Axmi115變體滅蟲基因及其使用方法
【專利摘要】提供了賦予細(xì)菌、植物、植物細(xì)胞、組織和種子殺蟲活性的組合物和方法。毒素編碼序列可以用于DNA構(gòu)建體或表達(dá)盒中以在植物和細(xì)菌中表達(dá)。組合物還包括轉(zhuǎn)化的細(xì)菌、植物、植物細(xì)胞、組織和種子。具體地，提供了多聚核苷酸序列以及由此所編碼的毒素蛋白。還提供了與那些氨基酸序列特異性結(jié)合的抗體。具體地，本發(fā)明包括編碼融合蛋白的核苷酸序列及其生物學(xué)活性變體和片段，其中所述融合蛋白含有SEQ?ID?NO:43的C末端部分。融合蛋白還可以含有SEQ?ID?NO:45的N末端部分。本發(fā)明還包括SEQ?ID?NO:47和1-14的核苷酸序列，或編碼SEQ?ID?NO:48和15-31中所示氨基酸序列的核苷酸序列，包括其生物學(xué)活性變體和片段。
【專利說明】AXM1115變體滅蟲基因及其使用方法
[0001]相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用
[0002]本申請(qǐng)要求2011年4月5日提交的美國(guó)第61/471848號(hào)臨時(shí)申請(qǐng)的優(yōu)先權(quán)，其內(nèi)容作為整體通過引用并入本文。
[0003]電子提交的序列表的引用
[0004]序列表的官方文本以ASCII格式通過EFS-Web電子提交，其文件名稱為“2916693-093977-SEQLIST.txt”，創(chuàng)建于2012年4月2日，大小為241千比特，并且與說明書同時(shí)提交。該ASCII格式的文件含有的序列表是說明書的一部分，并且作為整體通過引用并入本文。
發(fā)明領(lǐng)域
[0005]本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域。提供了編碼殺蟲(pesticidal)蛋白的新基因。這些蛋白和編碼它們的核酸序列可以用于制備殺蟲制劑以及生產(chǎn)抗害蟲轉(zhuǎn)基因植物。
[0006]發(fā)明背景
[0007]蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensi)是革蘭氏陽(yáng)性產(chǎn)孢子土壤細(xì)菌,其特征在于能夠產(chǎn)生針對(duì)某些昆蟲目和種具有特異性毒性，但是對(duì)植物和其它非靶標(biāo)有機(jī)體卻無害的晶狀包涵體。由此，包含蘇云金芽孢桿菌菌株或其滅蟲(insecticidal)蛋白的組合物可用作環(huán)境可接受的滅 蟲劑，以控制農(nóng)業(yè)害蟲或引起多種人或動(dòng)物疾病的昆蟲媒介。
[0008]來自于蘇云金芽孢桿菌的晶體(Cry)蛋白(δ-內(nèi)毒素)具有主要針對(duì)鱗翅目(Lepidopteran)、半翅目(Hemipteran)、雙翅目(Dipteran)和鞘翅目(Coleopteran)幼蟲的強(qiáng)效滅蟲活性。這些蛋白還顯示出針對(duì)膜翅目(Hymenoptera)、同翅目(Homoptera)、風(fēng)毛目(Phthiraptera)、食毛目(Mallophaga)和蝶螨目(Acari)害蟲以及其它無脊椎動(dòng)物(例如線形動(dòng)物門(Nemathelminthes)>扁形動(dòng)物門(Platyhelminthes)和Sarcomastigorphora 的活性(Feitelson(1993)The Bacillus Thuringiensis familytree.1n Advanced Engineered Pesticides, Marcel Dekker, Inc., New York，N.Y.)0 該晶體蛋白直到被攝取并且溶解于昆蟲中腸內(nèi)才表現(xiàn)出滅蟲活性。攝取的原毒素在昆蟲消化道中被蛋白酶水解成具有活性的毒素分子(H0fte and Whiteley (1989)Microbiol.Rev.53:242-255)。該毒素在靶標(biāo)幼蟲的中腸內(nèi)結(jié)合到頂端刷狀緣受體上，并插入到頂膜中，產(chǎn)生離子通道或孔道，從而導(dǎo)致幼蟲死亡。
[0009]除了內(nèi)毒素之外，蘇云金芽孢桿菌在其營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期還產(chǎn)生分泌的滅蟲蛋白，即營(yíng)養(yǎng)期殺蟲蛋白(Vip)。自從發(fā)現(xiàn)第一種Vip毒素以來，在蘇云金芽孢桿菌中已經(jīng)鑒定出了兩個(gè)主要類型的Vip毒素。一類Vip毒素由毒素雙體組成，所述毒素雙體由兩種組分Vipl和 Vip2 構(gòu)成(Warren (1997) In N.B.Carozzi and M.G.Koziel (ed.), Advances in insectcontrol: the role of transgenic plants.Taylor&Francis, London, United Kingdom)。Vipl和Vip2的組合對(duì)農(nóng)業(yè)上重要的昆蟲西部玉米根蟲(Diabrotica virgifera)具有高度的滅蟲活性，但是對(duì)任何鱗翅目昆蟲卻未表現(xiàn)出任何殺蟲活性(Han et al.(1999) Nat.Struct.Biol.6:932-936)。另一類由Vip3毒素組成，其與Vipl或Vip2沒有序列相似性。首個(gè)被鑒定的Vip3毒素Vip3Aal對(duì)玉米和棉花的幾種主要鱗翅目害蟲，包括秋天行軍蟲草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)和棉鈴蟲谷實(shí)夜蛾(Helicoverpa zea),具有高度的滅蟲活性，但對(duì)玉米的一種主要害蟲歐洲玉米螟(Ostrinia nubilalis)卻未顯示出活性(Estruchet al.(1996)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA93:5389-5394)。從蘇云金芽抱桿菌菌株中刪除vip3Aal基因?qū)е略撎K云金芽孢桿菌菌株的滅蟲活性顯著降低，表明Vip3貢獻(xiàn)了蘇云金芽抱桿菌菌株總體毒性(Donovan et al.(2001) J.1nvertebr.Pathol.78:45-51 )。還觀察到Vip3Aal 通過形成細(xì)胞膜孔(Lee et al.(2003) Appl.Environ.Microbiol.69:4648-4657)使昆蟲中腸細(xì)胞裂解(Yu et al.(1997)Appl.Environ.Microbiol.63:532-536)而殺死昆蟲。
[0010]基于蘇云金芽孢桿菌的滅蟲劑的集中使用已經(jīng)使小菜蛾(Plutella xylostella)的田間種群的抗性增強(qiáng)(Ferr6and Van Rie (2002) Annu.Rev.Entomol.47:501-533)。最常見的抗性機(jī)制是毒素與其特異性中腸受體的結(jié)合減少。這可能也會(huì)賦予對(duì)共用相同受體的其它毒素的交叉抗性(Ferr6and Van Rie (2002) )0
[0011]發(fā)明概述
[0012]提供了賦予細(xì)菌、植物、植物細(xì)胞、組織和種子殺蟲活性的組合物和方法。組合物包含編碼殺蟲和滅蟲多肽序列的核酸分子、含有該些核酸分子的載體，以及含有該些載體的宿主細(xì)胞。組合物還包含殺蟲多肽序列和該些多肽的抗體。核苷酸序列可用于DNA構(gòu)建體和表達(dá)盒中，以進(jìn)行轉(zhuǎn)化和在有機(jī)體(包括微生物和植物)中表達(dá)。核苷酸或氨基酸序列可以是已經(jīng)設(shè)計(jì)用于在有機(jī)體(包括但不限于微生物或植物)中表達(dá)的合成序列。組合物還包含含有本發(fā)明核苷酸序列的細(xì)菌、植物、植物細(xì)胞、組織和種子。 [0013]具體地，提供了編碼殺蟲蛋白的分離的核酸分子。此外，還包括對(duì)應(yīng)于殺蟲蛋白的氨基酸序列。具體地，本發(fā)明提供了包含編碼融合蛋白的核苷酸序列的分離或重組的核酸分子及其生物學(xué)活性變體和片段，其中所述融合蛋白包含SEQ ID N0:43的C末端部分。在多個(gè)實(shí)施方案式中，融合蛋白包含SEQ ID N0:45的N末端部分。在特定的實(shí)施方案中，本發(fā)明所包括的核酸分子(包括含有核酸分子的載體、宿主細(xì)胞、植物和種子)包括SEQ IDN0:47和1-14中所示的核苷酸序列，或編碼SEQ ID N0:48和15-31中所示氨基酸序列的核苷酸序列，包括其生物學(xué)活性變體和片段。還包括與本發(fā)明核苷酸序列互補(bǔ)的，或與本發(fā)明序列或其互補(bǔ)序列相雜交的核苷酸序列。本文中還包括由本發(fā)明核酸分子編碼的分離或重組的融合蛋白。
[0014]提供了產(chǎn)生本發(fā)明的多肽的方法，以及利用那些多肽控制或殺死鱗翅目、半翅目、鞘翅目、線蟲類(nematode)或雙翅目害蟲的方法。還包括用于檢測(cè)樣品中本發(fā)明核酸和多肽的方法和試劑盒。
[0015]本發(fā)明的組合物和方法有利于生產(chǎn)具有增強(qiáng)的抗蟲性或耐蟲性的有機(jī)體。這些有機(jī)體以及包含有機(jī)體的組合物期望用于農(nóng)業(yè)。本發(fā)明的組合物還有利于生產(chǎn)具有殺蟲活性的經(jīng)改變或改良的蛋白，或者用于檢測(cè)產(chǎn)品或有機(jī)體中殺蟲蛋白或核酸的存在。
[0016]附圖簡(jiǎn)述
[0017]圖1顯示融合構(gòu)建體的圖示
[0018]圖2顯示體外葉盤(leaf disk)生物測(cè)定的結(jié)果。pAG6585含有optAxmill5v01 (N= 14)，pAG6141 含有 optAxmill5v02.01.01 (N=8)。[0019]詳細(xì)描述 [0020]本發(fā)明涉及用于調(diào)控有機(jī)體特別是植物或植物細(xì)胞中害蟲抗性或耐受性的組合物和方法。“抗性”意指害蟲(例如昆蟲)在攝取或與本發(fā)明多肽進(jìn)行其它接觸之后被殺死。“耐受性”意指害蟲的移動(dòng)、采食、生殖或其它功能受損或減少。所述方法涉及用編碼本發(fā)明殺蟲蛋白的核苷酸序列轉(zhuǎn)化有機(jī)體。具體地，本發(fā)明的核苷酸序列有利于制備具有殺蟲活性的植物和微生物。因此，提供了轉(zhuǎn)化的細(xì)菌、植物、植物細(xì)胞、植物組織和種子。組合物是芽孢桿菌或其它物種的殺蟲核酸和蛋白。該序列可以用于構(gòu)建隨后轉(zhuǎn)化到目標(biāo)有機(jī)體中的表達(dá)載體、用作分離其它同源(或部分同源)基因的探針，以及用于通過本領(lǐng)域已知方法產(chǎn)生改變的殺蟲蛋白，例如與Vipl、Vip2或Vip3毒素家族的成員發(fā)生結(jié)構(gòu)域交換或DNA改組。該蛋白可以用于控制或殺死鱗翅目、半翅目、鞘翅目、雙翅目和線蟲類害蟲群體以及生產(chǎn)具有殺蟲活性的組合物。
[0021]“殺蟲毒素”或“殺蟲蛋白”意指針對(duì)一種或多種害蟲(包括但不限于鱗翅目、雙翅目和鞘翅目或線蟲動(dòng)物門的成員)具有毒性活性的毒素，或與這種蛋白具有同源性的蛋白。已經(jīng)從如下有機(jī)體中分離出了殺蟲蛋白，包括例如芽孢桿菌屬，雙酶梭菌(Clostridiumbifermentans)和日本甲蟲類芽抱桿菌(Paenibacillus popilliae)。殺蟲蛋白包括由本文所公開的全長(zhǎng)核苷酸序列推論得到的氨基酸序列，以及短于全長(zhǎng)序列的氨基酸序列(其由于使用了位于下游的任意起始位點(diǎn)或者是由于產(chǎn)生具有殺蟲活性的較短蛋白的加工過程所造成)。加工過程可發(fā)生在表達(dá)蛋白的有機(jī)體中，或攝食蛋白后的害蟲中。
[0022]因此，本文提供了賦予殺蟲活性的新的分離或重組核苷酸序列。這些核苷酸序列編碼與已知毒素具有同源性的多肽。還提供了殺蟲蛋白的氨基酸序列。此基因翻譯得到的蛋白使得細(xì)胞能夠控制或殺死攝食該蛋白的害蟲。
[0023]分離的核酸分子及其變體和片段
[0024]本發(fā)明的一個(gè)方面涉及包含編碼殺蟲蛋白和多肽或其生物活性部分的核苷酸序列的分離或重組的核酸分子，以及足以用作雜交探針的核酸分子，其以識(shí)別編碼具有序列同源性區(qū)域的蛋白的核酸分子。本文還包括能夠在本文中別處所定義的嚴(yán)格條件下與本發(fā)明的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。如本文所使用，術(shù)語“核酸分子”意在包括DNA分子(例如，重組DNA、cDNA或基因組DNA)和RNA分子(例如mRNA)以及使用核苷酸類似物所產(chǎn)生的DNA或RNA類似物。核酸分子可以是單鏈或雙鏈，但優(yōu)選是雙鏈DNA。
[0025]本文所使用的“分離的”或“重組的”核酸序列(或DNA)是指不再處于其天然環(huán)境中，例如處于體外或者處于重組細(xì)菌或植物宿主細(xì)胞中的核酸序列(或DNA)。在一些實(shí)施方案中，分離或重組的核酸(優(yōu)選蛋白編碼序列)不含在該核酸所來源的有機(jī)體基因組DNA中天然位于該核酸側(cè)翼的序列(即位于核酸5’和3’末端的序列)。出于本發(fā)明的目的，當(dāng)使用“分離的”描述核酸分子時(shí)不包括分離的染色體。例如，在多個(gè)實(shí)施方案中，編碼S-內(nèi)毒素的分離的核酸分子可以含有少于約5kb、4kb、3kb、2kb、lkb、0.5kb或0.1kb的核苷酸序列，其在該核酸所來源的細(xì)胞基因組DNA中天然位于該核酸分子側(cè)翼。在多個(gè)實(shí)施方案中，基本上不含細(xì)胞物質(zhì)的δ -內(nèi)毒素蛋白包括具有少于約30%、20%、10%或5%(干重量)非S-內(nèi)毒素蛋白(在本文中也被稱為“污染蛋白”)的蛋白制劑。
[0026]編碼本發(fā)明蛋白的核苷酸序列包括如SEQ ID NO:47和1_14所示的序列及其變體、片段和互補(bǔ)序列?！盎パa(bǔ)序列”意指與給定核苷酸序列充分互補(bǔ)以使其能與給定的核苷酸序列雜交從而形成穩(wěn)定雙鏈的核苷酸序列。由這些核苷酸序列所編碼的殺蟲蛋白的相應(yīng)氛基酸序列如SEQ ID NO:48和15-31所不。
[0027]本發(fā)明還包括編碼殺蟲蛋白的這些核苷酸序列的片段的核酸分子?！捌巍币庵妇幋a殺蟲蛋白的核苷酸序列的一部分。核苷酸序列的片段可以編碼殺蟲蛋白的生物學(xué)活性部分，或者其可以是使用下面所公開的方法能夠用作雜交探針或PCR引物的片段。根據(jù)預(yù)期的用途，編碼殺蟲蛋白的核苷酸序列的片段的核酸分子包含至少約50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1350、1400 個(gè)連續(xù)的核苷酸，或直至編碼本文中所公開的殺蟲蛋白的全長(zhǎng)核苷酸序列中存在的核苷酸數(shù)量。“連續(xù)的”核苷酸意指相互之間緊密相鄰的核苷酸殘基。本發(fā)明核苷酸序列的片段會(huì)編碼保留殺蟲蛋白生物學(xué)活性并且因此保留殺蟲活性的蛋白片段。因此，還包括本文中所公開的多肽的生物學(xué)活性片段?！氨Ａ艋钚浴币庵钙螘?huì)具有殺蟲蛋白的至少約30%、至少約50%、至少約70%、80%、90%、95%或更高的殺蟲活性。在多個(gè)實(shí)施方案中，活性相對(duì)于本文中別處所定義的參考?xì)⑾x蛋白可以被改進(jìn)或擴(kuò)大(例如相對(duì)于SEQ ID NO:43或45的活性被改進(jìn)或擴(kuò)大)。在一個(gè)實(shí)施方案中，殺蟲活性是殺滅鞘翅目的活性。在另一個(gè)實(shí)施方案中，殺蟲活性是殺滅鱗翅目的活性。在另一個(gè)實(shí)施方案式中，殺蟲活性是殺滅線蟲類的活性。在另一個(gè)實(shí)施方案中，殺蟲活性是殺滅雙翅目的活性。在另一個(gè)實(shí)施方案中，殺蟲活性是殺滅半翅目的活性。測(cè)量殺蟲活性的方法是本領(lǐng)域所熟知的。參見例如Czapla和Lang(1990) J.Econ.Entomol.83:2480-2485; Andrews 等，(1988) Biochem.J.252:199-206;Marrone 等，(1985)J.0f Economic Entomology78:290-293 ；以及 N0.5，743，477，所有這些文獻(xiàn)作為整體通過引用并入本文。 [0028]編碼殺蟲蛋白的核苷酸序列的片段(所述殺蟲蛋白編碼本發(fā)明蛋白的生物學(xué)活性部分)會(huì)編碼至少約 15、25、30、50、75、100、125、150、175、200、250、300、350、400、450個(gè)連續(xù)的氨基酸，或直至本發(fā)明全長(zhǎng)殺蟲蛋白中存在的氨基酸總數(shù)量。在一些實(shí)施方案中，該片段是蛋白酶水解切割(proteolytic cleavage)片段。例如，蛋酶質(zhì)水解切割片段可以具有相對(duì)于SEQ ID N0:48和15-31至少約100個(gè)氨基酸、約120個(gè)、約130個(gè)、約140個(gè)、約150個(gè)或約160個(gè)氨基酸的N末端或C末端截短。在一些實(shí)施方案中，本文中所包括的片段源于C末端結(jié)晶結(jié)構(gòu)域的去除，例如，通過蛋白酶水解或通過在編碼序列中插入終止密碼子。在其它實(shí)施方案中，融合蛋白包含SEQ ID N0:43的C末端結(jié)構(gòu)域片段和/或SEQ ID NO:45的N末端結(jié)構(gòu)域片段。
[0029]本發(fā)明優(yōu)選的殺蟲蛋白由與SEQ ID NO:47和1_14的核苷酸序列充分一致的核苷酸序列所編碼，或者殺蟲蛋白與SEQ ID N0:48和15-31所示的氨基酸序列充分一致。在另一個(gè)實(shí)施方案中，核苷酸序列編碼融合蛋白，其中N末端部分與SEQ ID NO: 45的N末端部分充分一致，或者其中N末端部分與SEQ ID NO: 45的N末端部分充分一致并且C末端部分與SEQ ID N0:43充分一致?！俺浞忠恢隆币庵咐脴?biāo)準(zhǔn)參數(shù)通過本文中描述的一種比對(duì)程序而與參考序列相比具有至少約60%或65%序列一致性、約70%或75%序列一致性、約80%或 85% 序列一致性、約 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更高序列一致性的氨基酸或核苷酸序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)認(rèn)識(shí)到，通過考慮密碼子簡(jiǎn)并性、氨基酸相似性、讀碼框定位等，可以對(duì)這些數(shù)值適當(dāng)?shù)剡M(jìn)行調(diào)整，以確定由兩條核苷酸序列所編碼蛋白的相應(yīng)的一致性。[0030]為了確定兩條氨基酸序列或兩條核酸的一致性百分比，出于最佳對(duì)比的目的對(duì)序列進(jìn)行比對(duì)。兩條序列之間的一致性百分比是序列所共有的一致位點(diǎn)的數(shù)量的函數(shù)(即，一致性百分比=相同位點(diǎn)的數(shù)量/位點(diǎn)總數(shù)量(例如重疊位點(diǎn))x 100)。在一個(gè)實(shí)施方案中，兩條序列具有相同的長(zhǎng)度。在另一個(gè)實(shí)施方案中，貫穿整條參考序列(即本文所公開的如SEQID NO: 1-31、47或48任意一條所示的序列)來計(jì)算一致性百分比?？梢允褂门c下面描述的那些類似的技術(shù)，在允許或不允許空缺的情況下確定兩條序列之間的一致性百分比。在一致性百分比的計(jì)算中，通常對(duì)精確匹配進(jìn)行計(jì)數(shù)?？杖?，即在比對(duì)中在一條序列中存在但在另一條中并不存在的殘基所處的位點(diǎn)，被認(rèn)為是非一致性殘基的位點(diǎn)。
[0031]兩條序列之間一致性百分比的確定可以使用數(shù)學(xué)算法來完成?？梢杂糜诒葘?duì)兩條序列的數(shù)學(xué)算法的非限制性不例是Karlin和Altschul (1990) Proc.Natl.Acad.Sc1.USA87:2264 的算法，在 Karlin 和 Altschul (1993) Proc.Natl.Acad.Sc1.USA90:5873-5877 中所改進(jìn)。此算法并入到 Altschul 等，(1990) J.Mol.Biol.215:403 的 BLASTN 和 BLASTX 程序中。可以用BLASTN程序，得分=100，字段長(zhǎng)度=12實(shí)施BLAST核苷酸搜索，以獲得與本發(fā)明的類殺蟲核酸分子同源的核苷酸序列?？梢杂肂LASTX程序得分=50，字段長(zhǎng)度=3實(shí)施BLAST蛋白質(zhì)搜索，以獲得與本發(fā)明的殺蟲蛋白同源的氨基酸序列。為了獲得出于比較目的的空缺比對(duì),可以利用如Altschul等，(1997)Nucleic Acids Res.25:3389.中所述的Gapped BLAST (在BLAST2.0中)。另外，PS1-Blast可以用于實(shí)施檢測(cè)分子之間遠(yuǎn)源關(guān)系的重復(fù)搜索。參見 Altschul 等，(1997)，同上。當(dāng)利用 BLAST, Gapped BLAST 和 PS1-BLAST 程序時(shí)，可以使用各個(gè)程序(例如BLASTX和BLASTN)的默認(rèn)參數(shù)。還可通過目測(cè)人工實(shí)施比對(duì)。
[0032]用于序列比較的數(shù)學(xué)算法的另一個(gè)非限制性示例是ClustalW算法(Higgins等，(1994)Nucleic Acids Res.22:4673-4680)。ClustalW 算法比較序列和比對(duì)整條氨基酸或DNA序列，因此能夠提 供關(guān)于整條氨基酸序列的序列保守性的數(shù)據(jù)。ClustalW算法用于幾種市售的DNA/氨基酸分析軟件包中，例如Vector NTI Program Suite (InvitrogenCorporation, Carlsbad, CA)的ALIGNX模塊。用ClustalW對(duì)氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)后,可以估算出氨基酸一致性百分比。用于分析ClustalW比對(duì)的軟件程序的非限制示例是GENED0C?。GENED0C? (Karl Nicholas)允許估算多個(gè)蛋白之間的氨基酸(或DNA)相似性和一致性。用于序列比較的數(shù)學(xué)算法的另一個(gè)非限制性示例是Myers tMiller (1988) CAB10S4:11-17的算法。此算法并入到ALIGN程序(2.0版本)中，所述ALIGN程序是GCG Wisconsin GeneticsSoftware, VersionlO (可從 Accelrys, Inc.，9685Scranton Rd., San Diego, CA, USA 獲得)的一部分。當(dāng)利用ALIGN程序比較氨基酸序列時(shí)，可以使用PAM120權(quán)重殘基表，空缺長(zhǎng)度罰分為12,空缺罰分為4。
[0033]除非另有說明，將利用使用Needleman和Wunsch (1970) J.Mol.Biol.48(3):443-453算法的GAP VersionlO，利用以下參數(shù)確定一致性或相似性:對(duì)于核苷酸序列的一致性％和相似性％，使用GAP權(quán)重50和長(zhǎng)度權(quán)重3以及nwsgapdna.cmp評(píng)分矩陣；對(duì)于氨基酸序列的一致性％和相似性％，使用GAP權(quán)重8和長(zhǎng)度權(quán)重2以及BL0SUM62評(píng)分程序。還可以使用等同的程序。“等同的程序”意指對(duì)于所研究的任意兩條序列而言，當(dāng)與由GAP VersionlO所產(chǎn)生的相應(yīng)比對(duì)結(jié)果相比時(shí)，產(chǎn)生具有一致的核苷酸殘基匹配以及一致的序列一致性百分比比對(duì)結(jié)果的任意序列比對(duì)程序。[0034]本發(fā)明還包括變體核酸分子。編碼殺蟲蛋白的核苷酸序列的“變體”包括編碼本文中公開的殺蟲蛋白，但是卻由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并性而保守地不同的那些序列，以及如上文所討論的充分一致的那些序列。天然存在的等位基因變體可以使用熟知的分子生物學(xué)技術(shù)來鑒定，例如下文概述的的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)和雜交技術(shù)。變體核苷酸序列還包括合成來源的核苷酸序列，其例如通過利用位點(diǎn)定向誘變法制備，但是如下文所討論仍然編碼本發(fā)明公開的殺蟲蛋白。本發(fā)明所包括的變體蛋白是具有生物學(xué)活性的，即它們繼續(xù)擁有天然蛋白的期望生物學(xué)活性，即殺蟲活性?！氨Ａ艋钚浴币庵缸凅w將具有天然蛋白的至少約30%、至少約50%、至少約70%或至少約80%的殺蟲活性。在一些實(shí)施方案中，活性相對(duì)于本文中別處所定義的參考?xì)⑾x蛋白可以被改進(jìn)或擴(kuò)大。測(cè)量殺蟲活性的方法是本領(lǐng)域熟知的。參見例如 Czapla 和 Lang(1990) J.Econ.Entomol.83:2480-2485;Andrews 等，(1988)Biochem.J.252:199-206;Marrone 等，(1985) J.0f Economic Entomology78:290-293;以及美國(guó)專利N0.5，743，477，所有這些文獻(xiàn)作為整體通過引用并入本文。
[0035]技術(shù)人員將進(jìn)一步領(lǐng)會(huì)到，可以通過突變本發(fā)明的核苷酸序列來引入改變，從而導(dǎo)致編碼殺蟲蛋白的氨基酸序列發(fā)生變化，而不會(huì)改變蛋白的生物學(xué)活性。因此，可以通過將一個(gè)或多個(gè)核苷酸置換、添加或缺失引入本文中公開的相應(yīng)核苷酸序列中而產(chǎn)生分離的變體核酸分子，以將一個(gè)或多個(gè)氨基酸置換、添加或缺失引入所編碼的蛋白中?？梢酝ㄟ^標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，例如位點(diǎn)定點(diǎn)突變和PCR介導(dǎo)的突變來引入突變。這種變體核苷酸序列也包括在本發(fā)明中。
[0036]例如，可以在一個(gè)或多個(gè)預(yù)測(cè)的非必需氨基酸殘基上進(jìn)行保守性氨基酸置換。“非必需”氨基酸殘基是可以由殺蟲蛋白的野生型序列中改變而不會(huì)改變生物學(xué)活性的殘基，而“必需”氨基酸殘基則是生物學(xué)活性所需的。“保守性氨基酸置換”是其中氨基酸殘基被具有相似側(cè)鏈的氨基酸所替換。在本領(lǐng)域中已經(jīng)定義了具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基家族。這些家族包括具有堿性側(cè)鏈的氨基酸(例如賴氨酸、精氨酸、組氨酸)、具有酸性側(cè)鏈的氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)、具有不帶電荷極性側(cè)鏈的氨基酸(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、具有非極性側(cè)鏈的氨基酸(例如丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、具有分支側(cè)鏈的氨基酸(例如蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)以及具有芳香族側(cè)鏈的氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)。
[0037]可以在保留功能的非保守性區(qū)域中進(jìn)行氨基酸置換。一般來講，不會(huì)對(duì)保守性氨基酸殘基或存在于保守性基序(其中這些殘基對(duì)于蛋白活性而言是必需的)內(nèi)的氨基酸殘基進(jìn)行這種置換。保守的以及可能對(duì)于蛋白活性而言是必需的殘基的示例包括例如在與本發(fā)明序列相似或相關(guān)的毒素的比對(duì)中所含的所有蛋白之間相一致的殘基(例如在同源蛋白的比對(duì)中一致的殘基)。保守的但是可以允許保守性氨基酸置換并且仍然保留活性的殘基的示例包括例如在與本發(fā)明序列相似或相關(guān)的毒素的比對(duì)中所含的所有蛋白之間僅具有保守性置換的殘基(例如，在同源蛋白比對(duì)中所含的所有蛋白質(zhì)之間僅具有保守性置換的殘基)。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解，功能性變體可以在保守性殘基中具有微小的保守性或非保守性改變。
[0038]另外，可通過沿全部或部分編碼序列隨機(jī)引入突變而產(chǎn)生變體核苷酸序列，例如通過飽和突變法，并且針對(duì)賦予殺蟲活性的能力對(duì)所得的突變體進(jìn)行篩選，以鑒定保留活性的突變體。突變之后，可以使所編碼的蛋白重組表達(dá)，并且利用標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定技術(shù)確定蛋白活性。
[0039] 利用例如PCR、雜交等的方法，可以鑒定相應(yīng)的殺蟲序列，此序列與本發(fā)明的序列具有基本一致性。參見例如 Sambrook和 Russell (2001)Molecular Cloning:A LaboratoryManual.(Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY)和 Innis 等，(1990)PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications(Academic Press, NY).[0040]在雜交方法中，可以利用全部或部分殺蟲核苷酸序列對(duì)cDNA或基因組文庫(kù)進(jìn)行篩選。構(gòu)建這些cDNA和基因組文庫(kù)的方法一般是本領(lǐng)域已知的，并且公開于同上的Sambrook和Russell, 2001中。所謂的雜交探針可以是基因組DNA片段、cDNA片段、RNA片段或其它寡核苷酸，并且可以用可檢測(cè)基團(tuán)例如32P或其它可檢測(cè)標(biāo)記例如其它放射性同位素、熒光化合物、酶或酶輔助因子進(jìn)行標(biāo)記?？梢詫?duì)基于本文中所公開編碼已知?dú)⑾x蛋白的核苷酸序列的合成性寡核苷酸進(jìn)行標(biāo)記而制備雜交探針。額外地，可以利用基于核苷酸序列或所編碼氨基酸序列中的保守性核苷酸或氨基酸殘基而設(shè)計(jì)的簡(jiǎn)并引物。探針通常包含在嚴(yán)格條件下與編碼本發(fā)明殺蟲蛋白的核苷酸序列或者其片段或變體的至少約12、至少約25、至少約50、75、100、125、150、175或200個(gè)連續(xù)性核苷酸雜交的核苷酸序列區(qū)域。制備雜交探針的方法一般是本領(lǐng)域已知的，并且公開于同上通過引用并入本文的Samtoook和 Russell, 2001 中。
[0041]例如，本文所公開的整條殺蟲序列或者其一個(gè)或多個(gè)部分，可以用作能夠與相應(yīng)的殺蟲蛋白類似序列和信使RNAs特異性雜交的探針。為了在多種條件下實(shí)現(xiàn)特異性雜交，這些探針包含獨(dú)特的并且優(yōu)選長(zhǎng)度為至少約10個(gè)核苷酸或長(zhǎng)度為至少約20個(gè)核苷酸的序列。這些探針可用于通過PCR從所選的有機(jī)體中擴(kuò)增相應(yīng)的殺蟲序列。該技術(shù)可以用于從期望的有機(jī)體中分離額外的編碼序列或作為診斷測(cè)定法以確定有機(jī)體中編碼序列的存在。雜交技術(shù)包括平板DNA文庫(kù)的雜交篩選(蝕菌斑或菌落，參見例如Sambrook等，(1989)Molecular Cloning:A Laboratory Manual(2d ed., Cold Spring Harbor LaboratoryPress, Cold Spring Harbor, New York)。
[0042]因此，本發(fā)明包括雜交探針，以及能夠與本發(fā)明核苷酸序列的全部或部分(例如至少約 300 個(gè)核苷酸、至少約 400 個(gè)、至少約 500、1000、1200、1500、2000、2500、3000、3500 個(gè)，
或直至本文中公開的核苷酸序列的全長(zhǎng))雜交的核苷酸序列。這種序列的雜交可以在嚴(yán)格條件下實(shí)施?！皣?yán)格條件”或“嚴(yán)格雜交條件”意指在該條件下探針與其靶標(biāo)序列雜交的可檢測(cè)程度高于與其它序列的雜交(例如，高于背景至少2倍)。嚴(yán)格條件是序列依賴性的，并且在不同的情況下將是不同的。通過控制雜交和/或洗滌條件的嚴(yán)格性，可以鑒定出與探針100%互補(bǔ)的靶標(biāo)序列(同源探測(cè))。另外，可以調(diào)整嚴(yán)格條件以允許序列中的一些錯(cuò)配，以便檢測(cè)到較低程度的相似性(異源探測(cè))。一般來講，探針的長(zhǎng)度少于1000個(gè)核苷酸，優(yōu)選長(zhǎng)度少于500個(gè)核苷酸。
[0043]通常，嚴(yán)格條件將是其中鹽濃度為小于約1.5M Na離子，通常約0.01至1.0M Na離子濃度(或其它鹽類)，PH為7.0-8.3，以及對(duì)于短探針(例如10-50個(gè)核苷酸)溫度為至少約30°C，對(duì)于長(zhǎng)探針(例如大于50個(gè)核苷酸)溫度為至少約60°C的那些。還可以通過加入去穩(wěn)定劑例如甲酰胺來實(shí)現(xiàn)嚴(yán)格條件。示例性的低嚴(yán)格條件包括用30至35%甲酰胺、IM NaCl、l%SDS (十二烷基磺酸鈉)的溶液于37°C雜交，并且在IX至2XSSC (20XSSC=3.0MNaCl/0.3M檸檬酸三鈉)中于50至55°C洗滌。示例性的中等嚴(yán)格條件包括在40至45%甲酰胺、IM NaCl、l%SDS的溶液中于37°C雜交，并且在0.5X至IX SSC中于55至650°C洗滌。示例性的高嚴(yán)格條件包括在50%甲酰胺、IM NaCl、1%SDS的溶液中于37°C雜交，并且在0.1XSSC中于60至65°C洗滌?？蛇x地，洗滌緩沖液可以包含約0.1%至約1%的SDS。雜交的持續(xù)時(shí)間一般少于約24小時(shí),通常約4至12小時(shí)。
[0044]特異性通常是雜交后洗滌的函數(shù)，關(guān)鍵因素是離子強(qiáng)度和最終洗滌溶液的溫度。對(duì)于DNA-DNA雜交，Tni可以從Meinkoth和 Wahl (1984) Anal.Biochem.138:267-284 的公式中估算得到:Tm=81.5°C +16.6 (log Μ) +0.41 (%GC) _0.61 (%form) -500/L ;其中 M 是一價(jià)陽(yáng)離子的摩爾濃度，%GC是DNA中鳥苷酸和胞嘧啶核苷酸的百分比，%form是雜交溶液中甲酰胺的百分比，L是堿基對(duì)中雜交體的長(zhǎng)度。Tm是這樣的溫度(在限定的離子強(qiáng)度和pH下)，在該溫度下50%的互補(bǔ)靶序列與完美匹配的探針雜交。每1%的錯(cuò)配，Tm降低約1°C;因此，可以調(diào)整Tm、雜交和/或洗滌條件，以與期望一致性的序列雜交。例如，如果要找尋具有> 90% —致性的序列，^可以降低10°C。一般來講，所選擇的嚴(yán)格條件比特定離子強(qiáng)度和pH下特異性序列及其互補(bǔ)物的熱熔解點(diǎn)(Tm)低約5°C。然而，非常嚴(yán)格條件可以利用比熱熔解點(diǎn)(Tm)低1、2、3或4°C下的雜交和/或洗滌；中等嚴(yán)格條件可以利用比熱熔解點(diǎn)(Tm)低6、7、8、9或I (TC下的雜交和/或洗滌；低嚴(yán)格條件可以利用比熱熔解點(diǎn)(Tm)低11、12、13、14、15或20°C下的雜交和/或洗滌。利用該等式、雜交和洗滌組合物以及期望的Tm，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將會(huì)理解，隱含描述了雜交嚴(yán)格性和/或洗滌溶液的變化形式。如果錯(cuò)配的期望程度導(dǎo)致Tm小于45°C (水性溶液)或32°C (甲酰胺溶液)，則優(yōu)選提高SSC的濃度以使能夠使用較高的溫度。對(duì)于核酸雜交的延伸性指導(dǎo)出現(xiàn)于Tijssen(1993)Laboratory Techniques inBiochemistry and Molecular Biology—Hybridization with Nucleic Acid Probes, PartI, Chapter2 (Elsevier, New York);和 Ausubel 等，eds.(1995) Current Protocols inMolecular Biology,Chapter2(Greene Publishing and Wiley-1ntersciencej New York)中。參見See Sambrook等，(1989)Molecular Cloning:A Laboratory Manual (2d ed.，ColdSpring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York)。
[0045]分離的蛋白及其變體和片段
[0046]本發(fā)明中還包括殺蟲蛋白?！皻⑾x蛋白”意指具有SEQ ID NO:48和15-31所不氣基酸序列的蛋白。還提供了其片段、生物學(xué)活性部分和變體，其可以用于實(shí)踐本發(fā)明的方法?！胺蛛x的蛋白”或“重組蛋白”用于指不再處于其天然環(huán)境中，例如處于體外或者重組細(xì)菌或植物宿主細(xì)胞中的蛋白。
[0047]“片段”或“生物學(xué)活性部分”包括包含與SEQ ID NO:48和15_31所示氨基酸序列充分一致的氨基酸序列并且表現(xiàn)出殺蟲活性的多肽片段。殺蟲蛋白的生物學(xué)活性部分可以是例如長(zhǎng)度為 10、25、50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100、1150、1200、1250、1300、1350 個(gè)或更多氨基酸的多肽。可以通過重組技術(shù)來制備這種生物學(xué)活性部分，并且評(píng)估其殺蟲活性。測(cè)量殺蟲活性的方法是本領(lǐng)域熟知的。參見例如Czapla和Lang (1990) J.Econ.Entomol.83:2480-2485; Andrews 等，(1988) Biochem.J.252:199-206;Marrone 等，(1985)J.0f Economic Entomology78:290-293;和美國(guó)專利 N0.5，743，477，所有這些文獻(xiàn)作為整體通過引用并入本文。如本文所使用，片段包含SEQ ID N0:48和15-31的至少8個(gè)連續(xù)的氨基酸。然而，本發(fā)明包括其它片段，例如蛋白中長(zhǎng)度大于約10、20、30、50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100、1150、1200、1250、1300、1350個(gè)或更多氨基酸的任意片段。
[0048]“變體”意指具有與SEQ ID NO: 48和15_31任一項(xiàng)的氨基酸序列至少約60%，約 70%、75%,約 80%、85%,約 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或 99% —致的氨基酸序列的蛋白或多肽。變體還包括在嚴(yán)格條件下與SEQ ID N0:47和1-14所示的核酸分子或其互補(bǔ)物雜交的核酸分子所編碼的多肽。變體包括因突變而導(dǎo)致氨基酸序列不同的多肽。本發(fā)明所包括的變體蛋白是具有生物學(xué)活性的，即它們繼續(xù)擁有天然蛋白的期望生物學(xué)活性，即保留殺蟲活性。在一些實(shí)施方案中，變體相對(duì)于天然蛋白具有改進(jìn)的活性。測(cè)量殺蟲活性的方法是本領(lǐng)域熟知的。參見例如Czapla和Lang(1990) J.Econ.Entomol.83:2480-2485; Andrews 等，(1988) Biochem.J.252:199-206;Marrone 等，(1985)J.0f Economic Entomology78:290-293和美國(guó)專利N0.5，743，477，所有這些文獻(xiàn)作為整體通過引用并入本文。
[0049]細(xì)菌基因，例如本發(fā)明的axmi基因，在開放閱讀框的起始點(diǎn)附近常常具有多個(gè)甲硫氨酸起始密碼子。通常一個(gè)或多個(gè)這些起始密碼子處的翻譯起始將導(dǎo)致產(chǎn)生功能性蛋白。這些起始密碼子可以包括ATG密碼子。然而，細(xì)菌例如芽孢桿菌屬還會(huì)將密碼子GTG識(shí)別為起始密碼子，在GTG密碼子處起始翻譯的蛋白在第一個(gè)氨基酸處含有甲硫氨酸。在極少數(shù)情況下，細(xì)菌系統(tǒng)中的翻譯可以在TTG密碼子處起始，不過在這種情況下TTG編碼甲硫氨酸。此外，通常不能先驗(yàn)地確定這些密碼子中的哪些在細(xì)菌中是天然使用的。因此，可以理解的是，使用替代性甲硫氨酸密碼子之一也可以導(dǎo)致產(chǎn)生殺蟲蛋白。這些殺蟲蛋白包括在本發(fā)明中，并且可以用于本發(fā)明的方法中。將要理解的是，當(dāng)在植物中表達(dá)時(shí)，將替代性起始密碼子改變成ATG以正確翻譯是必需的。
[0050]還包括本發(fā)明多肽或者其變體或片段的抗體。產(chǎn)生抗體的方法是本領(lǐng)域熟知的(參見例如 Harlow 和 Lane (1988) Antibodies:A Laboratory Manual, Cold Spring HarborLaboratory, Cold Spring Harbor, NY;美國(guó)專利 N0.4, 196, 265)。
[0051]改奪或改講的奪體
[0052]已認(rèn)識(shí)到可以通過多種方法改變殺蟲蛋白的DNA序列，并且這些改變可能導(dǎo)致DNA序列編碼具有與由本發(fā)明殺蟲蛋白所編碼不同的氨基酸序列的蛋白。該蛋白可以用多種方式改變，包括SEQ ID N0:48和15-31的一個(gè)或多個(gè)氨基酸的氨基酸置換、缺失、截短和插入，包括在C末端部分或N末端部分或者二者中多至約2、約3、約4、約5、約6、約7、約8、約9、約10、約15、約20、約25、約30、約35、約40、約45、約50、約55、約60、約65、約 70、約 75、約 80、約 85、約 90、約 100、約 105、約 110、約 115、約 120、約 125、約 130、約135、約140、約145、約150、約155個(gè)或更多個(gè)氨基酸的置換、缺失或插入。用于這些操作的方法一般是本領(lǐng)域已知的。例如，可以通過DNA中的突變制備殺蟲蛋白的氨基酸序列變體。這還可以通過突變的幾種形式之一和/或定向進(jìn)化來完成。在一些方面中，氨基酸序列中編碼的改變將基本上不會(huì)影響蛋白的功能。這些變體將擁有期望的殺蟲活性。然而，可以理解的是，可以通過對(duì)本發(fā)明的組合物上使用這些技術(shù)來改進(jìn)殺蟲蛋白賦予殺蟲活性的能力。例如，可以在DNA復(fù)制期間表現(xiàn)出高堿基錯(cuò)誤摻入率的宿主細(xì)胞(例如XL-1Red(Stratagene, La Jolla, CA))中表達(dá)殺蟲蛋白。在這些菌株中增殖之后，可以分離DNA (例如通過制備質(zhì)粒DNA，或通過PCR擴(kuò)增并將所得PCR片段克隆入載體中)，在未突變菌株中培養(yǎng)殺蟲蛋白突變體，并例如通過進(jìn)行測(cè)試殺蟲活性的測(cè)定從而鑒定具有殺蟲活性的已突變基因。一般來講，將蛋白混合并用于飼喂測(cè)定中。參見例如Marrone等，(1985) J.0fEconomic Entomology78:290-293。這種測(cè)定可以包括使植物與一種或多種害蟲接觸,并確定植物存活和/或造成害蟲死亡的能力。導(dǎo)致毒性增加的突變的示例存在于Schm5Pf等，(1998)Microbiol.Mol.Biol.Rev.62:775-806 中。
[0053]另外，可以在氨基或羧基末端處改變?cè)S多蛋白的蛋白序列，而基本上不會(huì)影響活性。這可以包括通過現(xiàn)代分子學(xué)方法例如PCR引入的插入、缺失或改變，包括由于PCR擴(kuò)增中使用的寡核苷酸中包含氨基酸編碼序列而改變或延伸蛋白編碼序列的PCR擴(kuò)增。另外，所添加的蛋白序列可以包括整個(gè)蛋白編碼序列，例如本領(lǐng)域常用的用于產(chǎn)生蛋白融合體的那些。這種融合蛋白通常用于(I)增加目的蛋白的表達(dá)(2)引入結(jié)合結(jié)構(gòu)域、酶活性或便于蛋白純化、蛋白檢測(cè)的表位或本領(lǐng)域已知的其它實(shí)驗(yàn)用途(3)將蛋白靶向分泌或翻譯至亞細(xì)胞器官，例如革蘭氏陰性細(xì)菌的周質(zhì)間隙或真核細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，后者常常導(dǎo)致蛋白的糖基化。
[0054]本發(fā)明的核苷酸和氨基酸序列變體還包括突變和重組方法例如DNA改組衍生的序列。利用此種方法，可以利用一個(gè)或多個(gè)不同的殺蟲蛋白編碼區(qū)域產(chǎn)生擁有期望特性的新殺蟲蛋白。以這種方式，由一群相關(guān)序列的多聚核苷酸制備重組多聚核苷酸文庫(kù)，所述相關(guān)序列的多聚核苷酸包含基本上序列一致并且能夠在體外或體內(nèi)同源重組的序列區(qū)。例如，利用該方法，可以在本發(fā)明的殺蟲基因和其它已知的殺蟲基因之間對(duì)編碼目的結(jié)構(gòu)域的序列基序進(jìn)行改組，以獲 得編碼具有改進(jìn)的目的特性(例如增加的滅蟲活性)的蛋白的新基因。用于這種DNA改組的方案是本領(lǐng)域已知的。參見例如Stemmer (1994)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA91:10747-10751;Stemmer(1994)Nature370:389-391;Crameri 等，(1997)Nature Biotech.15:436-438;Moore 等，(1997) J.Mol.Biol.272:336-347; Zhang等，(1997)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA94:4504-4509; Crameri 等，(1998)Nature391:288-291 以及美國(guó)專利 N0.5，605，793 和 5，837，458。
[0055]結(jié)構(gòu)域交換或改組是產(chǎn)生改變的殺蟲蛋白的另一種機(jī)制?？梢栽跍缦x蛋白之間交換結(jié)構(gòu)域，產(chǎn)生具有改進(jìn)的殺蟲活性或靶標(biāo)譜的雜合體或嵌合體毒素。產(chǎn)生重組蛋白以及對(duì)它們進(jìn)行殺蟲活性測(cè)試的方法是本領(lǐng)域已知的(參見例如Naimov等，(2001) Appl.Environ.Microbiol.67: 5328-5330 ; de Maagd 等，(1996) Appl.Environ.Microbiol.62:1537-1543;Ge 等，(1991)J.Biol.Chem.266:17954-17958;Schnepf等，(1990) J.Biol.Chem.265: 20923-20930 ; Rang 等，(1999) Appl.Environ.Microbiol.65:2918-2925)。
[0056]因此，在本發(fā)明的多種實(shí)施方案中，本文中包括的核酸序列(以及包含核酸序列的組合物、載體、宿主細(xì)胞、植物和種子)包含一種或多種毒素的一部分和一種或多種不同毒素的一部分。在一個(gè)實(shí)施方案中，核酸序列包含編碼Axmi005 (SEQ ID N0:45中所不)N末端部分和Axmill5 (SEQ ID NO:43中所示)C末端部分的核苷酸序列。在特定的實(shí)施方案中，Axmi005的N末端部分包含Axmi005的約第I位至第173位氨基酸殘基，或從約第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45 或 50 位至約 150、155、160、165、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、185、190、195、200、205、210、220、225、230、250、300、325或350位氨基酸殘基，Axmi 115的C末端部分包含從Axmi 115的約第174位氨基酸殘基至約第 803 位氨基酸殘基，或從約第 174、175、176、177、178、179、180、185、190、195、200、205、210、220、225、230、250、300、325 或 350 位氨基酸殘基至約第 600、650、700、750、760、770、780、790、795、796、797、798、799、800、801、802 或 803 位氨基酸殘基。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，可以在每條氨基酸序列中進(jìn)行細(xì)微的變異和缺失并且仍然保持(或改進(jìn))融合蛋白的活性。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的核酸序列編碼Axmi005/Axmi 115融合蛋白，所述融合蛋白在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:43的第584、588和771位氨基酸殘基的一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)處具有突變(相對(duì)于親本Axmi005或Axmi115蛋白的相應(yīng)區(qū)域)(參見例如SEQ ID NO:18_22中的變體融合序列)。在其它實(shí)施方式中，本文中包括的核苷酸序列如SEQ ID NO:47和1-14中任一項(xiàng)所不，氨基酸序列如SEQ ID N0:48和15-31中任一項(xiàng)所不。
[0057]在多種實(shí)施方案中411^005與4111^115的融合導(dǎo)致氨基酸序列與單獨(dú)的Axmi005或Axmill5相比具有改進(jìn)的或擴(kuò)大的活性。“改進(jìn)的”活性意指與天然蛋白相比使至少一種害蟲的死亡增加或使害蟲生長(zhǎng)、進(jìn)食或正常生理發(fā)育的明顯降低增加?！皵U(kuò)大的”活性意指Axmi005和Axmi 115 二者均未顯示針對(duì)一種害蟲的活性。例如，Axmi005的一部分與Axmi 115的一部分融合可以產(chǎn)生具有Axmi005和Axmi 115 二者的活性譜的蛋白。在一些實(shí)施方案中，融合蛋白針對(duì)單個(gè)害蟲的活性相對(duì)于Axmi005和/或Axmill5之一或二者得到了改進(jìn)。
[0058]載體
[0059]本發(fā)明的 殺蟲序列可以提供于用于在目的植物中表達(dá)的表達(dá)盒中?！爸参锉磉_(dá)盒”意指能夠使得在植物細(xì)胞中由開放閱讀框表達(dá)蛋白的DNA構(gòu)建體。通常這些含有啟動(dòng)子和編碼序列。這種構(gòu)建體常常還含有3’非翻譯區(qū)。這種構(gòu)建體可以含有“信號(hào)序列”或“前導(dǎo)序列”，以便于肽共翻譯或翻譯后轉(zhuǎn)運(yùn)至特定的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)，例如葉綠體(或其它質(zhì)體)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或聞爾基體。
[0060]“信號(hào)序列”意指已知的或疑似導(dǎo)致肽共翻譯或翻譯后跨細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)的序列。在真核生物中，這通常包括分泌進(jìn)入高爾基體，伴隨一些因此而發(fā)生的糖基化。細(xì)菌的滅蟲毒素常常合成為原毒素，其在革巴標(biāo)害蟲的腸道內(nèi)被蛋白水解活化(Chang(1987)MethodsEnzymo1.153:507-516)。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中,信號(hào)序列位于天然序列中，或可以由本發(fā)明的序列衍生得到?！扒皩?dǎo)序列”意指當(dāng)翻譯時(shí)產(chǎn)生足以引發(fā)肽鏈共翻譯轉(zhuǎn)運(yùn)至亞細(xì)胞器官的氨基酸序列的任何序列。因此，這包括通過穿入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、穿過囊泡、質(zhì)體(包括葉綠體、線粒體等)等引導(dǎo)轉(zhuǎn)運(yùn)和/或糖基化的前導(dǎo)序列。
[0061]“植物轉(zhuǎn)化載體”意指有效轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞所必需的DNA分子。這種分子可以由一個(gè)或多個(gè)植物表達(dá)盒組成，并且可以組織成多于一個(gè)“載體"DNA分子。例如，雙元載體是利用兩個(gè)非連續(xù)性編碼用于植物細(xì)胞轉(zhuǎn)化的所有必要的順式或反式作用功能的植物轉(zhuǎn)化載體(Hellens 和 Mullineaux (2000) Trends in Plant Science5:446-451 )。“載體，，是指設(shè)計(jì)用于在不同宿主細(xì)胞間轉(zhuǎn)移的核酸構(gòu)建體?！氨磉_(dá)載體”是指具有在外來細(xì)胞中并入、整合和表達(dá)異源DNA序列或片段的能力的載體。表達(dá)盒將包含與本發(fā)明的序列可操作連接的5’和/或3’調(diào)控序列?！翱刹僮鬟B接”意指啟動(dòng)子和第二序列之間的功能性連接，其中啟動(dòng)子序列起始和介導(dǎo)對(duì)應(yīng)于第二序列的DNA序列的轉(zhuǎn)錄。一般來講，可操作連接意味著所連接的核酸序列是連續(xù)的，并且有必要連接兩個(gè)蛋白編碼區(qū)域時(shí)是連續(xù)的并且處于相同的讀碼框中。表達(dá)盒可以額外地含有待共轉(zhuǎn)化入有機(jī)體的至少一種額外的基因。另外，可以在多個(gè)表達(dá)盒上提供額外的基因。
[0062]在多種實(shí)施方案中，本發(fā)明的核苷酸序列可操作連接到啟動(dòng)子上，例如植物啟動(dòng)子?！皢?dòng)子”是指功能為指導(dǎo)下游編碼序列進(jìn)行轉(zhuǎn)錄的核酸序列。啟動(dòng)子連同其它轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控核酸序列(也被稱為“控制序列”)是目的DNA序列的表達(dá)所必需的。
[0063]這種表達(dá)盒提供有用于插入處于調(diào)控區(qū)轉(zhuǎn)錄調(diào)控之下的殺蟲序列的多個(gè)限制性位點(diǎn)。
[0064]表達(dá)盒將在5’ -3’轉(zhuǎn)錄方向包括在植物中行使功能的轉(zhuǎn)錄和翻譯起始區(qū)(即啟動(dòng)子)、本發(fā)明的DNA序列以及翻譯和轉(zhuǎn)錄終止區(qū)(即終止區(qū))。啟動(dòng)子相對(duì)于植物宿主和/或本發(fā)明的DNA序列可以是天然的或類似物，或者是外來的或異源的。額外地，啟動(dòng)子可以是天然序列或另外地合成序列。當(dāng)啟動(dòng)子相對(duì)于植物宿主是“天然的”或“同源的”時(shí)，其意指啟動(dòng)子存在于引入該啟動(dòng)子的天然植物中。當(dāng)啟動(dòng)子相對(duì)于本發(fā)明的DNA序列是“外來的”或“異源的”時(shí)，其意指該啟動(dòng)子對(duì)于本發(fā)明可操作性連接的DNA序列而言不是天然或天然存在的啟動(dòng)子。
[0065]終止區(qū)相對(duì)于轉(zhuǎn)錄起始區(qū)可以是天然的，相對(duì)于可操作性連接的目的DNA序列可以是天然的，相對(duì)于植物宿主可以是天然的，或者可以衍生自另一種來源(即相對(duì)于啟動(dòng)子、目的DNA序列、植物宿主或其任意組合是外來的或異源的)。常規(guī)的終止區(qū)可以從農(nóng)桿菌(A.tumefaciens) Ti質(zhì)粒中獲得，例如章魚堿合酶和胭脂堿合酶的終止區(qū)。還參見 Guerineau 等，(1991)Mol.Gen.Genet.262:141_144;Proudfoot (1991)Cell 64:671-674; Sanfacon 等，(1991)Genes Dev.5:141-149;Mogen 等，(1990)PlantCell2:1261-1272;Munroe 等，(1990)Gene91:151-158;Balias 等，(1989)Nucleic AcidsRes.17:7891-7903;和 Joshi 等，(1987)Nucleic Acid Res.15:9627-9639。
[0066]適當(dāng)時(shí)，可以對(duì)基因進(jìn)行優(yōu)化，以增加在轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞中的表達(dá)。即，基因可以使用宿主細(xì)胞偏好的密碼子合成以提高表達(dá)，或者基因可以以宿主偏好的密碼子使用頻率利用密碼子合成。一般來講，基因的GC含量將會(huì)增加。對(duì)于宿主編好的密碼子使用的討論，參見例如Campbell和Gowri (1990)Plant Physiol.92:1-1l0用于合成植物偏好的基因的方法是本領(lǐng)域可獲得的。參見例如通過引用并入本文的美國(guó)專利Nos.5，380，831和 5,436,391、美國(guó)公開 N0.20090137409 以及 Murray 等，(1989) Nucleic AcidsRes.17:477-498。
[0067]在一個(gè)實(shí)施方案中，殺蟲蛋白靶向葉綠體中表達(dá)。以這種方式，當(dāng)殺蟲蛋白不是直接插入葉綠體中時(shí)，表達(dá)盒將額外地含有編碼引導(dǎo)殺蟲蛋白至葉綠體的轉(zhuǎn)運(yùn)肽的核酸。這種轉(zhuǎn)運(yùn)肽是本領(lǐng)域已知的。參見例如Von Heijne等，(1991)Plant Mol.Biol.Rep.9:104-126 ; Clark 等，(1989) J.Biol.Chem.264:17544-17550 ; Della-Cioppa 等，(1987) Plant Physiol.84:965-968 ; Romer 等，(1993) Biochem.Biophys.Res.Commun.196:1414-1421 和 Shah 等，(1986)Science233:478-481.[0068]可以對(duì)待靶向葉綠體的殺蟲基因進(jìn)行優(yōu)化以在葉綠體中表達(dá)，以解決植物細(xì)胞核和該細(xì)胞器之間密碼子使用的差異。以這種方式，目的核酸可以利用葉綠體偏好的密碼子合成。參見例如通過引用并入本文的美國(guó)專利N0.5，380, 831。
[0069]棺物轉(zhuǎn)化
[0070]本發(fā)明的方法包括將核苷酸構(gòu)建體引入植物中?！耙搿币庵敢詷?gòu)建體能夠進(jìn)入植物細(xì)胞內(nèi)部的方式將核苷酸構(gòu)建體呈遞至植物中。本發(fā)明的方法不需要使用特定方法將核苷酸構(gòu)建體引入植物中，只要核苷酸構(gòu)建體能夠進(jìn)入植物的至少一個(gè)細(xì)胞的內(nèi)部即可。將核苷酸構(gòu)建體引入植物中的方法是本領(lǐng)域已知的，包括但不限于穩(wěn)定轉(zhuǎn)化法、瞬時(shí)轉(zhuǎn)化法和病毒介導(dǎo)法。
[0071]“植物”意指整株植物、植物器官(例如葉、莖、根等)、種子、植物細(xì)胞、繁殖體、胚及其子代。植物細(xì)胞可以是分化的或未分化的(例如愈傷組織、懸浮培養(yǎng)細(xì)胞、原生質(zhì)、葉片細(xì)胞、根細(xì)胞、韌皮部細(xì)胞、花粉)。
[0072]“轉(zhuǎn)基因植物”或“轉(zhuǎn)化的植物”或“穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的”植物或細(xì)胞或組織是指植物細(xì)胞中已經(jīng)并入或整合入外源核酸序列的植物。這些核酸序列包括外源的或未轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞中不存在的那些，以及內(nèi)源的或培養(yǎng)開發(fā)部化的植物細(xì)胞中存在的那些?！爱愒吹摹币话闶侵笇?duì)于所存在其中的細(xì)胞或天然基因組部分而言不是內(nèi)源并且已經(jīng)通過感染、轉(zhuǎn)染、顯微注射、電穿孔等添加至細(xì)胞中的核酸序列。 [0073]本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物表達(dá)本文中公開的一種或多種新的毒素序列。在多個(gè)實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)基因植物進(jìn)一步包含一個(gè)或多個(gè)額外的昆蟲抗性基因(例如Cryl，例如Cry 1A、CryIB> CrylC、CryID> CrylE 和 CrylF 家族的成員；Cry2,例如 Cry2A 家族的成員；Cry9,例如Cry9A、Cry9B、Cry9C、Cry9D、Cry9E和Cry9F家族的成員，等)。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解的是，轉(zhuǎn)基因植物可以包含賦予目標(biāo)農(nóng)學(xué)性狀的任意基因。
[0074]植物細(xì)胞的轉(zhuǎn)化可以通過本領(lǐng)域已知的幾項(xiàng)技術(shù)之一完成。可以對(duì)本發(fā)明的殺蟲基因進(jìn)行修飾，以獲得或增強(qiáng)在植物細(xì)胞中的表達(dá)。通常表達(dá)這種蛋白的構(gòu)建體將含有驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子以及允許轉(zhuǎn)錄終止和多聚腺苷酸化的3’非翻譯區(qū)。此類構(gòu)建體的構(gòu)造是本領(lǐng)域熟知的。在一些情況下，可能有用的是使基因工程化以使所得到的肽分泌或另外靶向植物細(xì)胞內(nèi)部。例如，可以使基因工程化，以含有促進(jìn)肽轉(zhuǎn)移至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的信號(hào)肽。還優(yōu)選使植物表達(dá)盒工程化以含有內(nèi)含子，以使對(duì)于表達(dá)而言需要進(jìn)行內(nèi)含子的mRNA加工。
[0075]通常這種“植物表達(dá)盒”將插入“植物轉(zhuǎn)化載體”中。這種植物轉(zhuǎn)化載體可以包含實(shí)現(xiàn)植物轉(zhuǎn)化所需的一個(gè)或多個(gè)DNA載體。例如，本領(lǐng)域常見的實(shí)踐是利用包含多于一個(gè)連續(xù)性DNA節(jié)段的植物轉(zhuǎn)化載體。這些載體在本領(lǐng)域也被稱為“雙元載體”。雙元載體以及帶有輔助質(zhì)粒的載體最常用于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化，其中實(shí)現(xiàn)充分轉(zhuǎn)化所需的DNA節(jié)段的大小和復(fù)雜性相當(dāng)大，并且將功能分配至獨(dú)立的DNA分子是有利的。雙元載體通常含有質(zhì)粒載體，所述質(zhì)粒載體含有T-DNA轉(zhuǎn)移所需的順式作用序列、工程化以能夠在植物細(xì)胞中表達(dá)的選擇標(biāo)記和“目的基因”(工程化以能夠在對(duì)于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物所需要的植物細(xì)胞中表達(dá)的基因)。這種質(zhì)粒載體上還存在細(xì)菌復(fù)制所需的序列。順式作用序列以允許有效轉(zhuǎn)移至植物細(xì)胞中并且在其中表達(dá)的方式排列。例如，選擇標(biāo)記基因和殺蟲基因位于左邊界和右邊界之間。一般第二質(zhì)粒載體含有介導(dǎo)T-DNA從農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)移至植物細(xì)胞的反式作用因子。如本領(lǐng)域所理解，這種質(zhì)粒一般含有允許農(nóng)桿菌感染植物細(xì)胞的毒力功能(Vir基因)，以及通過在邊界序列處切割的DNA轉(zhuǎn)移和vir介導(dǎo)的DNA轉(zhuǎn)移(Hellens和Mullineaux (2000)Trends in Plant Science5:446-451 )?？梢允褂脦追N類型的農(nóng)桿菌菌株(例如LBA4404、GV3101、EHAlOU EHA105)進(jìn)行植物轉(zhuǎn)化。第二質(zhì)粒載體對(duì)于通過其他方法例如顯微投射、顯微注射、電穿孔、聚乙二醇法等轉(zhuǎn)化植物而言不是必需的。
[0076]一般來講，植物轉(zhuǎn)化方法涉及將異源DNA轉(zhuǎn)移至靶植物細(xì)胞(例如不成熟或成熟的胚、懸浮培養(yǎng)物、未分化的愈傷組織、原生質(zhì)體等)中，隨后施加最大閾值水平的適宜選擇(取決于選擇標(biāo)記基因)，以從一組未分化的細(xì)胞團(tuán)中回收轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞。通常將外植體轉(zhuǎn)移至相同培養(yǎng)基的新鮮補(bǔ)給物中并且例行培養(yǎng)。隨后，在放置于添加了最大閾值水平的選擇劑的再生培養(yǎng)基上后，轉(zhuǎn)化的細(xì)胞分化成苗。接著將苗轉(zhuǎn)移至選擇性生根培養(yǎng)基中，以回收生根的苗或小植株。轉(zhuǎn)基因的小植株接著生長(zhǎng)成成熟植物并且產(chǎn)生可育性種子(例如 Hiei 等，(1994) The Plant Journal6:271-282; Ishida et al.(1996)Nature Biotechnologyl4:745-750)。通常將外植體轉(zhuǎn)移至相同培養(yǎng)基的新鮮補(bǔ)給物中并且例行培養(yǎng)。對(duì)用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物的技術(shù)和方法的一般描述見于Ayres和Park(1994)Critical Reviews in Plant Science13:219-239 以及 Bommineni 和 Jauhar(1997)Maydica42:107-120中。由于轉(zhuǎn)化的材料含有許多細(xì)胞，轉(zhuǎn)化和未轉(zhuǎn)化的細(xì)胞均存在于任何一片經(jīng)處理的靶愈傷組織或組織或細(xì)胞群中。殺死未轉(zhuǎn)化細(xì)胞并且允許轉(zhuǎn)化的細(xì)胞增殖的能力導(dǎo)致產(chǎn)生轉(zhuǎn)化的植物培養(yǎng)物。一般去除未轉(zhuǎn)化細(xì)胞的能力是快速回收轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞和成功產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物的限制因素。
[0077]轉(zhuǎn)化步驟以及將核苷酸序列引入植物中的步驟可以根據(jù)轉(zhuǎn)化所靶向的植物或植物細(xì)胞類型即單子葉植物或雙子葉植物而變化?？梢酝ㄟ^幾種方法之一進(jìn)行轉(zhuǎn)基因植物的產(chǎn)生，包括但不限于顯微注射、電穿孔、直接基因轉(zhuǎn)移、通過農(nóng)桿菌將異源DNA引入植物細(xì)胞中(農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化)、用粘附至粒子的異源外來DNA轟擊植物細(xì)胞、射彈粒子加速、氣溶膠束轉(zhuǎn)化(美國(guó)公開申請(qǐng)N0.20010026941 ;美國(guó)專利N0.4，945,050 ;國(guó)際公開N0.W091/00915 ;美國(guó)公開申請(qǐng)N0.2002015066)、Lecl轉(zhuǎn)化以及轉(zhuǎn)移DNA的多種其他非粒子直接介導(dǎo)的方法。
[0078]用于轉(zhuǎn)化葉綠體的方法是本領(lǐng)域已知的。參見例如Svab等，(1990)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA87:8526-8530 ；Svab 和 Maliga(1993)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA90:913-917 ；Svab和Maliga(1993)EMBO J.12:601-606。該方法依賴于粒子槍遞送含有選擇標(biāo)記的DNA以及通過同源重組使DNA靶向至質(zhì)體基因組。額外地，質(zhì)體轉(zhuǎn)化可以通過利用細(xì)胞核編碼且導(dǎo)向質(zhì)體的RNA聚合酶的組織優(yōu)選性表達(dá)將質(zhì)體攜帶的沉默轉(zhuǎn)基因反式激活而實(shí)現(xiàn)。這種系統(tǒng)已經(jīng)報(bào)道于 Mcfcide 等，(1994)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA91:7301-7305 中。
[0079]將異源外來DNA整合入植物細(xì)胞中后，接著在培養(yǎng)中施加最大閾值水平的適宜選擇，以通過定期轉(zhuǎn)移至新鮮培養(yǎng)基從而殺死未轉(zhuǎn)化的細(xì)胞以及將在這種選擇處理中存活的推定轉(zhuǎn)化的細(xì)胞分離和增殖。通過連續(xù)傳代和用適宜的選擇攻擊，鑒定轉(zhuǎn)化了質(zhì)粒載體的細(xì)胞并使其增殖。接著可以利用分子和生化方法確認(rèn)存在整合入轉(zhuǎn)基因植物基因組中的目標(biāo)外源基因。
[0080]已經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞可以根據(jù)常規(guī)方法生長(zhǎng)成植物。參見例如McCormick等，(1986)Plant Cell Reports5:81_84。接著這些植物可以生長(zhǎng),用相同的轉(zhuǎn)化株系或不同的株系授粉，并鑒定期望表型特性組成型表達(dá)的所得雜交體?？梢耘嘤齼蓚€(gè)或多個(gè)世代，以確保期望表型特性的表達(dá)穩(wěn)定維持并且遺傳，并且接著收獲種子，以確保已經(jīng)實(shí)現(xiàn)期望表型特性的表達(dá)。利用這種方法，本發(fā)明提供了轉(zhuǎn)化的種子(也被稱為“轉(zhuǎn)基因種子”)，其使得本發(fā)明的核苷酸構(gòu)建體例如本發(fā)明的表達(dá)盒穩(wěn)定并入其基因組中。
[0081]植物轉(zhuǎn)化的評(píng)價(jià)
[0082]將異源外來DNA引入植物細(xì)胞中后，通過多種方法確認(rèn)異源基因轉(zhuǎn)化或整合入植物基因組中，例如對(duì)與所整合基因相關(guān)的核酸、蛋白和代謝物進(jìn)行分析。
[0083]PCR分析是在移植入土壤前的早期階段對(duì)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞、組織或苗篩選所并入基因的存在的快速方法(Sambrook 和 Russell (2001)Molecular Cloning:A LaboratoryManual.Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY)。利用對(duì)目的基因或農(nóng)桿菌載體背景等特異性的寡核苷酸引物實(shí)施PCR。
[0084]可以通過基因組DNA的Southern印跡分析確認(rèn)植物轉(zhuǎn)化(上文Sambrook和Russell, 2001)?？偟貋碇v，從轉(zhuǎn)化體中提取總DNA，用適宜的限制性酶消化，在瓊脂糖凝膠中分離并轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素或尼龍膜上。接著根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)利用例如放射性標(biāo)記的32P靶DNA片段對(duì)膜或“印跡物”進(jìn)行探測(cè)，以確認(rèn)所引入的基因整合入植物基因組中。
[0085]在Northern印跡分析中，從轉(zhuǎn)化體的特定組織中分離RNA,在甲醒瓊脂糖凝膠中分離并根據(jù)本領(lǐng)域例行使用的標(biāo)準(zhǔn)步驟(上文Sambrook和Russell, 2001)印跡至尼龍膜上。接著利用本領(lǐng)域已知方法(上文Sambrook和Russell, 2001),通過使膜與來源于殺蟲基因的放射活性探針雜交，對(duì)由殺蟲基因所編碼RNA的表達(dá)進(jìn)行測(cè)試。
[0086]可以對(duì)轉(zhuǎn)基因植物實(shí)施Western印跡、生化測(cè)定等，以利用與殺蟲蛋白上存在的一個(gè)或多個(gè)表位結(jié)合的抗體，通過標(biāo)準(zhǔn)步驟(上文Sambrook和Russell, 2001)確認(rèn)由殺蟲基因所編碼蛋白的存在。
[0087]植物中的殺蟲活性 [0088]在本發(fā)明的另一個(gè)方面中，可以產(chǎn)生表達(dá)具有殺蟲活性的殺蟲蛋白的轉(zhuǎn)基因植物?？梢岳蒙厦嫱ㄟ^示例方式描述的方法產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物，但是產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞的方式對(duì)于本發(fā)明而言并非關(guān)鍵。本領(lǐng)域已知或描述的方法，例如農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、生物射彈轉(zhuǎn)化和非粒子介導(dǎo)的方法，可以由實(shí)驗(yàn)者酌情使用。表達(dá)殺蟲蛋白的植物可以通過本領(lǐng)域描述的常規(guī)方法進(jìn)行分離，例如通過轉(zhuǎn)化愈傷組織、對(duì)轉(zhuǎn)化的愈傷組織進(jìn)行選擇和由這種轉(zhuǎn)基因愈傷組織再生可育性植物。在這一過程中，可以利用任意基因作為選擇標(biāo)記，只要其在植物細(xì)胞中的表達(dá)賦予鑒定或選擇轉(zhuǎn)化細(xì)胞的能力。
[0089]已經(jīng)開發(fā)了用于植物細(xì)胞的一些標(biāo)記，例如氯霉素、氨基糖甙G418、潮霉素等抗性標(biāo)記。編碼參與葉綠體代謝的產(chǎn)物的其他基因也可以用作選擇標(biāo)記。例如，提供對(duì)植物除草劑例如草甘膦、溴苯腈或咪唑啉酮的抗性的基因可能特別有用。已經(jīng)報(bào)道了這類基因(Stalker等，(1985) J.Biol.Chem.263:6310-6314 (溴苯腈抗性腈水解酶基因)和Sathasivan 等,(1990)Nucl.Acids Res.18:2188 (AHAS 咪唑啉酮抗性基因))。額外地,本文中公開的基因用作標(biāo)記，以評(píng)估細(xì)菌或植物細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。用于檢測(cè)轉(zhuǎn)基因在植物、植物器官(例如葉片、莖、根等)、種子、植物細(xì)胞、繁殖體、胚或其子代中的存在的方法是本領(lǐng)域熟知的。在一個(gè)實(shí)施方案中，通過測(cè)試殺蟲活性檢測(cè)轉(zhuǎn)基因的存在。
[0090]可以對(duì)表達(dá)殺蟲蛋白的可育性植物進(jìn)行殺蟲活性的測(cè)試，并且選擇顯示最佳活性的植物進(jìn)行進(jìn)一步育種。測(cè)定殺蟲活性的方法是本領(lǐng)域可獲得的。一般來講，將蛋白混合并用于飼喂測(cè)定中。參見例如 Marrone 等，(1985) J.0f Economic Entomology 78:290-293。
[0091]本發(fā)明可以用于轉(zhuǎn)化任何植物物種，包括但不限于單子葉植物和雙子葉植物。目的植物的示例包括但不限于谷物(玉米)、高梁、小麥、向日葵、番爺、十字花科植物、胡椒屬植物、馬鈴薯、棉花、稻、大豆、甜菜、甘鹿、煙草、大麥和油籽油菜、蕓色屬物種(Brassicasp.)、苜猜、黑麥、粟、紅花、花生、甘薯、木薯、咖啡、椰子、鳳梨、柑桔樹、可可、茶、香蕉、鱷梨、無花果、番石榴、芒果、油橄欖、番木瓜、腰果、全緣葉澳洲堅(jiān)果、扁桃、燕麥、蔬菜類、觀賞植物類和松柏類。
[0092]蔬菜包括但不限于番爺、生菜、青豆、利馬豆、豌豆和黃瓜屬(Curcumis)成員，例如黃瓜、網(wǎng)紋甜瓜和香甜瓜。觀賞植物包括但不限于杜鵑花、八仙花、朱槿、玫瑰、郁金香、水仙、矮牽牛、康乃馨、一品紅和菊花。優(yōu)選本發(fā)明的植物是作物植物(例如玉米、高梁、小麥、向日葵、番茄、十字花科植物、胡椒屬植物、馬鈴薯、棉花、稻、大豆、甜菜、甘蔗、煙草、大麥、油籽油菜等)。
[0093]在殺蟲控制中的用途
[0094]將包含本發(fā)明核苷酸序列或其變體的菌株應(yīng)用于殺蟲控制中或使其他有機(jī)體作為殺蟲劑的一般方法是本領(lǐng)域已知的。參見例如美國(guó)專利N0.5，039，523和EP0480762A2。
[0095]含有本發(fā)明核苷酸序列或其變體的芽孢桿菌屬菌株或已經(jīng)遺傳改變以含有本發(fā)明殺蟲基因和蛋白的微生物可以用于保護(hù)農(nóng)作物和農(nóng)產(chǎn)品免受害蟲損害。在本發(fā)明的一個(gè)方面中，用試劑對(duì)產(chǎn)生毒素(殺蟲劑)的有機(jī)體的完整即未裂解細(xì)胞進(jìn)行處理，所述試劑使得當(dāng)細(xì)胞應(yīng)用于靶害蟲的環(huán)境時(shí)，細(xì)胞中所產(chǎn)生毒素的活性延長(zhǎng)。
[0096]或者，通過將殺蟲基因引入細(xì)胞宿主中產(chǎn)生殺蟲劑。殺蟲基因的表達(dá)直接或間接導(dǎo)致該殺蟲劑的胞內(nèi)產(chǎn)生和維持。在本發(fā)明的一個(gè)方面中，接著在一定條件下對(duì)這些細(xì)胞進(jìn)行處理，所述條件使得當(dāng)細(xì)胞應(yīng)用于靶害蟲的環(huán)境時(shí)，細(xì)胞中所產(chǎn)生毒素的活性延長(zhǎng)。所得產(chǎn)物保留毒素的活性。接著可以根據(jù)常規(guī)技術(shù)對(duì)這些天然包囊化的殺蟲劑進(jìn)行配制，以應(yīng)用于靶害蟲所在環(huán)境，例如土壤、水和植物葉片。參見例如EPA0192319以及其中所引用的參考文獻(xiàn)?；蛘?，可以配制表達(dá)本發(fā)明基因的細(xì)胞，以允許應(yīng)用所得物質(zhì)作為殺蟲劑。
[0097]本發(fā)明的活性成分通常以組合物形式應(yīng)用，并且可以隨其他化合物同時(shí)或依次應(yīng)用于待處理的作物區(qū)域或植物。這些化合物可以是肥料、除草劑、抗凍劑、表面活性劑、去垢劑、殺蟲皂、休眠油、聚合物和/或在單次應(yīng)用制劑后允許對(duì)靶區(qū)域長(zhǎng)期投藥的延時(shí)釋放或生物可降解載體制劑。其還可以是選擇性除草劑、化學(xué)殺蟲劑、殺病毒劑、殺微生物劑、抗阿米巴藥、殺蟲劑、殺真菌劑、殺細(xì)菌劑、殺線蟲藥、殺螺劑或這些制備品中幾種制品的混合物，如果需要，連同制劑領(lǐng)域中通常使用的其他農(nóng)藥可接受載體、表面活性劑或應(yīng)用促進(jìn)佐劑。適宜的載體和佐劑可以是固體或液體，并且對(duì)應(yīng)于制劑技術(shù)中通常使有的物質(zhì)，例如天然或再生性礦物質(zhì)、溶劑、分散劑、潤(rùn)濕劑、增粘劑、粘合劑或肥料。同樣地，制劑可以制備成可食性“餌料”或加工成害蟲“陷阱”，以允許靶害蟲采食或攝取殺蟲制劑。
[0098]應(yīng)用含有本發(fā)明細(xì)菌菌株所產(chǎn)生至少一種殺蟲蛋白的本發(fā)明活性成分或本發(fā)明農(nóng)業(yè)化學(xué)組合物的方法包括葉面 應(yīng)用、種子包衣和土壤應(yīng)用。應(yīng)用的次數(shù)和應(yīng)用的速率取決于相應(yīng)害蟲的侵襲強(qiáng)度。
[0099]組合物可以配制為粉劑、塵劑、丸劑、粒劑、噴霧劑、乳劑、膠體、溶液等，并且可以通過常規(guī)手段例如對(duì)包含多肽的細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)行干燥、凍干、勻質(zhì)化、提取、過濾、離心、沉淀或濃縮而制備。在含有至少一種這類殺蟲多肽的所有這些組合物中，多肽可以以重量比為約1%至約99%的濃度存在。
[0100]可以通過本發(fā)明的方法殺死給定區(qū)域中鱗翅目、異翅目、雙翅目或鞘翅目害蟲或減少其數(shù)量，或者可以預(yù)防性應(yīng)用至某環(huán)境區(qū)域以防止易感害蟲侵襲。優(yōu)選害蟲攝取或接觸殺蟲有效量的多肽?！皻⑾x有效量”意指能夠使至少一種害蟲死亡或者能夠顯顯減少害蟲生長(zhǎng)、釆食或正常生理發(fā)育的殺蟲劑量。該量將根據(jù)如以下所述因素變化，例如待控制的特定靶害蟲、特定環(huán)境、位置、植物、作物或農(nóng)業(yè)地點(diǎn)、環(huán)境條件，以及有效殺蟲的多肽組合物的應(yīng)用方法、速率、濃度、穩(wěn)定性和量。制劑還可以根據(jù)氣候條件、環(huán)境考慮和/或應(yīng)用頻率和/或害蟲侵襲的嚴(yán)重程度方面而變化。
[0101]所描述的殺蟲組合物可以通過將細(xì)菌細(xì)胞、晶體和/或孢子懸液或者分離的蛋白組分與期望的農(nóng)業(yè)上可接受的載體進(jìn)行配制而制備。組合物可以在施用之前以適宜手段配制，例如凍干、冷凍干燥或在水性載體、培養(yǎng)基或合適的稀釋劑中，例如鹽水落石出或其他緩沖液。所配制的組合物可以是塵劑或顆粒物質(zhì)形式，或者是在油(植物油或礦物油)中的懸液或者水或油/水乳液，或者作為可濕性粉劑，或者與適用于農(nóng)業(yè)應(yīng)用的任何其他載體物質(zhì)組合。術(shù)語“農(nóng)業(yè)上可接受的載體”涵蓋常規(guī)用于殺蟲劑配制技術(shù)中的所有佐劑、惰性組分、分散劑、表面活性劑、增粘劑、粘合劑等；這些是殺蟲劑配制領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的。制劑可以與一種或多種固體或液體佐劑混合，并且可以通過多種手段制備，例如通過使用常規(guī)配制技術(shù)將殺蟲組合物與合適佐劑均勻混合、摻和和/或研磨。合適的配制和應(yīng)用方法描述于通過引用并入本文的US專利N0.6，468，523中。 [0102]“害蟲”包括但不限于昆蟲、真菌、細(xì)菌、線蟲、螨、蜱等。昆蟲害蟲包括選自鞘翅目(Coleoptera)、雙翅目(Diptera)、膜翅目(Hymenoptera)、鱗翅目(Lepidopt era)、食毛目(Mallophaga)、同翅目(Homoptera)、半翅目(Hemiptera)、直翅目(Orthroptera)、綴翅目(Thysanoptera)、革翅目(Dermaptera)、等翅目(Loptera)、風(fēng)目(Anoplura)、蚤目(Siphonaptera)、毛翅目(Trichoptera)等，特別地選自鞘翅目、鱗翅目和雙翅目。
[0103]鞘翅目包括肉食亞目(Adephaga)和多食亞目(Polyphaga)。肉食亞目包括步甲總科(Caraboidea)和豉甲總科(Gyrinoidea)、而多食亞目包括水龜甲總科(Hydrophi1idea)λ 隱翅甲總科(Staphylinoidea)、花螢總科(Cantharoidea)、郭公甲總科(Cleroidea)、叩甲總科(Elateroidea)、花甲總科(Dascilloidea)、泥甲總科(Dryopoidea)、丸甲總科(Byrrhoidea)、扁甲總科(Cucujoidea)、芫菁總科(Meloidea)、花蚤總科(Mordel1idea)、擬步甲總科(Tenebrionoidea)、長(zhǎng)蠹總科(Bostrichoidea)、金龜總科(Scarabaeoidea)、天牛總科(Cerambycoidea)、葉甲總科(Chrysomeloidea)和象甲總科(Curculionoidea)。步甲總科包括虎甲科(CicindeIidae)、步甲科(Carabidae)和龍風(fēng)科(Dytiscidae)。豉甲總科包括豉甲科(Gyrinidae)。水龜甲總科包括水龜甲科(Hydrophilidae)0隱翅甲總科包括葬甲科(Silphidae)和隱翅甲科(Staphylinidae)?；ㄎ灴偪瓢ɑㄎ灴?Cantharidae)和螢科(Lampyridae)?郭公甲總科包括郭公甲科(Cleridae)和皮蠹科(Dermestidae)。叩甲總科包括叩甲科(Elateridae)和吉丁甲科(Buprestidae)?扁甲總科包括瓢甲科(CoccinelIidae)?芫菁總科包括芫箐科(Meloidae)。擬步甲總科包括擬步甲科(Tenebrionidae)。金龜總科包括黑螺科(Passalidae)和金龜科(Scarabaeidae)。天?？偪瓢ㄌ炫？?Cerambycidae)。葉甲總科包括葉甲科(Chrysomelidae)。象甲總科包括象甲科(Curculionidae)和小蠹科(Scolytidae)0
[0104]雙翅目包括亞目長(zhǎng)角亞目(Nematocera)、短角亞目(Brachycera)和環(huán)裂亞目(Cyclorrhapha)。長(zhǎng)角亞目(Nematocera)包括大蚊科(Tipulidae)、毛螺科(Psychodidae)、蚊科(Culicidae)、螺科(Ceratopogonidae)、搖蚊科(Chironomidae)、蚋科(Simuliidae)、毛蚊科(Bibionidae)和癭蚊科(Cecidomyiidae)。短角亞目包括水蛇科(Stratiomyidae)、蛇科(Tabanidae)、劍蛇科((Therevidae)、食蟲蛇科(Asilidae)、擬蜂蛇科(Mydidae)、蜂蛇科(Bombyliidae)和長(zhǎng)足蛇科(Dolichopodidae)。環(huán)裂亞目(Cyclorrhapha)包括無縫組(Aschiza)和有縫組。無縫組包括科蚤蠅科(Phoridae)、食蟲牙蠅科(Syrphidae)和眼蠅科(Conopidae)。有縫組包括無辧類(Acalyptratae)和有辧類(Calyptratae)?無辧類包括斑蠅科(Otitidae)、實(shí)蠅科(Tephritidae)、潛蠅科(Agromyzidae)和果蠅科(Drosophi I idae)。有辧類包括科風(fēng)蠅科(Hippoboscidae )、狂蠅科(Oestridae)、寄妮科(Tachinidae)、花妮科(Anthomyiidae)、妮科(Muscidae)、M 妮科(Calliphoridae)和麻妮科(Sarcophagidae)0
[0105]鱗翅目包括鳳蝶科(PapiIionidae)、粉蝶科(Pieridae)、灰蝶科(Lycaenidae)、蛺蝶科(Nymphalidae)、斑蝶科(Danaidae)、眼蝶科(Satyridae)、弄蝶科(Hesperiidae)、天蛾科(Sphingidae)、大香蛾科(Saturniidae)、尺蛾科(Geometridae)、燈蛾科(Arctiidae)、夜蛾科(Noctuidae)、毒蛾科(Lymantriidae)、透翅蛾科(Sesiidae)和谷蛾科(Tineidaee)0
[0106]對(duì)于主要作物的本發(fā)明昆蟲害蟲包括:玉米:玉米螟，歐洲玉米鉆心蟲(Europeancorn borer);小地老虎(Agrotis ipsilon)，黑地蠶(black cutworm);谷實(shí)夜蛾，美洲棉鈴蟲(corn earworm);草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)，秋夜蛾(fall army worm);西南玉米桿草螟(Diatraea grandiosella)，西南玉米鉆心蟲(southwestern corn borer)；南美玉米苗斑螟(Elasmopalpus Iignosellus),小玉米莖鉆心蟲(lesser cornstalkborer)；小鹿螟(Diatraea saccharalis)，甘鹿鉆心蟲(surgarcane borer);玉米根葉甲(Diabrotica virgifer a)，西方玉米根蟲(western corn rootworm);長(zhǎng)角葉甲巴氏亞種(Diabrotica longicornis barberi)，北方玉米根蟲(northern corn rootworm)；黃瓜十一星葉甲食根亞種(Diabrotica undecimpunctata howardi )，南方玉米根蟲(southern corn rootworm);紋路叩甲屬(Melanotus spp.)，鐵線蟲(wireworms);圓頭犀金龜(Cyclocephala borealis)，圓頭獨(dú)角仙(擠贈(zèng))(northern masked chafer (whitegrub));圓頭無斑犀金龜(Cyclocephala immaculata)，南方圓頭犀金龜(擠贈(zèng))(southernmasked chafer (white grub))；日本金龜(Popillia japontca)，日本甲蟲(Japanesebeetle);玉米銅色跳甲(Chaetocnema pulicaria)，玉米跳甲(corn flea beetle);玉米谷_ 甲(Sphenophorus maidis)，玉米谷象(maize billbug);玉米纟益管姆(Rhopalosiphummaidis)，玉米蟲牙(corn leaf aphid);玉米根蟲牙(Anuraphis maidiradicis，corn rootaphid);美洲谷長(zhǎng)鋳(Blissus leucopterus leucopterus)，麥風(fēng)(chinch bug);赤腿黑蟲皇(Melanoplus femurrubrum),赤腿蚱猛(redlegged grasshopper);血黑幢(Melanoplussanguinipes)，遷徙蚱由孟(migratory grasshopper);玉米種也黽(Hylemya pIatura)，玉米種蛆(seedcorn maggot);美洲黍潛葉妮(Agromyza parvicornis)，玉米斑潛葉妮(cornblot leafminer);玉米黃呆薊馬(Anaphothrips obscrurus)，草薊馬(grass thrips)；竊葉蟻(Solenopsis milesta)，竊蟻(thief ant) ； 二斑葉螨(Tetranychus urticae),二點(diǎn)葉螨(twospotted spider mite):高梁:玉米禾螟(Chilo part el Ius )，高梁鉆心蟲(sOTghum borer);草地夜蛾，秋夜蛾；谷實(shí)夜蛾，美洲棉鈴蟲；南美玉米苗斑螟，小玉米莖鉆心蟲；粒膚地老虎(Feltia subterranea),顆粒地老虎(granulate cutworm)；Phyllophaga crinita，擠贈(zèng)；偽金針蟲屬(Eleodes)、叩頭蟲屬(Conoderus)和 Aeolus 屬，鐵線蟲；黑甲負(fù)泥蟲(Oulema melanopus)，谷類植物跳甲(cereal leaf beetle);玉米銅色跳甲，玉米跳甲；玉米谷喙甲、玉米谷象；玉米縊管蚜；蔗黃偽毛蚜(Sipha flava)，甘蔗黃蟲牙(yellow sugarcane aphid);美洲谷長(zhǎng)蟲舂(Blissus leucopterus leucopterus)，麥風(fēng)；高梁瘦蚊(Contarinia sorghicola)，高梁螺(sorghum midge);朱砂葉螨(Tetranychuscinnabarinus),棉紅蜘蛛(carmine spider mite) ； 二斑葉螨、二點(diǎn)葉螨:小麥:美洲一星粘蟲(Pseudaletia unipunctata)，行軍蟲(army worm);草地夜蛾，秋夜蛾；南美玉米苗斑螟(Elasmopalpus Iignosellus),小玉米莖鉆心蟲；西方灰地老虎(Agrotisorthogonia)，西部切根蟲(western cutworm);南美玉米苗斑螟，小玉米莖鉆心蟲；黑甲負(fù)泥蟲，禾谷跳甲；三葉草葉象(Hypera punctata)，車軸草葉象甲(clover leaf weevil)；黃瓜十一星葉甲食根亞種，南方玉米根蟲；俄羅斯麥姆(Russian wheat aphid);麥二叉蟲牙(Schizaphis graminum)，綠蟲(greenbug);麥長(zhǎng)管蟲牙(Macrosiphum avenae)，英國(guó)禾谷蟲牙(English grain aphid);赤腿黑幢，赤腿蚱猛；殊種黑幢，殊種蚱猛；血黑幢，迀徙蚱猛；小麥?zhǔn)菸?Mayetiola destructor)，黑森瘦蚊(hessian fly);麥紅吸衆(zhòng)蟲(Sitodiplosismosellana)，麥螺(wheat midge);美洲麥桿妮(Meromyza americana),美洲麥桿黃潛妮(wheat stem maggot);麥疫種妮(Hylemya coarctata)，麥種妮(wheat bulb fly);煙褐花薊馬(Frankliniella fusca)，煙草薊馬(tobacco thrips);莖鋸蜂(Cephus cinctus)，麥莖蜂(wheat stem sawfly);郁金香瘤瘦螨(Aceria tulipae)，麥癭螨(wheat curl mite)；向日葵:向日葵芽卷葉蛾(Suleima helianthana)，向日葵芽蛾(sunflower bud moth)；向日葵斑螟(Homoeosoma electellum)，美洲向日葵螟(sunflower moth);向日葵葉甲(zygogramma exclamationis, sunflower beetle);古月蘿卜金龜(Bothyrus gibbosus)，胡蘿卜甲蟲(carrot beetle);向日葵桿瘦蚊(Neolasioptera murtfeldtiana)，向日葵籽蠓(sunflower seed midge):棉屬棺物:煙概夜蛾(Heliothis virescens)，棉卷葉蛾(cotton budworm);谷實(shí)夜蛾，美洲棉鈴蟲(cotton bollworm);甜菜夜蛾(spodopteraexigua)，甜菜粘蟲(beet army worm);紅鈴麥蛾(Pectinophora gossypiella)，棉紅鈴蟲(pink bollworm);墨西哥棉鈴象(Anthonomus grandis)，棉鈴象甲(boll weevil);棉蟲牙(Aphis gossypii)，棉花姆 蟲(cotton aphid);棉跳盲鋳(Pseudatomoscelis seriatus),棉花跳盲鋳(cotton fIeahopper);結(jié)翅粉風(fēng)(Trialeurodes abuti1nea)，帶狀翅白粉風(fēng)(bandedwinged whitefly);美國(guó)牧草盲鋳(Lygus lineolaris)，牧草盲鋳tarnished plantbug);赤腿黑幢，赤腿蚱猛；殊種黑幢，殊種蚱猛；棉薊馬(Thrips tabaci)，洋蔥薊馬(onionthrips);煙褐花薊馬，草薊馬；朱砂葉螨，棉紅蜘蛛；二斑葉螨，二點(diǎn)葉螨；歷:小蔗螟，甘鹿鉆心蟲；草地夜蛾，秋夜蛾；谷實(shí)夜蛾，美洲棉鈴蟲；葡萄鞘葉甲(Colaspis brunnea,grape colaspis);稻水象甲(Lissorhoptrus oryzophilus, rice water weevil);米象(Sitophilus oryzae, rice weevil);黑尾葉蜂(Nephotettix nigropictus)，稻葉蜂(riceleafhopper);美洲谷長(zhǎng)鋳，麥風(fēng)；喜綠鋳(Acrosternum hilare，green stink bug):大豆:大豆夜蛾(Pseudoplusia includens),大豆尺蠖(soybean looper);梨豆夜蛾(Anticarsiagemmatalis)，梨豆毛蟲(velvetbean caterpillar)；苜猜綠夜蛾(Plathypena scabra，green cloverworm);玉米螟，歐洲玉米鉆心蟲；小地老虎，黑地蠶；甜菜夜蛾，甜菜粘蟲；煙蟲牙夜蛾，棉卷葉蛾；谷實(shí)夜蛾，美洲棉鈴蟲；墨西哥豆瓢蟲(Epilachna varivestis,Mexicanbean beetle);桃姆(Myzus persicae, green peach aphid);香豆微葉蝶(Empoascafabae),馬鈴薯葉蝶(potato leafhopper);喜綠疇(Acrosternum hilare),綠臭疇(greenstink bug);赤腿黑蝗，赤腿蚱蜢；殊種黑蝗，殊種蚱蜢；玉米種蠅，玉米種蛆；大豆薊馬(Sericothrips variabilis, soybean thrips);棉薊馬，洋蔥薊馬；土耳其斯坦葉螨(Tetranychus turkestani, strawberry spider mite):二斑葉蟲菌，二點(diǎn)葉蟲菌:大壽:玉米螟，歐洲玉米鉆心蟲；小地老虎，黑地蠶；麥二叉蚜，綠蟲；美洲谷長(zhǎng)蝽，麥?zhǔn)?；喜綠蝽，綠臭蝽；褐臭椿(Fuschistus servus, brown stink bug);玉米種蜆,玉米種蛆；小麥癭蚊，黑森瘦蚊；麥巖螨(Petrobia latens,brown wheat mite):油好油菜:甘藍(lán)短棒概(Brevicorynebrassicae),甘藍(lán)姆(cabbage aphid);十字花科跳甲(Phyllotreta cruciferae, Fleabeetle);宿帶夜蛾(Mamestra configurata, Bertha armyworm);小菜蛾(Diamond-backmoth);地種蜆屬某些物種(Delia ssp.),根蛆(Root maggots)。[0107]線蟲包括寄生性線蟲如根結(jié)線蟲、胞囊線蟲和根腐線蟲，包括胞囊線蟲屬(Heterodera)某些物種、根結(jié)線蟲屬(Meloidogyne)某些物種和球胞囊屬(Globodera)某些物種；特別地是胞囊線蟲成員，包括但不限于Heterodera glycines (大豆胞囊線蟲)；Heterodera schachtii (甜菜胞囊線蟲)；Heterodera avenae (谷類胞囊線蟲)；和馬鈴薯金線蟲(Globodera rostochiensis)和馬鈴薯白線蟲(Globodera pailiaa)(馬鈴薯胞囊線蟲)。根腐線蟲包括短體屬(Pratylenchus)某些物種。[0108]用于增加植物產(chǎn)暈的方法[0109]提供了用于增加植物產(chǎn)量的方法。所述方法包括提供表達(dá)多肽的植物或植物細(xì)胞，所述多肽編碼本文中公開的殺蟲多肽序列的多聚核苷酸，以及在被害蟲侵襲的田間使該植物或其種子生長(zhǎng)，其中所述多肽對(duì)所述害蟲具有殺蟲活性。在一些實(shí)施方案中，所述多肽對(duì)鱗翅目、鞘翅目、雙翅目、半翅目或線蟲類害蟲具有殺蟲活性，并且所述田間被鱗翅目、半翅目、鞘翅目、雙翅目或線蟲類害蟲侵襲。如本文中所定義，植物的“產(chǎn)量”指由植物產(chǎn)生的生物質(zhì)的質(zhì)量和/或數(shù)量?！吧镔|(zhì)”意指任何被測(cè)量的植物產(chǎn)物。生物質(zhì)產(chǎn)生的增加是被測(cè)量植物產(chǎn)物的產(chǎn)量上的任意改善。增加植物產(chǎn)量具有幾項(xiàng)商業(yè)應(yīng)用。例如，增加植物葉片生物質(zhì)可以增加用于人或動(dòng)物消費(fèi)的葉菜類的產(chǎn)量。另外，增加葉片生物質(zhì)可以用于增加植物衍生的藥用或工業(yè)產(chǎn)物的生產(chǎn)。產(chǎn)量的增加可以包含任何統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的增加，包括但不限于與不表達(dá)殺蟲序列的植物相比，產(chǎn)量增加至少1%、增加至少3%、增加至少5%、增加至少10%、增加至少20%、增加至少30%、至少50%、至少70%、至少100%或更多。在具體的方法中，植物產(chǎn)量由于表達(dá)本文中所公開殺蟲蛋白的植物對(duì)害蟲的抗性增強(qiáng)而增加。殺蟲蛋白的表達(dá)導(dǎo)致害蟲侵襲或采食植物的能力降低。[0110]還可以用一種或多種化學(xué)組合物對(duì)植物進(jìn)行處理，所述的化學(xué)組合物包括一種或多種除草劑、殺蟲劑或殺真菌劑。示例性化學(xué)組合物包括:水果/蔬菜除草劑:莠去津(Atrazine)、除草定(Bromacil )、敵草隆(Diuron)、草甘膦(Glyphosate)、利谷隆(Linuron)> 嗪草酮(Metribuzin)、西瑪津(Simazine)、氟樂靈(Trifluralin)、吡氟禾草靈(Fluaz if op)、草銨勝(Glufos inate)、氯吡嘧石黃隆(Halosulfuron Gowan )、百草枯(Paraquat)、炔草胺(Propyzamide)、稀禾定(Sethoxydim)、氟丙嘧草酯(ButafenaciI)、氯批11密磺隆、Indaziflam:水果/蔬菜殺蟲齊1丨:涕滅威(Aldicarb)、蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuriengiensis)、甲萘威(Carbaryl)、克百威(Carbofuran)、毒死蝶(Chlorpyrifos)、氯氰菊酯(Cypermethrin)、溴氰菊酯(Deltamethrin)、阿維菌素(Abamectin)、氟氯氰菊酯 /β -氟氯氰菊酯(Cyfluthrin/ β -Cyf luthrin)、順式氰戊菊酯(Esfenvalerate)、高三氟氯氰菊酯(入-cyhalothrin)、滅螨酉昆(Acequinocyl )、聯(lián)苯肼酯(Bifenazate)、甲氧蟲酸餅(Methoxyfenoz ide)、雙苯氟服(Novaluron )、環(huán)蟲酸餅(Chromafenoz ide)、P塞蟲啉(Thiacloprid)、呋蟲胺(Dinotefuran)、啼螨酯(Fluacrypyrim)、螺螨酯(Spirodiclofen)、Y -氯氟氰菊酯(Gama-cyhalothrin)、螺甲螨酯(Spiromesifen)、艾克敵(Spinosad)、氯蟲苯甲酰胺(Rynaxypyr)、溴氰蟲酰胺(Cyazypyr)、殺鈴脲(Triflumuron)、螺蟲乙酯(Spirotetramat)、吡蟲啉(Imidacloprid)、氟蟲雙酰胺(Flubendiamide)、硫雙威(Thiodicarb)、氰氟蟲腙(Metaflumizone)、氟卩定蟲胺腈(Sulfoxaflor)、丁氟螨酯(Cyflumetofen)、Cyanopyrafen、可尼丁(Clothianidin)、噻蟲嗪(Thiamethoxam)、Spinotoram、硫雙威、氟唳蟲酸胺(Flonicamid)、甲硫威(Methiocarb)、氨基阿維菌素苯甲酸鹽(Emamectin-benzoate)、惡二唑蟲(Indoxacarb)Λ Fozthiazate、苯線磷(Fenamiphos)、吡丙醚(Pyriproxifen)、苯丁錫(Fenbutatin-oxid):水果 / 蔬菜殺真菌劑:唑啼菌胺(Ametoctradin)、啼菌酯(Azoxystrobin)、苯噻菌胺(Benthiavalicarb)、P定酉先菌胺(Boscalid)、克菌丹(Captan)、多菌靈(Carbendazim)、百菌清(Chlorothalonil )、含銅殺菌劑(Copper)、氰霜唑(Cyazofamid)、環(huán)氟菌胺(Cyflufenamid)、霜脲氰(Cymoxanil )、環(huán)丙唑醇(Cyproconazole)、啼菌環(huán)胺(Cyprodinil )、苯醚甲環(huán)唑(Difenoconazole)、烯酸嗎啉(Dimetomorph)、臆菌萘(Dithianon)、咪唑菌酮(Fenamidone)、環(huán)酸菌胺(Fenhexamid)、氟卩定胺(Fluazinam)、咯菌臆(Fludioxonil)、氟批菌胺(Fluopicolide)、氟吡菌酰胺(Fluopyram)、氟啼菌酯(Fluoxastrobin)、氟唑菌酰胺(Fluxapyroxad)、滅菌丹(Folpet )、福賽得(Fosetyl )、異菌脲(Iprodione)、丙森鋅(Iprovalicarb)、吡唑萘菌胺(Isopyrazam)、醚菌酯(Kresoxim-methyl )、代森猛鋅(Mancozeb)、雙塊酉先菌胺(Mandipropamid)、甲霜靈 / 精甲霜靈(Metalaxyl/mefenoxam)、代森聯(lián)(Metiram)、苯菌酮(Metrafenone)、臆菌唑(Myclobutanil )、戊菌唑(Penconazole)、批噻菌胺(Penthiopyrad)、卩定氧菌酯(Picoxystrobin)、霜霉威(Propamocarb)、戊唑醇(Propiconazole)、甲 代森鋒(Propineb)、碘喹唑酮(Proquinazid)、丙硫菌唑(Prothioconazole)λ 吡唑醚菌酯(Pyraclostrobin)、啼霉胺(Pyrimethanil)、苯氧喹啉(Quinoxyfen)、螺環(huán)菌胺(Spiroxamine)、硫橫(Sulphur)、戊唑醇(Tebuconazole)、甲基硫菌靈(Thiophanate-methyl)、勝菌酯(Trifloxystrobin):谷類棺物除草劑:2.4-D、酰啼磺隆(Amidosulfuron)λ 溴苯臆(Bromoxynil )、唑草酮-E (Carfentrazone-E)、氯麥隆(ChlorotoIuron)、氯橫隆(Chlorsulfuron)、塊草酸-P (Clodinafop-P)、二氯吡卩定酸(Clopyralid)、麥草畏(Dicamba)、禾草靈酸-M (Dielofop-Μ)、吡氟草胺(Diflufenican)、惡禾草靈(Fenoxaprop)、雙氟橫草胺(Florasulam)、氟酮橫隆-NA (Flucarbazone-NA)、氟噻草胺(Flufenacet)、氟 P定啼磺隆-M (Flupyrsulfuron-M)Λ 氟草煙(Fluroxypyr)、呋草酮(Flurtamone)、草甘膦、碘甲磺隆(1dosulfuron)、碘苯腈(1xynil )、異丙隆(Isoproturon)、MCPA、甲橫胺橫隆(Mesosulfuron)、甲橫隆(Metsulfuron)、二甲戊(Pendimethalin)、唑啉草酯(Pinoxaden)、丙苯橫隆(Propoxycarbazone)、節(jié)草丹(Prosulfocarb)、甲氧橫草胺(Pyroxsulam)、橫酉先橫隆(Sulfosulfuron)、噻橫隆(Thifensulfuron)、月虧草酮(Tralkoxydim)、醚苯橫隆(Triasulfuron)、苯橫隆(Tribenuron)、氟樂靈、三氟甲磺隆(Tritosulfuron):谷類棺物殺真菌齊1丨:嘧菌酯、聯(lián)苯吡菌胺(Bixafen)、啶酰菌胺、多菌靈、百菌清、環(huán)氟菌胺、環(huán)丙唑醇、嘧菌環(huán)胺、醚菌胺(Dimoxystrobin)、氟環(huán)唑(Epoxiconazole)、苯鎊卩定(Fenpropidin)、丁苯嗎啉(Fenpropimorph)、氟批菌酰胺、氟嘧菌酯、氟喹唑(Fluquinconazole )、氟唑菌酰胺、批唑萘菌胺、醚菌酯、葉菌唑(Metconazole )、苯菌酮、吡噻菌胺、唳氧菌酯、咪鮮胺(Prochloraz )、戊唑醇、碘喹唑酮、丙硫菌唑、吡唑醚菌酯、苯氧喹啉、螺環(huán)菌胺、戊唑醇、甲基硫菌靈、肟菌酯;谷類植物殺蟲劑:樂果(Dimethoate)、高三氟氯氰菊酯(λ -cyhalthrin)、溴氰菊酯、氯氰菊酯、氟氯氰菊酯、聯(lián)苯菊酯(Bifenthrin)、吡蟲啉、可尼丁、噻蟲嗪、噻蟲啉、唆蟲脈(Acetamiprid)、呋蟲胺(Dinetofuran)、Clorphyriphos、抗蟲牙威(Pirimicarb)、甲硫威、氟啶蟲胺腈;玉米除草劑:莠去津、甲草胺(Alachlor)、溴苯腈、乙草胺(Acetochlor)、麥草畏、二氯吡唳酸、二甲吩草胺((S_) Dimethenamid)、草銨膦、草甘膦、異惡唑草酮(Isoxaf Iutole)、精異丙甲草胺(S-Metolachlor)、甲基橫草酮(Mesotrione)、煙11密橫隆(Nicosulfuron)、氟嘧橫隆(Primisulfuron)、玉嘧橫隆(Rimsulfuron)、橫草酮(Sulcotrione)、甲酸胺石黃隆(Foramsulfuron)、苯吡唑草酮(Topramezone)、環(huán)橫酮(Tembotrione)、苯嘧橫草胺(Saf Iufenacil )、酮服橫草吩(Thiencarbazone)、氟噻草胺、Pyroxasulfon ;玉米殺蟲劑:克百威、毒死蝶、聯(lián)苯菊酯、溴氰蟲酰胺、氟蟲腈(Fipronil)、 批蟲啉、高三氟氯氰菊酯、七氟菊酯(16行111:!!!'；[11)、特丁硫磷(16『131^08)、噻蟲嗪、可尼丁、螺環(huán)菌胺、氟蟲雙酰胺、殺鈴脲、氯蟲苯甲酰胺、溴氰菊酯、硫雙威、氟氯氰菊酯、氯氰菊酯、聯(lián)苯菊酯、風(fēng)螨脲(Lufenuron)、丁基嘧唳磷(Tebupirimphos)、乙蟲腈(Ethiprole)、溴氰蟲酰胺、噻蟲啉、唳蟲脒、呋蟲胺、阿維菌素(AVermectiη);玉米殺真菌劑:喃菌酯、聯(lián)苯吡菌胺、啶酰菌胺、環(huán)丙唑醇、醚菌胺、氟環(huán)唑、種衣酯(Fenitropan)、氟吡菌酰胺、氟嘧菌酯、氟唑菌酰胺、吡唑萘菌胺、葉菌唑、吡噻菌胺、啶氧菌酯、戊唑醇、丙硫菌唑、吡唑醚菌酯、戍唑醇、廂菌酯:稻除草劑:丁草胺(Butachlor)、敵稗(Propanil)、四唑喃磺隆(Azimsulfuron)、節(jié)嘧橫隆(Bensulfuron)、氰氟草酯(Cyhalofop)、殺草隆(Daimuron)、四唑酸草胺(Fentrazamide)、咪唑橫隆(Imazosulfuron)、苯噻草胺(Mefenacet)、惡嗪草酮(Oxaziclomefone)、吡嘧石黃隆(Pyraz o sulfur on)、稗草畏(Pyribut icarb)、二氯喹啉酸(Quinclorac)、禾草丹(Thiobencarb)、卻草酮(Indanofan)>氟噻草胺、四唑酸草胺、氯吡喃磺隆、惡嗪草酮、雙環(huán)磺草酮(Benzobicyclon)、環(huán)酯草醚(Pyriftalid)、五氟磺草胺(Penoxsulam)、雙草醚(Bispyribac)、丙炔惡草酮(Oxadiargyl )、乙氧磺隆(Ethoxysulfuron)、丙草胺(Pretilachlor)、甲基橫草酮、Tefuryltrione、惡草酮(Oxadiazone)、惡唑禾草靈、Pyrimisulfan:稻殺蟲劑:地亞農(nóng)(Diazinon)、仲丁威(Fenobucarb)、丙硫克百威(Benfuracarb)、噻嗪酮(Buprofezin)、呋蟲胺(Dinotefnran)、氟蟲腈、吡蟲啉、異丙威(Isoprocarb)、噻蟲啉、環(huán)蟲酰肼、可尼丁、乙蟲腈、氟蟲雙酰胺、氯蟲苯甲酰胺、溴氰菊酯、唳蟲脒、噻蟲嗪、溴氰蟲酰胺、艾克敵、S P i η ο t ο r am、氨基阿維菌素苯甲酸鹽、氯氰菊酯、毒死蜱、醚菊酯(EtofenpiOx)、克百威、丙硫克百威、氟啶蟲胺腈;稻殺真菌劑:喃菌酯、多菌靈、環(huán)丙酰亞胺(Carpropamid)、雙氯氰菌胺(Diclocymet)、苯醚甲環(huán)唑、敵痕磷(Edifenphos)、嘧菌腙(Ferimzone)、慶大霉素(Gentamycin)、己唑醇(Hexaconazole)、惡霉靈(Hymexazol )、異稻痕凈(Iprobenfos, IBP)、稻痕靈(Isoprothiolane)、異噻菌胺(Isotianil )、春雷霉素(Kasugamycin)、代森猛鋒、苯氧菌.胺(Metominostrobin)> 月虧醚菌胺(Orysastrobin)、戍菌隆(Pencycuron)、烯丙苯噻唑(probenazole)、戍唑醇、甲代森鋅、咯喹酮(Pyroqui1n)、戍唑醇、甲基硫菌靈、噻酰菌胺(TiadiniI)、三環(huán)唑(Tricyclazole)、三氟唳磺隆、維利霉素(Validamycin):棉花除草劑:敵草隆、伏草隆(Fluometuron)、MSMA> 乙氧氟草醚(Oxyf luorfen)、撲草凈(Prometryn)、氟樂靈、唑草酮、烯草酮(Clethodim)、精批氟禾草靈(Fluazifop-butyl)、草甘膦、氟草敏(Norflurazon)、二甲戍、嘧草硫醚(Pyrithiobac-sodium)、三氟唳磺隆、吡喃草酮(Tepraloxydim)、草銨膦、丙炔氟草胺(Flumioxazin)、噻苯隆(Thidiazuron):棉花殺蟲逝:乙酰甲胺磷(Ac印hate)、涕滅威、毒死蝶、氯氰菊酯、溴氰菊酯、阿維菌素、唳蟲脒、甲胺基阿維菌素苯甲酸鹽(Emamectin Benzoate)、批蟲啉、惡二唑蟲、高三氟氯氰菊酯、艾克敵、硫雙威、Y-氯氟氰菊酯、螺甲螨酯、啶蟲丙醚(Pyridalyl)、氟啶蟲酰胺、氟蟲雙酰胺、殺鈴脲、氯蟲苯甲酰胺、氟氯氰菊酯、螺蟲乙酯、可尼丁、噻蟲嗪、噻蟲啉、呋蟲胺、氟蟲雙酰胺、溴氰蟲酰胺、艾克敵、Spinotoram、Y氯氟氰菊酯、4_[ [ (6-氯吡啶-3-基)甲基](2，2_ 二氟乙基)氨基]呋喃-2(5H)_酮、硫雙威、阿維菌素、氟啶蟲酰胺、啶蟲丙醚、螺甲螨酯、氟啶蟲胺腈；棉花殺真菌劑:嘧菌酯、聯(lián)苯吡菌胺、啶酰菌胺、多菌靈、百菌清、含銅殺菌劑、環(huán)丙唑醇、苯醚甲環(huán)唑、醚菌胺、氟環(huán)唑、咪唑菌酮、氟啶胺、氟吡菌酰胺、氟嘧菌酯、氟唑菌酰胺、異菌脲、吡唑萘菌胺、異噻菌胺、代森錳鋅、代森錳(Maneb )、苯氧菌胺、吡噻菌胺、唳氧菌酯、甲代森鋅、丙硫菌唑、批唑醚菌酯、五氯硝基苯(Quintozene)、戍唑醇、氟醚唑(Tetraconazole)、甲基硫菌靈、月虧菌酯:大豆除草齊Π:甲草胺、滅草松(Bentazone)、氟樂靈、氯嘧磺隆(Chlorimuron-Ethyl)、氯酯磺草胺(Cloransulam-Methyl)、惡唑禾草靈、氟磺胺草醚(Fomesafen)、批氟禾草靈、草甘膦、甲氧咪草煙(Imazamox)、咪唑喹啉酸(Imazaquin )、咪唑乙煙酸(Imazethapyr )、精異丙甲草胺、嗪草酮、二甲戍、吡喃草酮、草銨膦;大豆殺蟲劑:高三氟氯氰菊酯、滅多威(Methomyl)、吡蟲啉、可尼丁、噻蟲嗪、噻蟲啉、晾蟲脒、呋蟲胺、氟蟲雙酰胺、氯蟲苯甲酰胺、溴氰蟲酰胺、艾克敵、Spinotoram、氨基阿維菌素苯甲酸鹽、氟蟲腈、乙蟲腈、溴氰菊酯、氟氯氰菊酯、Y和λ氯氟氰菊酯、4-[[(6_氯吡啶-3-基)甲基](2，2-二氟乙基)氨基]呋喃-2 (5Η)-酮、螺蟲乙酯、Spinodiclofen、殺鈴脲、氟啶蟲酰胺、硫雙威、氟氯氰菊酯;大豆殺真菌劑:嘧菌酯、聯(lián)苯吡菌胺、啶酰菌胺、多菌靈、百菌清、含銅殺菌劑、環(huán)丙唑醇、苯醚甲環(huán)唑、醚菌胺、氟環(huán)唑、氟啶胺、氟吡菌酰胺、氟嘧菌酯、粉唑醇(Flutriafol)、氟唑菌酰胺、吡唑萘菌胺、異菌脲、異噻菌胺、代森錳鋅、代森錳、葉菌唑、苯氧菌胺、腈菌唑、吡噻菌胺、啶氧菌酯、戊唑醇、甲代森鋅、丙硫菌唑、批唑醚菌酯、戍唑醇、氟醚唑、甲基硫菌靈、廂菌酯;甜菜除草劑:氯草敏(Chloridazon)、雙苯胺靈(Desmedipham)、乙氧呋草黃(Ethofumesate)、甲雙苯胺靈(Phenmedipham)、野麥畏(Triallate)、二氯吡啶酸、吡氟禾草靈、環(huán)草定(LenaciI)、苯嗪草酮(Metamitron)、氯甲喹啉酸(Quinmerac)、噻草酮(Cycloxydim)、氟胺橫隆(Trif Iusulfuron)、吡喃草酮、喹禾靈(Quizalofop);甜菜殺蟲劑:批蟲啉、可尼丁、噻蟲嗪、噻蟲啉、唳蟲脒、呋蟲胺、溴氰菊酯、β -氟氯氰菊酯、Y / λ氯氟氰菊酯、4-[ [ (6-氯吡卩定-3-基)甲基](2,2- 二氟乙基)氨基]呋喃-2(5Η)_酮、七氟菊酯、氯蟲苯甲酰胺、Cyaxypyr、氟蟲腈、克百威;卡諾拉油菜除草劑:二氯吡啶酸、禾草靈酸、批氟禾草靈、草銨膦、草甘膦、批唑草胺(Metazachlor )、氟樂靈、胺苯磺隆(EthaMetsulfuron)、氯甲喹啉酸、喹禾靈、烯草酮、批喃草酮:卡諾拉油菜殺真菌逝:嘧菌酯、聯(lián)苯吡菌胺、啶酰菌胺、多菌靈、環(huán)丙唑醇、嘧菌環(huán)胺、醚菌胺、氟環(huán)唑、氟啶胺、氟吡菌酰胺、氟嘧菌酯、氟硅唑(Flusilazole)、氟唑菌酰胺、異菌脲、吡唑萘菌胺、縮節(jié)胺(Mepiquat-chloride)、葉菌唑、苯氧菌胺、多效唑(Paclobutrazole )、吡噻菌胺、卩定氧菌酯、咪鮮胺、丙硫菌唑、吡唑醚菌酯、戍唑醇、甲基硫菌靈、I虧菌酯、乙烯菌核利(Vinclozolin)；卡諾拉油菜殺蟲劑:克百威、噻蟲啉、溴氰菊酯、吡蟲啉、可尼丁、噻蟲嗪、啶蟲脒、呋蟲胺、氟氯氰菊酯、Y和入氯氟氰菊酯、τ-氟胺氰菊酯(Fluvaleriate)、乙蟲腈、艾克敵、Spinotoram、氟蟲雙酰胺、氯蟲苯甲酰胺、溴氰蟲酰胺、4_[[(6_氯吡卩定-3-基)甲基](2,2- 二氟乙基)氨基]呋喃-2 (5H)-酮。
[0111]以下實(shí)施例以說明方式且不以限制方式提供。
實(shí)施例
[0112]實(shí)施例1.Axmi115融合蛋白的設(shè)計(jì)和測(cè)試
[0113]Axmill5描述于美國(guó)專利公開20100004176中(氨基酸序列在本文中如SEQ IDN0:43所示)。該基因與Vip3Aa享有70%的序列同源性。Axmill5的經(jīng)密碼子優(yōu)化形式(在本文中也被稱為Axmill5v01，SEQ ID NO:42中所示)利用大腸桿菌表達(dá)載體進(jìn)行克隆和表達(dá)。所產(chǎn)生的蛋白在體外生物測(cè)定中顯示對(duì)多種昆蟲害蟲具有殺蟲活性，包括歐洲玉米螟蟲(ECB)、螟蛉(CEW)、秋天行軍蟲(FAW)和小地老虎(BCW)。
[0114]Axmi005也描述于美國(guó)專利公開20100004176中。該基因與Vip3Aa享有94%的序列同源性。Axmi005的經(jīng)密碼子優(yōu)化形式(optAxmi005,在本文中如SEQ ID N0:44所示)利用大腸桿菌表達(dá)載體進(jìn)行克隆和表達(dá)。所產(chǎn)生的蛋白在體外生物測(cè)定中顯示對(duì)多種昆蟲害蟲具有殺蟲活性，包括谷實(shí)夜蛾(Hz)、煙芽夜蛾(Hv)、FAW、BCW、甘蔗螟蟲(SCB)和梨豆毛蟲(VBC)
[0115]與Axmi005相比，Axmill5對(duì)Hz和FAW的相對(duì)活性較低。而且如上面所指出，Axmi005不具有ECB活性。在鑒定負(fù)責(zé)差異特異性以及兩種蛋白活性的結(jié)構(gòu)域的嘗試中，如下面所描述制備表達(dá)optAxmi005和Axmi 115經(jīng)密碼子優(yōu)化形式的融合體的構(gòu)建體,并圖示于圖1中。在大腸桿菌中表達(dá)蛋白，并在體外生物測(cè)定中針對(duì)EBC、Hz、FAW和BCW進(jìn)行測(cè)試。當(dāng)與由PAX5477 (Axmill5v01，在本文中如SEQ ID N0:42所示)所表達(dá)的蛋白相比時(shí)，由pAX6307 (Axmill5v02.01，在本文中如SEQ ID NO:1所示)所表達(dá)的蛋白對(duì)被測(cè)的所有四種害蟲顯示出增強(qiáng)的活性。
[0116]將pAX6307中表達(dá)的基因(Axmill5v02.01)克隆入由甘蔗泛素啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)蛋白表達(dá)的植物表達(dá)載體PAG6141中。
[0117]對(duì)來自表達(dá)Axmill5v0UPAxmill5v02.01的轉(zhuǎn)基因植物的葉片樣品進(jìn)行測(cè)試，其中在實(shí)驗(yàn)室昆蟲生物測(cè)定中針對(duì)EBC、Hz、FAff和BCW，在田間測(cè)試中針對(duì)EBC、Hz和FAW。結(jié)果顯示經(jīng)改良的Axmill5V02.01對(duì)所有被測(cè)害蟲具有較好的效力。
[0118]質(zhì)粒說明:
[0119]對(duì)來源于Vip3Aa、Axmi005、Axmill5v01、Axmi 163 和 Axmil84DNA 序列的娃片(insilico)翻譯的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，以鑒定所有同源物中的保守性氨基酸(Axmil63和Axmi 184也描述于美國(guó)專利公開20100004176中)。
[0120]利用pAX5478 (含 有Axmi005的經(jīng)密碼子優(yōu)化形式，SEQ ID NO: 44中所示)中存在的optAxmi005序列和pAX5477 (含有Axmi115的經(jīng)密碼子優(yōu)化形式)中存在的optAxmill5序列，針對(duì)Axmi005和Axmill5v01的3個(gè)保守區(qū)設(shè)計(jì)引物。通過重疊PCR產(chǎn)生3種融合基因(參見圖1)。
[0121]將這些PCR反應(yīng)產(chǎn)生的融合基因的DNA克隆入大腸桿菌表達(dá)載體pRSf IB中。所得表達(dá)載體顯示于表1中。利用已知方法表達(dá)蛋白，并在體外生物測(cè)定中對(duì)大腸桿菌提取物進(jìn)行測(cè)試。
[0122]表1.融合基因構(gòu)建體
【權(quán)利要求】
1.一種重組核酸分子，其包含編碼具有殺蟲活性的融合多肽的核苷酸序列，其中所述融合多肽包含SEQ ID NO:43的C末端部分。
2.權(quán)利要求1的重組核酸分子，其中所述C末端部分與SEQID N0:43的約第174位氨基酸至約第803位氨基酸或者其變體或片段相對(duì)應(yīng)。
3.權(quán)利要求1或2的重組核酸分子，其中所述融合多肽包含SEQID NO:45的N末端部分。
4.權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)的重組核酸分子，其中所述N末端部分與SEQID NO:43的約第174位氨基酸至約第803位氨基酸或者其變體或片段相對(duì)應(yīng)。
5.權(quán)利要求1、2、3或4的重組核酸分子，其中所述核苷酸序列選自由以下組成的組: a)SEQ ID NO: 47 1_14任一項(xiàng)所示的核苷酸序列； b)編碼包含SEQID N0:48和15-31任一項(xiàng)所示氨基酸序列的多肽的核苷酸序列； c)編碼包含與SEQID NO: 48和15-31任一項(xiàng)所示氨基酸序列具有至少95%序列一致性的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列，其中融合多肽的殺蟲活性相對(duì)于SEQ ID NO:43或45的殺蟲活性增強(qiáng)或擴(kuò)大。
6.權(quán)利要求1、2、3、4或5的重組核酸分子，其中所述核苷酸序列是已經(jīng)設(shè)計(jì)用于在植物中表達(dá)的合成序列。
7.權(quán)利要求1、2、3、4、5或6的重組核酸分子，其中所述核苷酸序列與能夠指導(dǎo)所述核苷酸序列在植物細(xì)胞中表達(dá)的啟動(dòng)子可操作性連接。
8.包含權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)的重組核酸分子的載體。
9.權(quán)利要求8的載體，其進(jìn)一步包含編碼異源多肽的核酸分子。
10.含有權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)的重組核酸或者權(quán)利要求8或9的載體的宿主細(xì)胞。
11.權(quán)利要求10的宿主細(xì)胞，其是細(xì)菌宿主細(xì)胞。
12.權(quán)利要求10的宿主細(xì)胞，其是植物細(xì)胞。
13.包含權(quán)利要求12的宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因植株。
14.權(quán)利要求13的轉(zhuǎn)基因植株，其中所述植株選自由玉米、高梁、小麥、甘藍(lán)、向日葵、番茄、十字花科植物、胡椒屬植物、馬鈴薯、棉花、稻、大豆、甜菜、甘蔗、煙草、大麥和油籽油菜組成的組。
15.包含權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)的重組核酸分子或者權(quán)利要求8或9的載體的轉(zhuǎn)基因種子。
16.具有殺蟲活性的重組多肽，其中所述多肽包含SEQID NO:43的C末端部分。
17.權(quán)利要求16的重組多肽，其中所述C末端部分與SEQID NO: 43的約第174位氨基酸至約第803位氨基酸或者其變體或片段相對(duì)應(yīng)。
18.權(quán)利要求16或17的重組多肽，其中所述多肽包含SEQID NO:45的N末端部分。
19.權(quán)利要求16-18任一項(xiàng)的重組多肽，其中所述N末端部分與SEQID NO:43的約第174位氨基酸至約第803位氨基酸或者其變體或片段相對(duì)應(yīng)。
20.權(quán)利要求16、17、18或19的重組多肽，其中所述多肽包含選自由以下組成的組中的氨基酸序列: a)SEQ ID NO: 48和15-31任一項(xiàng)的氨基酸序列； b)與SEQ ID NO: 48和15-31任一項(xiàng)的氨基酸序列具有至少95%序列一致性的氨基酸序列，其中多肽的殺蟲活性相對(duì)于SEQ ID N0:43或45的殺蟲活性增強(qiáng)或擴(kuò)大。
21.權(quán)利要求16-20任一項(xiàng)的多肽，其進(jìn)一步包含編碼異源氨基酸序列。
22.包含權(quán)利要求16-21任一項(xiàng)的多肽的組合物。
23.權(quán)利要求22的組合物，其中所述組合物選自由粉劑、塵劑、丸劑、粒劑、噴霧劑、乳劑、膠體、溶液組成的組。
24.權(quán)利要求22的組合物，其中所述組合物通過對(duì)細(xì)菌細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)行干燥、凍干、勻質(zhì)化、提取、過濾、離心、沉淀或濃縮而制備。
25.權(quán)利要求22的組合物，其包含重量為約1%至約99%的所述多肽。
26.一種用于控制鱗翅目、半翅目、鞘翅目、線蟲類或雙翅目害蟲的方法，其包括使所述群體與殺蟲有效量的權(quán)利要求16-22任一項(xiàng)的多肽或者權(quán)利要求23、24或25的組合物接觸。
27.一種用于殺死鱗翅目、半翅目、鞘翅目、線蟲類或雙翅目害蟲的方法，其包括使所述害蟲接觸或者對(duì)所述害蟲飼喂殺蟲有效量的權(quán)利要求16-22任一項(xiàng)的多肽或者權(quán)利要求23、24或25的組合物。
28.一種用于產(chǎn)生具有殺蟲活性的多肽的方法，其包括在編碼多肽的核酸分子表達(dá)的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求10的宿主細(xì)胞。
29.基因組中穩(wěn)定整合了包含核酸分子的DNA構(gòu)建體的植株，所述核酸分子包含編碼具有殺蟲活性的融合多肽的核苷酸序列，其中所述融合多肽包含SEQ ID NO:43的C末端部分。`
30.權(quán)利要求29的植株，其中所述C末端部分與SEQID NO:43的約第174位氨基酸至約第803位氨基酸或者其變體或片段相對(duì)應(yīng)。
31.權(quán)利要求29或30的植株，其中所述融合多肽包含SEQID NO: 45的N末端部分。
32.權(quán)利要求29-31任一項(xiàng)的植株，其中所述N末端部分與SEQID NO:43的約第174位氨基酸至約第803位氨基酸或者其變體或片段相對(duì)應(yīng)。
33.權(quán)利要求29-32任一項(xiàng)的植株，其中所述核苷酸序列選自由以下組成的組: a)SEQ ID NO: 47 1_14任一項(xiàng)所示的核苷酸序列； b)編碼包含SEQID NO:48和15-31任一項(xiàng)所示氨基酸序列的多肽的核苷酸序列； c)編碼包含與SEQID NO: 48和15-31任一項(xiàng)所示氨基酸序列具有至少95%序列一致性的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列，其中融合多肽的殺蟲活性相對(duì)于SEQ ID NO:43或45的殺蟲活性增強(qiáng)或擴(kuò)大。
34.權(quán)利要求29-33任一項(xiàng)的植株，其中所述植株是植物細(xì)胞。
35.一種用于保護(hù)植株免受害蟲的方法，其包括在植株或其細(xì)胞中表達(dá)核酸分子，所述核酸分子包含編碼具有殺蟲活性的融合多肽的核苷酸序列，其中所述多肽包含SEQ IDNO:43的C末端部分。
36.權(quán)利要求35的方法，其中所述C末端部分與SEQID NO:43的約第174位氨基酸至約第803位氨基酸或者其變體或片段相對(duì)應(yīng)。
37.權(quán)利要求35或36的方法，其中所述融合多肽包含SEQID NO: 45的N末端部分。
38.權(quán)利要求35-37任一項(xiàng)的方法，其中所述N末端部分與SEQID NO:43的約第174位氨基酸至約第803位氨基酸或者其變體或片段相對(duì)應(yīng)。
39.權(quán)利要求35-38任一項(xiàng)的方法，其中所述核苷酸序列選自由以下組成的組: a)SEQ ID NO: 47 1_14任一項(xiàng)所示的核苷酸序列； b)編碼包含SEQID NO:48和15-31任一項(xiàng)所示氨基酸序列的多肽的核苷酸序列； c)編碼包含與SEQID NO: 48和15-31任一項(xiàng)所示氨基酸序列具有至少95%序列一致性的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列，其中融合多肽的殺蟲活性相對(duì)于SEQ ID NO:43或45的殺蟲活性增強(qiáng)或擴(kuò)大。
40.權(quán)利要求35-39任一項(xiàng)的方法，其中所述植株產(chǎn)生對(duì)鱗翅目、半翅目、鞘翅目、線蟲類或雙翅目害蟲具有殺蟲活性的殺蟲多肽。
41.一種用于增加植株產(chǎn)量的方法,其包括在田間種植基因組中穩(wěn)定整合了包含核酸分子的DNA構(gòu)建體的植株或其種子，所述核酸分子包含編碼具有殺蟲活性的融合多肽的核苷酸序列，其中所述融合多肽包含SEQ ID NO:43的C末端部分。
42.權(quán)利要求41的方法，其中所述C末端部分與SEQID NO:43的約第174位氨基酸至約第803位氨基酸或者其變體或片段相對(duì)應(yīng)。
43.權(quán)利要求41或42的方法，其中所述融合多肽包含SEQID NO:45的N末端部分。
44.權(quán)利要求41-43任一項(xiàng)的方法，其中所述N末端部分與SEQID NO:43的約第174位氨基酸至約第803位氨基酸或者其變體或片段相對(duì)應(yīng)。
45.權(quán)利要求41-44任一項(xiàng)的方法，其中所述核苷酸序列選自由以下組成的組: a)SEQ ID NO: 47 1_14任一項(xiàng)所示的核苷酸序列； b)編碼包含SEQID NO:48和`15-31任一項(xiàng)所示氨基酸序列的多肽的核苷酸序列； c)編碼包含與SEQID NO: 48和15-31任一項(xiàng)所示氨基酸序列具有至少95%序列一致性的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列，其中融合多肽的殺蟲活性相對(duì)于SEQ ID NO:43或45的殺蟲活性增強(qiáng)或擴(kuò)大。
【文檔編號(hào)】C12N15/82GK103635579SQ201280027517
【公開日】2014年3月12日 申請(qǐng)日期:2012年4月4日 優(yōu)先權(quán)日:2011年4月5日
【發(fā)明者】D·萊特寧, N·M·德塞, V·海恩瑞奇斯 申請(qǐng)人:阿森尼克斯公司