定不同處理方案的補充對粘膜IgA水平的影響。兩個星期的飲食補充后，處死動物并收集和勻漿化腸粘膜?？侷gA用ELISA測量并且將值對總粘膜蛋白標準化。沒有一種補充對粘膜IgA具有顯著作用。
[0176]我們分析了稻米或副干酪乳桿菌CBAL74發(fā)酵的稻米對腸粘膜先天免疫性的影響。如圖24所示，飲食補充稻米和發(fā)酵的稻米(低劑量)對粘膜TLR僅有溫和的影響。如圖25a所示，飲食補充未發(fā)酵的稻米急劇增加粘膜PPAR Y水平。高劑量的發(fā)酵稻米也增加粘膜PPARy水平。如圖25b中所示，兩個星期飲食補充未發(fā)酵的稻米在粘膜中減少NF-κ B活化并增加IKB。低劑量補充發(fā)酵的稻米與對照相比無效果，而較高劑量有與用未發(fā)酵的稻米所觀察到的那些相當?shù)男Ч?br> [0177]我們還測量了飲食施用對血清中抗炎細胞因子和促炎細胞因子水平的影響。飲食補充稻米或發(fā)酵的稻米(低劑量)對血清IL-1 β和IL-4水平無影響。實施例14:副干酪乳桿菌CBA L74發(fā)酵的稻米對腸粘膜中樹突狀細胞表型的影響
[0178]接下來，我們專注飲食補充未發(fā)酵的稻米或副干酪乳桿菌CBA L74發(fā)酵的稻米對與粘膜相關(guān)免疫系統(tǒng)的活性有關(guān)的免疫細胞，即樹突狀細胞和淋巴細胞，的影響。首先，我們用抗⑶I (識別DC)以及用抗⑶-80和⑶-86、MHC-1I和⑶-40標記單細胞懸浮液以確定在這些淋巴器官中腸道DC的活性和成熟度水平。如圖26中的表所示，我們觀察到高劑量發(fā)酵的稻米對DC表型的顯著作用。補充未發(fā)酵的稻米(在這些實驗中，我們使用兩種不同劑量)沒有任何影響，而發(fā)酵的稻米對CD80、CD40和MHC-1I水平的影響在IOOmg/天是很明顯的，并且在500mg/天更明顯。
[0179]我們接下來確定飲食補充稻米或副干酪乳桿菌CBA L74發(fā)酵的稻米改變DC對促炎刺激(如細菌LPS和CpG)的反應(yīng)性的能力。如圖27中的表所示，來自對照小鼠的DC對LPS或CpG的暴露誘導對照DC的CD80上調(diào)。補充未發(fā)酵的稻米沒有改變對炎癥刺激的反應(yīng)性。補充測試劑量的發(fā)酵的稻米減少LPS和CpG誘導的CD80上調(diào)。
[0180]實施例15:副干酪乳桿菌CBA L74發(fā)酵的稻米對在腸粘膜T淋巴細胞表型的影響
[0181]我們研究了飲食補充稻米或副干酪乳桿菌CBA L74發(fā)酵的稻米是否能夠影響腸道T淋巴細胞(無論是⑶4+和⑶8+)朝向Thl或Th2表型的極化。來自派伊爾淋巴集結(jié)的淋巴細胞暴露于PHA并且之后通過IL-4和IFN- Y的內(nèi)部因子染色來評價淋巴細胞極化。
[0182]⑶4+和⑶8+淋巴細胞這一實驗的結(jié)果分別示于圖28和2。如圖28所示，在基礎(chǔ)條件下，在⑶4+淋巴細胞中IL-4和IFNy因為約10-12%的細胞對這些細胞因子是陽性的而幾乎處于平衡。如圖29所示，⑶8+中，在基礎(chǔ)條件下IL-4有輕微超過IFNy表達細胞。⑶4+或⑶8+淋巴細胞暴露于PHA導致IL-4和IFN Y的細胞內(nèi)染色的強勁增長，IFN Y的產(chǎn)生占優(yōu)勢。
[0183]在接受未發(fā)酵的稻米的小鼠中在基礎(chǔ)條件和對CD4+和CD8+淋巴細胞兩者的PHA刺激之后，我們觀察到占優(yōu)勢的IL-4產(chǎn)生(Th2表型)。然而，IL-4產(chǎn)生與基礎(chǔ)條件下IFNy產(chǎn)生的持續(xù)性相關(guān)，并且PHA刺激之后我們觀察到雖然與對照細胞相比響應(yīng)是遲鈍的但這一細胞因子的表達增加了。在基礎(chǔ)條件下接受發(fā)酵的稻米的小鼠中觀察到IFNy陽性細胞超過IL-4的優(yōu)勢，雖然在基礎(chǔ)條件下與對照組相比百分比是相當?shù)?對⑶4+)或稍有降低的(對于⑶8+)。PHA刺激之后，在這兩種細胞群中細胞因子響應(yīng)與對照小鼠相比遲鈍，但是針對Thl表型(IFNy陽性細胞占優(yōu)勢)。
[0184]實施例16:鼠傷寒沙門氏菌存在時副干酪乳桿菌CBA L74對單核細胞來源的樹突狀細胞(MoDC)中IL-1O產(chǎn)生的影響
[0185]我們測試了副干酪乳桿菌CBA L74細胞和副干酪乳桿菌CBA L74細胞上清液兩者在細菌病原體鼠傷寒沙門氏菌存在時誘導人類MoDC中促炎性細胞因子IL-1O產(chǎn)生的能力。人類MoDC從至少4個供體，并且在某些情況下，7個供體得到。如圖30所示，鼠傷寒沙門氏菌(“FB62”)，對照乳桿菌副干酪乳桿菌21060 (“B21060”)和副干酪乳桿菌CBA L74 (“CBAL74”)細胞中都誘導IL-1O產(chǎn)生。相反，盡管鼠傷寒沙門氏菌上清液(“sn fb62”)誘導IL-1O產(chǎn)生，但來自兩種乳桿菌，乳桿菌菌株副干酪乳桿菌21060 (“snb21060”)和副干酪乳桿菌CBA L74 (“sn cbal74”)的上清液并沒有。副干酪乳桿菌CBA L74上清液與鼠傷寒沙門氏菌的共培養(yǎng)(“sn cbal74+FB62”)誘導IL-1O至超過并且在單獨使用與鼠傷寒沙門氏菌(“snfb62+FB62”)時看到的水平之上。有趣的是，即使MoDC預(yù)先用副干酪乳桿菌CBA L74上清液處理僅一小時并且之后清洗以除去上清液，(“l(fā)h sn cbal74+FB62”)，還是觀察到了類似的影響。
[0186]實施例17:鼠傷寒沙門氏菌存在時副干酪乳桿菌CBA L74對單核細胞來源的樹突狀細胞(MoDC)中IL-12p70產(chǎn)生的影響
[0187]我們測試了副干酪乳桿菌CBA L74細胞和副干酪乳桿菌CBA L74細胞上清液兩者在細菌病原體鼠傷寒沙門氏菌存在時誘導人類MoDC中促炎性細胞因子IL-12p70產(chǎn)生的能力。人類MoDC從至少4個供體，并且在某些情況下，7個供體得到。實驗的結(jié)果示于圖31。與實施例16中所獲得的結(jié)果相反，我們發(fā)現(xiàn)，鼠傷寒沙門氏菌(“FB62”)誘導高水平的抗炎細胞因子IL-12p70而對照的乳桿菌菌株副干酪乳桿菌21060 (“B21060”)和副干酪乳桿菌CBA L74 (“CBA L74”)細胞只誘導低水平的IL_12p70。此時再次，鼠傷寒沙門氏菌上清液(“sn fb62”)誘導IL-12p70的產(chǎn)生，而乳桿菌菌株副干酪乳桿菌21060 (“sn b21060”)和副干酪乳桿菌CBA L74 (“sn cbal74”)上清液并沒有。副干酪乳桿菌CBA L74上清液與鼠傷寒沙門氏菌的共培養(yǎng)(“sn cbal74+FB62”)引起了 IL_12p70產(chǎn)生的顯著減少。即使MoDC都預(yù)先用副干酪乳桿菌CBA L74上清液處理僅一小時并且之后清洗以除去上清液(“Ih sncbal74+FB62”)，也觀察到所述影響。這一減少超過了用對照乳酸桿菌副干酪乳桿菌21060(“l(fā)h sn b21060+FB62”)所觀察到的。這些數(shù)據(jù)表明，副干酪乳桿菌CBA L74和副干酪乳桿菌CBA L74的培養(yǎng)上清液兩者都具有能減輕細菌病原體鼠傷寒沙門氏菌誘導的炎癥抗炎的特性。
[0188]實施例18:鼠傷寒沙門氏菌存在時副干酪乳桿菌CBA L74發(fā)酵的奶對單核細胞來源的樹突狀細胞(MoDC)中IL-1O產(chǎn)生的影響[0189]我們測試了細菌病原體鼠傷寒沙門氏菌存在時副干酪乳桿菌CBA L74發(fā)酵的奶誘導人類MoDC中抗炎細胞因子IL-10產(chǎn)生的能力。實驗的結(jié)果示于圖32。雖然未活化的MoDC通常不產(chǎn)生IL-10，但我們發(fā)現(xiàn)用副干酪乳桿菌CBA L74-發(fā)酵的奶孵育的MoDC劑量依賴性誘導 IL-1O 的產(chǎn)生(參見“基質(zhì) CBAL741.41gr/100ml” 和“基質(zhì) CBAL740.14gr/100ml “)。即使在鼠傷寒沙門氏菌存在時該性能也被保留(參見“基質(zhì)CBAL741.41gr/100ml+FB62”和“基質(zhì) CBAL740.14gr/100ml+FB62”)。
[0190]圖32還顯示，副干酪乳桿菌CBA L74已被熱激活(“6.3 X IO6CFU CBA74煮沸的”)、多聚甲醛處理激活(“6.3 X IO6CFU CBA74PFA”)或凍融激活(“6.3 X IO6CFU CBA74F & AMPT‘ )但保留誘導IL-1O的能力。
[0191]當我們觀察了副干酪乳桿菌CBA L74的培養(yǎng)基，副干酪乳桿菌CBA L74發(fā)酵的奶導致鼠傷寒沙門氏菌誘導的IL_12p70產(chǎn)生的顯著的劑量依賴性的減少。(圖33)。鼠傷寒沙門氏菌存在時嗜熱鏈球菌發(fā)酵的奶導致IL-12p70產(chǎn)生的增加。然而，副干酪乳桿菌CBA L74發(fā)酵的奶沒有刺激IL-12p70的產(chǎn)生，與副干酪乳桿菌CBA L74的抗炎特性相符合。這些數(shù)據(jù)表明副干酪乳桿菌CBA L74保留了抗炎特性，即使在更促炎性物質(zhì)存在時。
[0192]實施例19:坂崎腸桿菌存在時副干酪乳桿菌CBA的L74細胞上清液對單核細胞來源的樹突狀細胞(MoDC)中IL-1O和IL12p70的產(chǎn)生的影響
[0193]我們測試了在細菌病原體坂崎腸桿菌存在時副干酪乳桿菌CBA L74細胞上清液誘導人類MoDC中抗炎細胞因子IL-1O和促炎細胞因子IL-12p70產(chǎn)生的能力。我們測試了兩株坂崎腸桿菌，N9和N13。坂崎腸桿菌誘導了人類MoDC中IL-1O和IL_12p70兩者的產(chǎn)生。加入副干酪乳桿菌CBA L74細胞上清液導致IL-1O的增加和IL_12p70的顯著下降。
[0194]實施例20:鼠傷寒沙門氏菌存在時副干酪乳桿菌CBA L74發(fā)酵的稻米對組織外植體模型中的細胞因子產(chǎn)生的影響
[0195]小鼠腸上皮用作建立Abud (實驗細胞研究。303:252-262 (2005))中所述三維共培養(yǎng)體系。組織外植體在100%02的存在下以及一個大氣壓的壓力下培養(yǎng)24小時，較低腔室包含Iml hEC DMEM加上ITS-X和EGF。較高腔室含有200ml培養(yǎng)基加上鼠傷寒沙門菌、副干酪乳桿菌CBA L74發(fā)酵的稻米或鼠傷寒沙門菌和副干酪乳桿菌CBA L74的組合發(fā)酵的稻米。收獲上清并通過ELISA檢測IL-1 β，TNF-α和IL-1O的水平。如圖33所示，鼠傷寒沙門菌存在時加入發(fā)酵的稻米顯著降低了促炎性細胞因子，IL-1 β和TNF-α的產(chǎn)生，與對抗炎細胞因子IL-1O的水平只有溫和影響。
[0196]但是應(yīng)當理解，本發(fā)明并不僅限于本文所公開和附圖中所顯示的特定結(jié)構(gòu)，而是也包括在權(quán)利要求的范圍內(nèi)的任何修改或等同物。
【權(quán)利要求】
1.一種包含發(fā)酵食物產(chǎn)品的組合物，其中所述食物產(chǎn)品已經(jīng)被益生菌細菌，副干酪乳桿菌(Lactobacillus paracasei) CBA L74,國際保藏號 LMG P - 24778,所發(fā)酵。
2.如權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述食物產(chǎn)品是乳制品或谷物產(chǎn)品。
3.如權(quán)利要求2所述的組合物，其中所述乳制品是牛奶、酸奶、凝乳、奶酪或嬰兒配方。
4.如權(quán)利要求2所述的組合物，其中所述谷物產(chǎn)品是稻米、小麥、燕麥、大麥、玉米、黑麥、高粱、小米或黑小麥。
5.如權(quán)利要求1-4中任一項所述的組合物，其中所述食物產(chǎn)品是干燥的。
6.如權(quán)利要求1-5中任一項所述的組合物，其中所述干燥的食物產(chǎn)品被再水合。
7.如權(quán)利要求6所述的組合物，其中所述干燥的、再水合的食物產(chǎn)品是免疫調(diào)節(jié)性的。
8.如權(quán)利要求1-7中任一項所述的組合物，其中所述益生菌細菌不復制。
9.如權(quán)利要求1-8中任一項所述的組合物，其中所述食物產(chǎn)品包含約lX102cfu/g至約I X 1012cfu/g益生菌細菌每克干重。
10.一種包含益生菌細菌，副干酪乳桿菌CBA L74，國際保藏號LMG P - 24778，和生理學上可接受的載體的組合物。
11.如權(quán)利要求10所述的組合物，其中所述生理學上可接受的載體是食物產(chǎn)品。
12.如權(quán)利要求11所述的組合物，其中所述食物產(chǎn)品是乳制品或谷物產(chǎn)品。
13.如權(quán)利要求12所述的組合物，其中所述乳制品是牛奶、酸奶、凝乳、奶酪或嬰兒配方。
14.如權(quán)利要求12所述的組合物，其中所述谷物產(chǎn)品是稻米、小麥、燕麥、大麥、玉米、黑麥、高粱、小米或黑小麥。
15.如權(quán)利要求10-14中任一項所述的組合物，其中所述食物產(chǎn)品是干燥的。
16.如權(quán)利要求10-15中任一項所述的組合物，其中所述干燥的食物產(chǎn)品被再水合。
17.如權(quán)利要求16所述的組合物，其中所述干燥的、再水合的食物產(chǎn)品是免疫調(diào)節(jié)性的。
18.如權(quán)利要求10-17中任一項所述的組合物，其中所述益生菌細菌不復制。
19.如權(quán)利要求10-18中任一項所述的組合物，其中所述食物產(chǎn)品包含約lX102cfu/g至約I X 1012cfu/g益生菌細菌每克干重。
20.如權(quán)利要求10所述的組合物，其中所述生理學上可接受的載體是藥學上可接受的載體。
21.如權(quán)利要求20所述的組合物，其中所述藥學上可接受的載體包括基于脂質(zhì)或基于聚合物的膠體。
22.如權(quán)利要求21所述的組合物，其中所述膠體是脂質(zhì)體、水凝膠、微粒、毫微?；蚯抖喂簿畚锬z束。
23.如權(quán)利要求21所述的組合物，其中所述基于聚合物的膠體是膠囊。
24.如權(quán)利要求20-23中任一項所述的組合物，其中所述益生菌細菌不復制。
25.如權(quán)利要求20-24中任一項所述的組合物，其中所述益生菌細菌是約IX 102cfu/g至約I X 1012cfu/g干重的單位劑型。
26.如權(quán)利要求20-25中任一項所述的組合物，其中所述組合物被配制用于口服施用。
27.一種制造營養(yǎng)組合物的方法，所述方法包括:a)提供食物廣品； b)將所述食物產(chǎn)品與 有效量的益生菌，副干酪乳桿菌CBAL74，國際保藏號為LMGP - 24778，以及任選的共接種物組合以形成混合物； c)將所述混合物在足以發(fā)生發(fā)酵的溫度和時間孵育。
28.如權(quán)利要求27所述的方法，其中所述食物產(chǎn)品是乳制品或谷物產(chǎn)品。
29.如權(quán)利要求27或28所述的方法，其中所述益生菌細菌的量為約IX106cfu/ml至約 5 X 106cfu/ml。
30.如權(quán)利要求27-29中任一項所述的方法，其中所述共接種物是嗜熱鏈球菌。
31.如權(quán)利要求30所述的方法，其中所述共接種物的量為約lX104cfu/ml至約I X 105cfu/ml。
32.如權(quán)利要求27-31中任一項所述的方法，其中所述孵育步驟持續(xù)直到所述混合物中益生菌細菌的水平達到約lX108cfu/ml至約I X 101Qcfu/ml。
33.如權(quán)利要求27-32中任一項所述的方法，其還包括干燥所述營養(yǎng)組合物。
34.如權(quán)利要求33所述的方法，其中所述干燥步驟是噴霧干燥。
35.如權(quán)利要求27-34中任一項所述的方法,其中所述營養(yǎng)組合物與一種或多種另外的食物組合。
36.如權(quán)利要求35所述的方法，其中所述另外的食物產(chǎn)品包含乳制品、谷物產(chǎn)品、基于蔬菜的廣品、基于水果的廣品或基于蛋白的廣品。
37.如權(quán)利要求36所述的方法，其中所述基于水果的產(chǎn)品包括番茄產(chǎn)品。
38.一種調(diào)節(jié)受試者中免疫系統(tǒng)的方法，所述方法包括: a)鑒定需要免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)的受試者； b)施用有效量的包含食物產(chǎn)品的組合物，其中所述食物產(chǎn)品已經(jīng)被益生菌細菌，副干酪乳桿菌CBA L74，國際保藏號LMG P-24778，所發(fā)酵。
39.如權(quán)利要求38所述的方法，其中所述食物產(chǎn)品包括如權(quán)利要求1-19中任一項所述的食物產(chǎn)品。
40.如權(quán)利要求38或39所述的方法，其中所述受試者是人類嬰兒。
41.一種治療有發(fā)展胃腸道病癥的風險的受試者的方法，所述方法包括: a)鑒定有發(fā)展胃腸道病癥的風險的受試者； b)施用有效量的包含食物產(chǎn)品的組合物，其中所述食物產(chǎn)品已經(jīng)由益生菌細菌，副干酪乳桿菌CBA L74，國際保藏號LMG P-24778，所發(fā)酵。
42.如權(quán)利要求41所述的方法，其中所述食物產(chǎn)品包括如權(quán)利要求1-19中任一項所述的食物產(chǎn)品。
43.如權(quán)利要求41所述的方法，其中所述胃腸道病癥是粘膜免疫系統(tǒng)缺陷、食物變態(tài)反應(yīng)、腹瀉相關(guān)疾病、細菌或病毒感染、腸易激綜合征、炎性腸病、克羅恩病、乳糜瀉或壞死性小腸結(jié)腸炎。
44.如權(quán)利要求43所述的方法，其中所述粘膜免疫系統(tǒng)缺陷是不成熟的免疫系統(tǒng)。
45.如權(quán)利要求41-44中任一項所述的方法，其中所述受試者是人類嬰兒。
46.一種治療患有胃腸道病癥的受試者的方法，所述方法包括: a)鑒定患有胃腸道病癥的受試者；b)施用有效量的包含食物產(chǎn)品的組合物，其中所述食物產(chǎn)品已經(jīng)被益生菌細菌，副干酪乳桿菌CBA L74，國際保藏號LMG P-24778，所發(fā)酵。
47.如權(quán)利要求46所述的方法，其中所述食物產(chǎn)品包括如權(quán)利要求1-19中任一項所述的食物產(chǎn)品。
48.如權(quán)利要求46所述的方法，其中所述胃腸道病癥是粘膜免疫系統(tǒng)缺陷、食物變態(tài)反應(yīng)、腹瀉相關(guān)疾病、細菌或病毒感染、腸易激綜合征、炎性腸病、克羅恩病、乳糜瀉或壞死性小腸結(jié)腸炎。
49.如權(quán)利要求48所述的方法，其中所述粘膜免疫系統(tǒng)缺陷是不成熟的免疫系統(tǒng)。
50.如權(quán)利要求46-49中任一項所述的方法，其中所述受試者是人類嬰兒。
51.一種治療患有胃腸道病癥的受試者的方法，所述方法包括: a)鑒定患有胃腸道病癥的受試者； b)施用有效量的藥物組合物，其包含益生菌細菌，副干酪乳桿菌CBAL74，國際保藏號LMGP-24778。
52.如權(quán)利要求51所述的方法，其中所述藥物組合物包括如權(quán)利要求20-26中任一項所述的組合物。
53.如權(quán)利要求51所述的方法，其中所述胃腸道病癥是粘膜免疫系統(tǒng)缺陷、食物變態(tài)反應(yīng)、腹瀉相關(guān)疾病、細菌或病毒感染、腸易激綜合征、炎性腸病、克羅恩病、乳糜瀉或壞死性小腸結(jié)腸炎。
54.如權(quán)利要求53所述的方法，其中所述粘膜免疫系統(tǒng)缺陷是不成熟的免疫系統(tǒng)。
55.如權(quán)利要求51-54中任一項所述的方法，其中所述受試者是人類嬰兒。
56.益生菌細菌，副干酪乳桿菌CBAL74，國際保藏號LMG P-24778，在用于治療胃腸道病癥的食物產(chǎn)品的制備中的用途。
57.如權(quán)利要求56所述的用途，其中所述食物產(chǎn)品包括如權(quán)利要求1-19中任一項所述的食物產(chǎn)品。
58.如權(quán)利要求56或57所述的用途，其中所述胃腸道病癥是粘膜免疫系統(tǒng)缺陷、食物變態(tài)反應(yīng)、腹瀉相關(guān)疾病、細菌或病毒感染、腸易激綜合征、炎性腸病、克羅恩病、乳糜瀉或壞死性小腸結(jié)腸炎。
59.如權(quán)利要求58所述的用途，其中所述粘膜免疫系統(tǒng)缺陷是不成熟的免疫系統(tǒng)。
60.如權(quán)利要求56-59中任一項所述的用途，其中所述受試者是人類嬰兒。
61.益生菌細菌，副干酪乳桿菌CBAL74，國際保藏號LMG P-24778，在用于治療胃腸道病癥的藥物的制備中的用途。
62.如權(quán)利要求61所述的用途，其中所述藥物組合物包括如權(quán)利要求20-26中任一項所述的組合物。
63.如權(quán)利要求61所述的用途，其中所述胃腸道病癥是粘膜免疫系統(tǒng)缺陷、食物變態(tài)反應(yīng)、腹瀉相關(guān)疾病、細菌或病毒感染、腸易激綜合征、炎性腸病、克羅恩病、乳糜瀉或壞死性小腸結(jié)腸炎。
64.如權(quán)利要求63所述的用途，其中所述粘膜免疫系統(tǒng)缺陷是不成熟的免疫系統(tǒng)。
65.如權(quán)利要求61-64中任一項所述的用途,其中所述受試者是人類嬰兒。
66.通過如權(quán)利要求27-37中任一項所述的方法制得的營養(yǎng)組合物。
67.一種試劑盒，其包含測定量的包含發(fā)酵的食物產(chǎn)品的營養(yǎng)組合物和選自由包裝材料、包括使用說明的包裝插頁、無菌流體和無菌容器組成的組的一項或多項，其中所述食物產(chǎn)品已經(jīng)被益生菌細菌，副干酪乳桿菌CBA L74，國際保藏號LMG P-24778，所發(fā)酵。
68.一種試劑盒，其包含測定量的包含益生菌細菌，副干酪乳桿菌CBA L74，國際保藏號LMG P-24778，的藥物組合物和選自由包裝材料、包括使用說明的包裝插頁、無菌流體和無菌容器組成的組的一項或 多項。
【文檔編號】A23C9/123GK103997899SQ201280040658
【公開日】2014年8月20日 申請日期:2012年6月18日 優(yōu)先權(quán)日:2011年6月20日
【發(fā)明者】安德烈亞·布代利, 弗蘭切斯卡·羅曼娜·法桑諾, 米利亞姆·泰爾扎諾, 洛倫佐·布拉馬蒂 申請人:H.J.亨氏公司