采用脂肪酶自β-內(nèi)酯產(chǎn)生L-肉堿的方法
【專利摘要】本發(fā)明的主題是產(chǎn)生L-肉堿的方法，其中使β-內(nèi)酯轉(zhuǎn)變?yōu)長-肉堿，其中方法包括使β-內(nèi)酯酶促轉(zhuǎn)變?yōu)?R)-4-鹵代-3-羥基丁酸或(R)-4-鹵代-3-羥基丁酸酯，所述β-內(nèi)酯是4-(鹵代甲基)氧雜環(huán)丁烷-2-酮。
【專利說明】采用脂肪酶自β_內(nèi)酯產(chǎn)生L-肉堿的方法
【【技術(shù)領(lǐng)域】】
[0001]本發(fā)明涉及產(chǎn)生L-肉堿的方法。
【【背景技術(shù)】】
[0002]肉堿(維生素Bt ；3-羥基-4-三甲基銨基-丁酸鹽)是自氨基酸賴氨酸及甲硫氨酸生物合成的季銨化合物。在活細(xì)胞中，需要其在脂質(zhì)破裂期間將脂肪酸自胞質(zhì)溶膠運(yùn)輸至線粒體，用于產(chǎn)生代謝能量。其被用作營養(yǎng)物補(bǔ)充物。肉堿以2種立體異構(gòu)體存在。有生物學(xué)活性的形式是L-肉堿，而其對映異構(gòu)體，D-肉堿，無生物學(xué)活性。當(dāng)以工業(yè)方法產(chǎn)生L-肉堿時(shí)，期望以高純度產(chǎn)生有生物學(xué)活性的L-型。
[0003]對于L-肉堿的工業(yè)生產(chǎn)描述了各種方法。已知微生物方法，其中直接由細(xì)菌產(chǎn)生L-肉堿。在其他方法中，由有機(jī)合成產(chǎn)生外消旋體，并隨后分離為對映異構(gòu)體。
[0004]而且，已嘗試直接自手性前體合成L-肉堿。一組潛在前體是手性環(huán)狀內(nèi)酯。由于在原理上知道獲得手性內(nèi)酯的方法，L-肉堿在內(nèi)酯環(huán)的水解后是可利用的。 [0005]US5, 473, 104公開了自(S)_3_羥基丁內(nèi)酯制備L-肉堿的方法。該方法是2_步驟方法，其中在第I步驟中將(S)-3-羥基丁內(nèi)酯轉(zhuǎn)變?yōu)閷?yīng)羥基-活化的內(nèi)酯，而維持環(huán)結(jié)構(gòu)。在第2步驟中，打開活化的內(nèi)酯環(huán)，并用三甲基胺導(dǎo)入三甲基銨基團(tuán)?？傊?，反應(yīng)相對復(fù)雜，因?yàn)樾枰每量痰幕瘜W(xué)品活化中間體。
[0006]CH680 588A5公開了自β -內(nèi)酯前體產(chǎn)生L-肉堿的方法，其中在2_步驟過程中將手性2-氧雜環(huán)丁烷酮轉(zhuǎn)變?yōu)長-肉堿。在第I步驟中，使4-(氯甲基)-2-氧雜環(huán)丁烷酮經(jīng)歷水解步驟，其中打開環(huán)，并獲得4-氯-3-羥基丁酸。在隨后步驟中，用三甲基胺將酸轉(zhuǎn)變?yōu)長-肉堿。但是，手性β_內(nèi)酯的產(chǎn)生需要相對復(fù)雜的重金屬催化劑，且產(chǎn)率常常不足。
[0007]Nelson&Spencer (J.0rg.Chem.2000, 65，1227-1230)公開了由酶法拆分用脂肪酶自β_內(nèi)酯外消旋體獲得對映體富集的β_內(nèi)酯的方法。使用的底物是各種烷基-及芳基-β-內(nèi)酯外消旋體。如總結(jié)于表1，產(chǎn)率僅對有限數(shù)量的反應(yīng)是足夠的。對映立體選擇性強(qiáng)烈依賴于β -內(nèi)酯的取代基，且小取代基甲基的對映體產(chǎn)率是非常低的(表1)。反應(yīng)需要有機(jī)溶劑，諸如芐基醇，其由于環(huán)境原因，對于工業(yè)應(yīng)用是不期望的。反應(yīng)時(shí)間相對長(通常是72小時(shí))。
[0008]US2006/0046286公開由酶促酯化自β -內(nèi)酯獲得手性β _ 丁內(nèi)酯及3_羥基羧酸酯的方法。至于Nelson&Spencer,推薦使用脂肪酶。反應(yīng)需要有機(jī)溶劑,諸如甲苯,及約16小時(shí)的相對長的反應(yīng)時(shí)間。底物是β_ 丁內(nèi)酯。在多數(shù)實(shí)驗(yàn)中，底物不是外消旋體，而是有光學(xué)活性的(R)-P-丁內(nèi)酯。特定反應(yīng)通常以增強(qiáng)的對映體純度產(chǎn)生(R)-P-丁內(nèi)酯，然而(S)-3-羥基丁酸酯，如果有，僅以相對低量獲得(實(shí)施例1，6，7)。
[0009]由于對映體純L-肉堿是重要工業(yè)產(chǎn)物，期望提供進(jìn)一步有效的產(chǎn)生方法。特別是，期望提供以相對簡單方式、以高總產(chǎn)率及對映體產(chǎn)率產(chǎn)生L-肉堿的方法。
[0010]【發(fā)明要解決的技術(shù)問題】
[0011]本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供產(chǎn)生L-肉堿的方法，其克服上述的缺點(diǎn)。特別是，技術(shù)問題是提供有效及簡單產(chǎn)生L-肉堿的方法。[0012]總產(chǎn)率以及手性產(chǎn)率應(yīng)高。方法步驟數(shù)應(yīng)相對低，且方法應(yīng)不需要復(fù)雜的設(shè)備?？傊?，方法應(yīng)具有高的原子經(jīng)濟(jì)性，且應(yīng)是成本及人力有效的。使用的化學(xué)品應(yīng)是容易可利用的，且應(yīng)不是太昂貴的。
[0013]本發(fā)明要解決的另一問題是提供溫和的方法，其避免苛刻的條件及苛刻的化學(xué)品。應(yīng)避免影響環(huán)境的化學(xué)品，諸如有機(jī)溶劑或重金屬，或可影響工人健康的那些，諸如芳族溶劑。應(yīng)避免雖然可作為痕量雜質(zhì)存在于產(chǎn)物中，但必需去除的重金屬催化劑。特別是，應(yīng)使用不包含貴金屬，諸如鉬的昂貴的催化劑?？傮w能量輸入應(yīng)低。特別是，反應(yīng)應(yīng)在相對低溫及經(jīng)相對低反應(yīng)時(shí)間實(shí)施。
【
【發(fā)明內(nèi)容】
】
[0014]意外地，由權(quán)利要求的方法解決了本發(fā)明要解決的技術(shù)問題。貫穿說明書公開了進(jìn)一步的本發(fā)明的實(shí)施方式。
[0015]本發(fā)明的主題是產(chǎn)生L-肉堿的方法，其中使(6-內(nèi)酯轉(zhuǎn)變?yōu)長-肉堿，其中方法包括使P -內(nèi)酯酶促轉(zhuǎn)變?yōu)?R) -4-鹵代-3-羥基丁酸或(R) -4-鹵代-3-羥基丁酸酯，所述3 -內(nèi)酯是4-(鹵代甲基)氧雜環(huán)丁烷-2-酮。
[0016]所述肉堿是L-肉堿((R)-肉堿，左卡尼汀XL-肉堿是肉堿的有生理學(xué)活性的立體異構(gòu)體。酶促轉(zhuǎn)變的反應(yīng)產(chǎn)物是(R)-4-鹵代-3-羥基丁酸或其酯，依賴于是在水性介質(zhì)或在醇中實(shí)施酶促轉(zhuǎn)變。此中間產(chǎn)物可在隨后反應(yīng)步驟中轉(zhuǎn)變?yōu)長-肉堿。如對于對應(yīng)L-肉堿，酸或酯的手性碳構(gòu)型是(R)。由此，可通過由三甲基銨基利用親核取代來取代中間體的鹵素原子，而手性保持未受影響來簡單實(shí)施隨后轉(zhuǎn)變?yōu)長-肉堿。
[0017]在本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】中，(6-內(nèi)酯是4_(氯甲基)氧雜環(huán)丁烷-2-酮，4-(溴甲基)氧雜環(huán)丁烷-2-酮或4-(碘甲基)氧雜環(huán)丁烷-2-酮。優(yōu)選使用4-(氯甲基)氧雜環(huán)丁烷-2-酮。
[0018]優(yōu)選地，酶對于P -內(nèi)酯的(R)-異構(gòu)體是立體選擇性的。換言之，優(yōu)選酶唯獨(dú)地，或至少主要地，將(R)-內(nèi)酯轉(zhuǎn)變?yōu)閷?yīng)(R)-酸或酸酯。由此，當(dāng)?shù)孜锸荘 -內(nèi)酯外消旋體，或至少包含(S)-P-內(nèi)酯及(R)-內(nèi)酯時(shí)，酶選擇性地將(R)-P-內(nèi)酯轉(zhuǎn)變?yōu)閷?yīng)(R)-酸或酸酯，然而(S)-P-內(nèi)酯保持未受影響或基本上未受影響。由此，在反應(yīng)混合物中保持及蓄積對應(yīng)(S)-P-內(nèi)酯。由此，在產(chǎn)物中富集(R)-酸或酸酯。而且，會在產(chǎn)物中富集
(S)-P-內(nèi)酯。二種化合物可由于它們在水及有機(jī)溶劑中的不同溶解度而彼此分離。當(dāng)自^ -內(nèi)酯外消旋體起始時(shí)，理想酶促反應(yīng)會產(chǎn)生50%Mol_%(R)-酸或酸酯(100%ee的光學(xué)純度)及50Mol-%的殘留的(S)-P-內(nèi)酯的混合物，隨后會將其從混合物除去。
[0019]在本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方式中，(6-內(nèi)酯是外消旋體。優(yōu)選地，獲得對映體過量的(R)-4-鹵代-3-羥基丁酸或(R)-4-鹵代-3-羥基丁酸酯。對映體過量(關(guān)于(S)-4-鹵代-3-羥基丁酸或酯)優(yōu)選是高于80%，更優(yōu)選高于90%、95%或99%對映體過量(ee)。
[0020]酶促轉(zhuǎn)變在溶劑的存在下實(shí)施。優(yōu)選地，溶劑包含水。水可以1-相系統(tǒng)或2-相系統(tǒng)存在。在水存在下，獲得(R)-4-鹵代-3-羥基丁酸。酶促轉(zhuǎn)變則是酶促水解。酶促水解的結(jié)果，獲得(R)-4-氯-3-羥基丁酸，(R)-4-溴-3-羥基丁酸或(R)-4-碘-3-羥基丁酸。[0021]優(yōu)選地，溶劑僅是水。當(dāng)使用水作為溶劑時(shí)，初始反應(yīng)混合物是溶液或懸浮液。在此實(shí)施方式中，反應(yīng)混合物優(yōu)選是1-相系統(tǒng)，其中未觀察到水相及液體有機(jī)相之間的清楚的相分離。
[0022]在本發(fā)明的另一優(yōu)選的實(shí)施方式中，在2相系統(tǒng)中實(shí)施酶促轉(zhuǎn)變，其中在水相中富集(R)-4-鹵代-3-羥基丁酸。在2-相系統(tǒng)中，在有機(jī)相中富集相對非-極性的β-內(nèi)酯底物，而在水相中富集離子酸產(chǎn)物。由此在結(jié)束反應(yīng)之后，相可被分離，且水相已包含相對純產(chǎn)物。有機(jī)相可包含任何溶劑，其中內(nèi)酯是高度可溶性的，而酸的可溶性差。與此相t匕，水性介質(zhì)中的1-相系統(tǒng)總體需要更少有機(jī)溶劑，由此由于經(jīng)濟(jì)及環(huán)境原因是有利的。
[0023]溶劑的實(shí)例包括烴，諸如脂肪族烴諸如戊烷，己烷，庚烷，辛烷，癸烷及環(huán)己烷，芳族烴諸如甲苯及二甲苯；鹵化的烴諸如二氯甲烷，1，2- 二氯乙烷，氯仿，四氯化碳及鄰-二氯苯；醚諸如二乙基醚，二異丙基醚，叔-丁基甲基醚，二甲氧基乙烷，乙二醇二乙基醚，四氫呋喃，1，4- 二噁烷及1，3- 二氧雜環(huán)戊烷；酰胺諸如甲酰胺；亞砜諸如二甲基亞砜。
[0024]在本發(fā)明的另一實(shí)施方式中，溶劑是醇，優(yōu)選包含I~5個(gè)碳原子的醇，更優(yōu)選甲醇、乙醇或丙醇。當(dāng)在醇中及在水缺失下實(shí)施酶促轉(zhuǎn)變時(shí)，產(chǎn)物是線性酯。隨后，當(dāng)酯轉(zhuǎn)變?yōu)長-肉喊時(shí)，其是被去_酯化的。
[0025]在本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方式中，在酶促轉(zhuǎn)變之后，從溶液除去殘留的內(nèi)酯。優(yōu)選地，通過用溶劑萃取來除去殘留的內(nèi)酯。例如，當(dāng)在一-相系統(tǒng)中實(shí)施溶液時(shí)，殘留的β_內(nèi)酯可用酯，諸如乙酸乙酯，或用己烷萃取。優(yōu)選地，實(shí)施用相對低量的溶劑的多次萃取。
[0026]在優(yōu)選的實(shí)施方式中，酶是水解酶(酶學(xué)委員會編號EC3)。水解酶自底物由水解產(chǎn)生2種產(chǎn)物。優(yōu)選地，水解酶是酯酶(EC3.1)或肽酶(EC3.4)。酯酶是將酯水解為酸及醇的水解酶，諸如脂肪酶。肽酶(蛋白`酶)是進(jìn)行蛋白質(zhì)水解(即，水解肽鍵)的酶。
[0027]在本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方式中，酶是脂肪酶。脂肪酶對于(R)-P-內(nèi)酯是選擇性的。優(yōu)選地，脂肪酶來自真菌、酵母或細(xì)菌。此意為所述生物是脂肪酶的來源。但是，脂肪酶可為人工的、尤其重組體脂肪酶。該脂肪酶是可商購的，例如購自公司N0V0ZymeS、Aman0Enzyme 或 Nagase0
[0028]優(yōu)選地，酶是三酰甘油脂肪酶。該3.1.1.3類酶的脂肪酶催化甘油三酯水解為脂肪酸及甘油。
[0029]來自真菌、酵母或細(xì)菌的脂肪酶常常作為無活性前體體內(nèi)合成。這些前體經(jīng)處理及分泌。該脂肪酶是一般細(xì)胞外脂肪酶。通過切割下N-端肽，諸如信號肽或前肽產(chǎn)生成熟蛋白。根據(jù)本發(fā)明，脂肪酶優(yōu)選是成熟脂肪酶。換言之，其優(yōu)選是有活性的形式。本發(fā)明的方法優(yōu)選是體外方法。
[0030]脂肪酶可包含氨基酸Ser-His-Asp的催化性三聯(lián)體。例如，該脂肪酶見于酵母，諸如假絲酵母屬(Candida)。
[0031]在本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方式中，脂肪酶來自假絲酵母屬(Candida)，假單胞菌屬(Pseudomonas),曲霉屬(Aspergillus),芽孢桿菌屬(Bacillus)或嗜熱絲孢菌屬(Thermomyces)。脂肪酶可為該脂肪酶的衍生物,優(yōu)選具有至少75%、優(yōu)選至少90%的序列同一性的衍生物。
[0032]優(yōu)選地,脂肪酶來自假絲酵母屬(Candida),假單胞菌屬(Pseudomonas)或曲霉屬(Aspergillus)。更優(yōu)選地,脂肪酶來自洋蔥假單胞菌(Pseudomonas cepacia)(洋蔥伯克霍爾德氏菌(Burkholderia cepacia))、突光假單胞菌(Pseudomonas fIuorescens)或南極假絲酵母(Candida antarctica)。脂肪酶可為該脂肪酶的衍生物,優(yōu)選具有至少75%、優(yōu)選至少90%的序列同一性的衍生物。
[0033]衍生物可由氨基酸取代、缺失、插入或修飾獲得。優(yōu)選地，衍生物由重組DNA修飾方法獲得。該重組脂肪酶可相比它們的天然前體具有更高穩(wěn)定性及效率。
[0034]尤其優(yōu)選的是來自洋蔥假單胞菌的脂肪酶和/或來自南極假絲酵母的脂肪酶B。發(fā)現(xiàn)這些酶以高的總產(chǎn)率及對映體產(chǎn)率提供期望的產(chǎn)物。
[0035]在高度優(yōu)選的實(shí)施方式中，酶是SEQ ID NO:1的自洋蔥假單胞菌的脂肪酶(UniProt 標(biāo)識號 P22088[45-364];Joergensen et al.,J.Bacteriol.1991; 173，p559-567)。成熟蛋白是具有320個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)。其源于包含信號肽及前肽的364個(gè)氨基酸的前體。
[0036]在另一優(yōu)選的實(shí)施方式中，酶是具有不同于SEQ ID NO:1的氨基酸序列的來自洋蔥假單胞菌的脂肪酶。洋蔥假單胞菌(P.cepacia)包含幾種脂肪酶，其具有與SEQ IDN0:1具有高同源性的氨基酸序列。例如，酶可為洋蔥假單胞菌堿性脂肪酶(NCBI Acc.No:ABX71757.1;Dalai et al.，J.Biotechnol.Appl.Biochem.2008; 51，p23_31 )。此喊性脂肪酶與SEQ ID NO:1的脂肪酶具有約98%序列同一性。酶也可為洋蔥假單胞菌脂肪酶(Genbank:ABN09945.1;Yanget al., J.Mol.Catal., B Enzym.2007;45，p91_96)。此脂肪酶與SEQ ID NO:1的脂肪酶具有約92%序列同一性。
[0037]SEQ ID NO: 2的自南極假絲酵母的脂肪酶B (UniProt標(biāo)識符P41365 [26-342])是具有317個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)。成熟蛋白源于包含信號肽及前肽的342個(gè)氨基酸的前體。
[0038]優(yōu)選地，衍生物是SEQ ID NO:1的自洋蔥假單胞菌的脂肪酶和/或SEQ ID NO: 2的自南極假絲酵母的脂肪酶B的衍生物，優(yōu)選與SEQ ID N0:1和/或SEQ ID NO: 2具有至少75%、優(yōu)選至少90%的序列同一性的衍生物。如本文所用，序列同一性優(yōu)選由BLAST根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)參數(shù)測定。可由氨基酸取代、缺失、插入或修飾獲得的該脂肪酶的衍生物，及獲得該衍生物的方法，為本領(lǐng)域所知。例如，具有增加的催化性活性的來自洋蔥假單胞菌的脂肪酶B的衍生物及它們的產(chǎn)生方法公開于Puech-Guenot et al., J.Biomol.Screen.2008; 13 (I)，p72_79。具有增加的催化性活性的來自南極假絲酵母的脂肪酶B的衍生物及它們的產(chǎn)生方法公開于Qian et al., J.Mol.Biol.2009; 393; pl91-201 ?
[0039]在本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方式中，在(TC和50°C之間、優(yōu)選20V和40V之間、特別約25°C或約30°C之間的溫度實(shí)施酶促轉(zhuǎn)變。考慮到使用的具體酶來調(diào)整溫度。
[0040]在本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方式中，在包含0.1~50重量％β_內(nèi)酯，更優(yōu)選0.1和10重量％之間或0.5和3重量％之間的β -內(nèi)酯的水溶液中實(shí)施酶促轉(zhuǎn)變。
[0041]在適當(dāng)?shù)木彌_劑中實(shí)施反應(yīng)。使緩沖劑適應(yīng)于使用的具體酶。通常，pH會是大致中性，例如5和9之間，或7和8之間。如果必需，可在反應(yīng)期間通過添加堿或酸來使pH保持穩(wěn)定。
[0042]在優(yōu)選的實(shí)施方式中，反應(yīng)混合物由緩沖劑，酶及內(nèi)酯組成?？商砑犹砑觿?，例如增強(qiáng)酶的穩(wěn)定性或更新的那些，諸如鹽，金屬離子或輔因子?？傊磻?yīng)需要僅少量的化學(xué)品，且可以相對簡單方式在溫和的溫度實(shí)施。[0043]當(dāng)獲得期望的量的酸或酸酯時(shí)，終止反應(yīng)。反應(yīng)可通過去除酶，例如通過過濾終止。當(dāng)使用β -內(nèi)酯外消旋體作為底物及高度選擇性的酶時(shí)，達(dá)50%的β -內(nèi)酯可轉(zhuǎn)變?yōu)閷?yīng)(R)-酸或(R)-酸酯。在去除及分離之后，殘留的(S)-13-內(nèi)酯可用于其他反應(yīng)。[0044]反應(yīng)時(shí)間可在I~50小時(shí)之間，優(yōu)選2~20小時(shí)之間。發(fā)現(xiàn)用一些酶可在10小時(shí)之內(nèi)、特別在8小時(shí)之內(nèi)達(dá)到有效更新。
[0045]用于實(shí)施發(fā)明的開環(huán)反應(yīng)的單-鹵化的內(nèi)酯為本領(lǐng)域所知?？紤]到酶的立體選擇性，β_內(nèi)酯外消旋體可用于本發(fā)明的方法。單-鹵化的β_內(nèi)酯是可例如由對應(yīng)環(huán)氧化物的低壓羰基化獲得的，如公開于US2007/0213524A1，或起始于不飽和的酸使用Lewis 酸及次氯酸鹽，如描述于 Lopez-Lopez, Jose ；Tetrahedron Letters2007,48 (10)，1749-1752。
[0046]在本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方式中，在催化劑存在下由[2+2]環(huán)加成反應(yīng)獲得手性4_(鹵代甲基)氧雜環(huán)丁烷-2-酮。在本發(fā)明的特定實(shí)施方式中，使用手性內(nèi)酯。此可增加在本發(fā)明的反應(yīng)中的對映體產(chǎn)率。手性β_內(nèi)酯可在手性催化劑的存在下由乙烯酮與醒X-CH2-CHO的[2+2]環(huán)加成獲得,其中X選自Cl、Br及I。乙烯酮(ketene或ethenone,式C2H2O)是無色氣體，其由于分子中的2個(gè)相鄰雙鍵而是高度反應(yīng)性的。
[0047]在本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方式中，使酶促轉(zhuǎn)變中獲得的4-鹵代-3-羥基丁酸或(R)-4-鹵代-3-羥基丁酸酯隨后用三甲基胺(TMA)轉(zhuǎn)變?yōu)長-肉堿。優(yōu)選地，鹵素原子在親核取代反應(yīng)中被三甲基胺基取代。可使TMA與β-內(nèi)酯在堿存在下接觸。堿可在使β-內(nèi)酯與TMA接觸之后添加。
[0048]在本發(fā)明的方法的優(yōu)選的實(shí)施方式中，β -內(nèi)酯在2-步驟方法中轉(zhuǎn)變?yōu)長-肉堿。在第I步驟中，使4-(氯甲基)-2-氧雜環(huán)丁烷酮經(jīng)歷酶促水解，其中β -內(nèi)酯環(huán)被打開，并獲得4-氯-3-羥基丁酸。在隨后步驟中，用三甲基胺將所述酸、酯轉(zhuǎn)變?yōu)長-肉堿。
[0049]本發(fā)明的合成L-肉堿的例示方法顯示于以下方案I。方法包括乙烯酮及式Cl-CH2-CHO的醛的[2+2]環(huán)加成。使得到的β -內(nèi)酯外消旋體I經(jīng)歷酶促環(huán)切割反應(yīng)而產(chǎn)生對應(yīng)(R)-酸2a (在水作為溶劑中)或(R)-酯2b (在醇中)。然后用TMA使酸2a或酯2b轉(zhuǎn)變?yōu)長-肉堿。
[0050]
【權(quán)利要求】
1.產(chǎn)生L-肉堿的方法，其中使P-內(nèi)酯轉(zhuǎn)變?yōu)長-肉堿，所述方法包括使P -內(nèi)酯酶促轉(zhuǎn)變?yōu)?R)-4-鹵代-3-羥基丁酸或(R)-4-鹵代-3-羥基丁酸酯，所述(6-內(nèi)酯是4-(鹵代甲基)氧雜環(huán)丁烷-2-酮。
2.前述權(quán)利要求之至少一項(xiàng)的方法，其中(6-內(nèi)酯是外消旋體。
3.權(quán)利要求2的方法，其中獲得對映體過量的(R)-4-鹵代-3-羥基丁酸或(R)-4-鹵代-3-羥基丁酸酯。
4.前述權(quán)利要求之至少一項(xiàng)的方法，其中在水性介質(zhì)中實(shí)施酶促轉(zhuǎn)變，并獲得(R) -4-鹵代-3-羥基丁酸。
5.前述權(quán)利要求之至少一項(xiàng)的方法，其中在兩相溶液中實(shí)施酶促轉(zhuǎn)變，其中在水相中富集(R)-4-鹵代-3-羥基丁酸。
6.前述權(quán)利要求之至少一項(xiàng)的方法，其中，在酶促轉(zhuǎn)變之后，從溶液除去殘留的(6-內(nèi)酯。
7.權(quán)利要求6的方法，其中通過用溶劑萃取來除去殘留的(6-內(nèi)酯。
8.前述權(quán)利要求之至少一項(xiàng)的方法，其中所述酶是脂肪酶。
9.前述權(quán)利要求之至少一項(xiàng)的方法，其中所述脂肪酶來自假絲酵母屬(Candida)、假單胞菌屬(Pseudom onas)、曲霉屬(Aspergillus)、芽孢桿菌屬(Bacillus)或嗜熱絲孢菌屬(Thermomyces),或具有至少75%、優(yōu)選至少90%的序列同一丨I"生的該脂肪酶的衍生物。
10.前述權(quán)利要求之至少一項(xiàng)的方法,其中脂肪酶來自洋蔥假單胞菌(Pseudomonascepacia)、突光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)、南極假絲酵母(Candidaantarctica)，脂肪酶優(yōu)選具有SEQ ID N0:1或SEQ ID NO: 2的氨基酸序列，或具有至少75%、優(yōu)選至少90%的序列同一性的該脂肪酶的衍生物。
11.前述權(quán)利要求之至少一項(xiàng)的方法，其中在(TC和50°C之間，優(yōu)選在20°C和400C之間的溫度實(shí)施酶促轉(zhuǎn)變，和/或其中在包含0.1~10重量-內(nèi)酯的水溶液中實(shí)施酶促轉(zhuǎn)變。
12.前述權(quán)利要求之至少一項(xiàng)的方法，其中在乙烯酮和式X-CH2-CHO的醛的[2+2]環(huán)加成中的在前步驟中合成(6-內(nèi)酯，其中X選自Cl、Br及I。
13.前述權(quán)利要求之至少一項(xiàng)的方法，其中用三甲基胺使酶促轉(zhuǎn)變中獲得的4-鹵代-3-羥基丁酸或(R) -4-鹵代-3-羥基丁酸酯轉(zhuǎn)變?yōu)長-肉堿。
14.前述權(quán)利要求之至少一項(xiàng)的方法，其中酶促轉(zhuǎn)變中(R)_4-鹵代-3-羥基丁酸或(R) -4-鹵代-3-羥基丁酸酯的總產(chǎn)率在基于P -內(nèi)酯總初始量的40%及50%之間，和/或其中(R)-4-鹵代-3-羥基丁酸或(R)-4-鹵代-3-羥基丁酸酯的對映體純度是至少90%。
15.產(chǎn)生(R)-4-鹵代-3-羥基丁酸或(R)-4-鹵代-3-羥基丁酸酯的方法，其中方法包括(6-內(nèi)酯酶促轉(zhuǎn)變?yōu)?R)-4-鹵代-3-羥基丁酸或(R)-4-鹵代-3-羥基丁酸酯，所述.3 -內(nèi)酯是4-(鹵代甲基)氧雜環(huán)丁烷-2-酮。
【文檔編號】C12P7/62GK103703138SQ201280036473
【公開日】2014年4月2日 申請日期:2012年7月25日 優(yōu)先權(quán)日:2011年7月27日
【發(fā)明者】M·阿維, E·克萊格拉夫 申請人:龍沙有限公司