專利名稱：一種木材中松材線蟲核酸快速提取裝置的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本實用新型屬于分子生物學技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種木材中松材線蟲核酸快速提
取裝置。
背景技術(shù)：
目前檢測松材線蟲方法主要有以下幾種:(I)形態(tài)學鑒別法:將疑似染有松材線蟲的木材用刀具劈開成小條狀，然后將條狀木材置于下部漏斗狀玻璃容器中，在玻璃器皿的下部漏斗出口處套一根橡皮管，在管上加一彈簧夾夾緊，在玻璃容器中加水使木條浸滿，靜止數(shù)天，使松材線蟲從木材中游離到水中并沉入到漏斗出口處，放開彈簧夾將底部含蟲的水放入玻璃皿內(nèi)，在顯微鏡下觀察，以形態(tài)學特征診斷松材線蟲。此法的最大缺點是，耗時長、效率低、形態(tài)學鑒別具有不確定性。在日本，Mamiya等早在1979年就提出了采用尾部的尾尖突來區(qū)分松材線蟲和擬松材線蟲，這也是目前兩種線蟲鑒別中的主要形態(tài)學依據(jù)。由于北美的松材線蟲有些群體中的雌蟲尾部也有尾尖突，因此從形態(tài)上要將兩者正確區(qū)分開來對一些非專業(yè)從事植物線蟲分類的人員是非常困難的。(2)酶測定法:谷氨酸草酰乙酸轉(zhuǎn)氨酶是可區(qū)分兩種線蟲的酶，松材線蟲分泌的纖維素酶的譜帶類型與擬松材線蟲的纖維素酶的不同，酯酶同功酶和蘋果酸脫氫酶譜，也可以區(qū)別松材線蟲和擬松材線蟲。由于酯酶的穩(wěn)定性并不好，同一株系在不同菌上培養(yǎng)后也有變化。這可能與酶本身易受外界環(huán)境條件如培養(yǎng)線蟲的條件(濕度和溫度等)、提取過程及提取物的貯藏條件、分析方法及線蟲本身即線蟲的各發(fā)育階段或在某一階段線蟲的生理狀況的影響有關(guān)。因此，酶雖然在密切相關(guān)的種類間保持著高度保守性，但由于上述因素，利用電泳分析線蟲蛋白易導致結(jié)果的不穩(wěn)定性。該方法復雜、繁瑣、不穩(wěn)定、特異性差，無實際應用價值。(3)免疫學方法:主要有多克隆抗體和單克隆抗體技術(shù)，用多克隆抗體酶聯(lián)免疫法測定，雖然EL ISA的敏感度高，但種間區(qū)分度并不好，這跟多克隆抗體的特異性差有關(guān)。用單克隆抗體方法在一些重要的植物寄生線蟲的鑒定中已有成功先例，如Arjen Schots等應用單克隆抗體技術(shù)區(qū)分出馬鈴薯金線蟲(Globodera rostochiensis)和馬鈴薯白線蟲(G.pallida),其他如大豆孢囊線蟲(Het2erodera glycines)和南方根結(jié)線蟲(M.1ncog2nita)也有過單克隆抗體技術(shù)的應用。(4)激素測定法:松材線蟲與擬松材線蟲產(chǎn)生的性外激素具有種特異性，即松材線蟲或擬松材線蟲只有各自的雌蟲才能吸引各自相應的雄蟲，這是各自雌蟲釋放性外激素引起的反應。因此可利用測定性外激素來區(qū)分兩者。松材線蟲與擬松材線蟲產(chǎn)生的性外激素具有種特異性，即松材線蟲或擬松材線蟲只有各自的雌蟲才能吸引各自相應的雄蟲，這是各自雌蟲釋放性外激素引起的反應。因此可利用測定性外激素來區(qū)分兩者。(5)脂類測定方法=Krusberg等(1973)報道，南方根結(jié)線蟲和花生根結(jié)線蟲的成熟雌蟲和卵的脂肪酸性質(zhì)相同，但是兩種線蟲中某種脂肪酸的含量不同，因此可以以此來區(qū)分兩種線蟲。但目前尚未見有用脂類來區(qū)分松材線蟲與擬松材線蟲的報道，在這方面是否可行，也可進行一番嘗試。(6)核酸測定法:隨著近幾年分子生物學技術(shù)的迅猛發(fā)展，以DNA為基礎(chǔ)的診斷，在線蟲分類鑒定中的作用與日俱增，在許多植物線蟲類群中已建立了較成熟的分子診斷系統(tǒng)。目前已經(jīng)有比較成熟的PCR和RT-qPCR的試劑盒供應。在核酸測定法中，從生物中提取核酸的方法甚多，目前提取核酸的方法主要有以下幾種:(I)有機提取法?；驹?苯酚使蛋白變性，SDS裂解細胞膜，蛋白酶K和EDTA消化蛋白或多肽或小肽，核蛋白變性降解使DNA從核蛋白中游離出來。利用DNA易溶于水，不溶于有機溶劑的特性提取DNA。(2)螯合樹脂法?；驹?以主要使用的螯合樹脂Chelex-1OO為例，其含有成對的亞氨基二乙酸鹽離子，對高價金屬離子有很高的親和力和螯合作用。在低離子強度、堿性及煮沸下可以使細胞膜裂解，并使蛋白變性，DNA游離。(3)無機提取法?；驹?利用NaCI或醋酸鈉沉淀蛋白，經(jīng)離心，用無水乙醇沉淀提取DNA。(4)差異裂解提取法。基本原理:利用某些生物樣本的細胞膜易于破碎，另一些生物樣本的細胞不容易破碎的特點，使用常規(guī)方法先去除易于破碎細胞，再用特殊試劑裂解不容易破碎細胞，再提取其中的DNA。(5)磷酸鹽緩沖液法。基本原理:細胞在含非離子去垢劑和蛋白酶K的溶液中消化后，高溫加熱使蛋白質(zhì)及蛋白酶K失活，離心沉淀分離蛋白質(zhì)，從離心上清液中提取DNA。(6)甲酰胺解聚法?；驹?甲酰胺可裂解DNA與蛋白質(zhì)的復合物，又可變性沉淀釋放的蛋白質(zhì)，但對蛋白酶K的活性無顯著影響。用高難度甲酰胺裂解染色質(zhì)中DNA與蛋白質(zhì)，然后用火棉膠袋進行充分透析去除蛋白酶K及有機溶劑。此法適合于構(gòu)建高容量載體的基因組DNA文庫及進行大片段的脈沖場凝膠電泳分析。(7)玻璃棒纏繞法?；驹?DNA會沉淀于細胞裂解液和乙醇的交界面，用帶鉤的玻璃棒將大片段DNA從無水乙醇中轉(zhuǎn)移至PH8.0的TE液中。此法適用于構(gòu)建基因文庫，PCR擴增，適合于同時從不同細胞或組織標本中提取DNA。(8)基于二氧化硅吸附提取核酸的方法。基本原理:利用二氧化硅吸附核酸的特性，生物體經(jīng)異硫氰酸胍，roton X-100的Tris-HCl-EDTA處理后核酸與二氧化娃結(jié)合,再經(jīng)含有異硫氰酸胍的Tris-HCl緩沖液和70%乙醇以及丙酮分別洗滌，最后用TE洗脫，獲取核酸。(9)玻璃纖維膜吸附法?；驹?玻璃纖維膜具有與核酸可逆性結(jié)合的特點，生物體裂解液中的DNA在促吸附液的作用下與玻璃纖維膜結(jié)合，用去蛋白液去除玻璃纖維膜上吸附的蛋白及其他雜質(zhì)，再用洗滌液再次清洗玻璃纖維膜上吸附的蛋白及其他雜質(zhì)，最后用洗脫液將玻璃纖維膜上吸附的核酸洗脫下來。(10)磁珠法?；驹?利用硫氰酸胍等強烈蛋白變性劑，破壞細胞膜及核膜蛋白，釋放DNA，并使核酸酶失活；然后加入磁珠通過表面的化學集團與DNA特異性吸附，而蛋白質(zhì)等雜質(zhì)不被吸附而留在容夜里；接著在磁場的作用下，磁性顆粒與液體分開，回收顆粒；最后再用純水或TE洗脫吸附的DNA，在溶解液中進行DNA與磁珠的解離，將DNA重新溶出。(11)硅膠膜吸附柱提取法?；驹?硅膠模吸附柱法是采用特制的硅膠模吸附柱來選擇性吸附裂解細胞釋放的DNA，再經(jīng)過洗滌和洗脫等簡單程序，就可以獲得高純度DNA。目前，國際上在核酸提取方面，已逐漸淘汰一些操作復雜和繁瑣的方法。玻璃纖維膜吸附法和硅膠膜吸附柱提取法具有操作簡便、容易獲得高純度DNA和RNA、可以通過調(diào)節(jié)吸附膜的厚度來適應提取不同量的核酸要求以及成本低廉等優(yōu)點，因此已廣泛應用于各種核酸測定試劑盒中。

實用新型內(nèi)容發(fā)明目的:針對現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足，本實用新型的目的是提供一種木材中松材線蟲核酸快速提取裝置，以使其具有高效、快速提取松材線蟲核酸等優(yōu)點。技術(shù)方案:為實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本實用新型采用的技術(shù)方案如下:一種木材中松材線蟲核酸快速提取裝置，包括相互配合使用的木材收集裝置和核酸速提裝置；所述的木材獲取裝置包括收集器、鉆頭和電鉆；所述的核酸速提裝置包括注射器、過濾器、吸附柱和吸頭，在吸附柱內(nèi)設(shè)吸附膜；在收集木屑時，所述的鉆頭與電鉆相連，所述的收集器設(shè)在鉆頭與待測木材之間；在所述的收集器下方設(shè)注射器；在提取核算時，所述的注射器先與吸頭相連吸取裂解液，然后與過濾器、吸附柱和吸頭依次連接提取核酸。所述的收集器為左右兩端開口、下端開口的T型三通收集器。所述的鉆頭，采用木材開孔鉆頭，其前部直徑為l(T40mm。所述的電鉆為手控無級變速的手持式電鉆，采用鋰電池供電。所述的吸附膜選自玻璃纖維膜、硅膠膜；吸附膜的厚度0.f 10mm。所述注射器的容量在f IOOmL范圍內(nèi)。所述過濾器為用塑料制成含有上、下接頭的中空圓形容器，上接頭與注射器頭相連接，下接頭與吸附柱相連接，在圓形容器內(nèi)放置過濾膜。所述過濾器的內(nèi)徑為5 50mm。所述過濾器中過濾膜選自混合纖維膜、醋酸纖維膜、硝酸纖維膜、尼龍膜、聚醚砜膜或玻璃纖維膜；過濾膜的厚度為0.f 10mm，過濾膜的孔徑為0.f 10um。在所述吸附柱內(nèi)壁、吸頭內(nèi)壁上均涂有硅油。本實用新型的木材中松材線蟲核酸快速提取裝置，使用電鉆和取木鉆頭，通過木材收集裝置直接將木材收集于注射器內(nèi)，然后用注射器直接吸取松材線蟲裂解液加溫，使松材線蟲裂解釋放出核酸。含有核酸的裂解液可以直接通過連接于注射器上的過濾器中的濾膜，有效地濾除樣本中的顆粒和雜質(zhì)，而核酸不被濾膜吸附。通過過濾器后的液體繼續(xù)直接通過同時連接于過濾器上的核酸吸附柱，液體中的核酸被吸附柱中的吸附膜吸附，通過清洗，最后用洗脫液將核酸洗脫進行擴增與檢測。有益效果:與現(xiàn)有技術(shù)相比，本實用新型的木材中松材線蟲核酸快速提取裝置，可以直接快速地提取樣本中的核酸，提取過程無需使用離心機等儀器設(shè)備，節(jié)約了大量時間，簡化了許多操作步驟，成本低，操作快，具有很好的實用性，能夠產(chǎn)生很好的經(jīng)濟效益和社會效應。

圖1是木材收集裝置的結(jié)構(gòu)示意圖；圖2是核酸速提裝置的結(jié)構(gòu)示意圖。
具體實施方式
以下結(jié)合附圖進一步闡明本實用新型，本具體實施方式
在以本實用新型技術(shù)方案為前提下進行實施，應理解這些方式僅用于說明本實用新型而不用于限制本實用新型的范圍。如圖1和圖2所示，木材中松材線蟲核酸快速提取裝置，包括木材收集裝置和核酸速提裝置。木材獲取裝置包括收集器11、鉆頭12和電鉆13。核酸速提裝置包括依次相連的注射器21、過濾器22、吸附柱23和吸頭25，在吸附柱23內(nèi)設(shè)吸附膜24。收集器11為左右兩端開口、下端開口的T型三通收集器；鉆頭12，采用木材開孔鉆頭，其前部直徑為l(T40mm;電鉆13為手控無級變速的手持式電鉆，采用鋰電池供電；注射器21與收集器11下端開口相連。注射器21的容量在f IOOmL范圍內(nèi)。過濾器22為用塑料制成含有上、下接頭的中空圓形容器，上接頭與注射器21頭相連接，下接頭與吸附柱23相連接，在圓形容器內(nèi)放置過濾膜，過濾膜選自混合纖維膜、醋酸纖維膜、硝酸纖維膜、尼龍膜、聚醚砜膜或玻璃纖維膜；過濾膜的厚度為0.flOmm，過濾膜的孔徑為0.flOum ;過濾器22的內(nèi)徑為5 50mm。吸附膜24選自玻璃纖維膜、硅膠膜；吸附膜的厚度0.f 10mm。在吸附柱23內(nèi)壁、吸頭25內(nèi)壁上均涂有娃油。使用時，首先確定被檢木材15,用T型樣本收集器11上部的開口端緊貼木材15表面，收集器11下端連接注射器21，然后用裝有鉆頭12的電鉆13穿過收集器11上部，手指按動電鉆開關(guān)鉆取木屑，木屑會自動流入注射器21內(nèi)。手指按電鉆開關(guān)的控制松緊度可以隨意調(diào)節(jié)電鉆的速度，控制電鉆鉆頭與木材間的壓力，可以得到粗細不同的木屑。將含有木屑樣本的注射器21頭部裝上吸頭25，根據(jù)木屑的量吸取不同量的裂解液(TES+蛋白酶K)，進行加溫65°C裂解30min。然后將吸頭25去掉，將過濾器22裝在注射器21頭部，再將核酸吸附柱23連接在過濾器22上。使注射器21、過濾器22和吸附柱23連成一體。然后用手推動注射器針桿，把木屑中的裂解液推入過濾器22，并經(jīng)過過濾器22進入吸附柱23，最后將裂解液推出棄去。經(jīng)過此過程，木屑中的松材線蟲被裂解釋放出DNA,裂解液中的雜質(zhì)通過過濾器22被濾去，而裂解液中的DNA可以通過過濾器被吸附柱23中的吸附膜24吸附，再將注射器21和過濾器22脫去，用清洗液(75%乙醇)清洗吸附膜24進一步出去雜質(zhì)，最后用核酸洗脫液(I X TE)將吸附膜24中的DNA洗脫收集到有蓋的離心管內(nèi)，供擴增使用。
權(quán)利要求1.一種木材中松材線蟲核酸快速提取裝置，其特征在于:包括相互配合使用的木材收集裝置和核酸速提裝置；所述的木材獲取裝置包括收集器(11)、鉆頭(12)和電鉆(13);所述的核酸速提裝置包括注射器(21)、過濾器(22)、吸附柱(23)和吸頭(25)，在吸附柱(23)內(nèi)設(shè)吸附膜(24);在收集木屑時，所述的鉆頭(12)與電鉆(13)相連，所述的收集器(11)設(shè)在鉆頭(12)與待測木材(15)之間；在所述的收集器(11)下方設(shè)注射器(21);在提取核算時，所述的注射器(21)先與吸頭(25)相連吸取裂解液，然后與過濾器(22)、吸附柱(23)和吸頭(25)依次連接提取核酸。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的木材中松材線蟲核酸快速提取裝置，其特征在于:所述的收集器(11)為左右兩端開口、下端開口的T型三通收集器。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的木材中松材線蟲核酸快速提取裝置，其特征在于:所述的鉆頭(12)，米用木材開孔鉆頭，其如部直徑為10 40mm。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的木材中松材線蟲核酸快速提取裝置，其特征在于:所述的電鉆(13 )為手控無級變速的手持式電鉆，采用鋰電池供電。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的木材中松材線蟲核酸快速提取裝置，其特征在于:所述的吸附膜(24)選自玻璃纖維膜、硅膠膜；吸附膜的厚度0.f 10mm。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的木材中松材線蟲核酸快速提取裝置，其特征在于:所述注射器(21)的容量在f IOOmL范圍內(nèi)。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的木材中松材線蟲核酸快速提取裝置，其特征在于:所述過濾器(22)為用塑料制成含有上、下接頭的中空圓形容器，上接頭與注射器(21)頭相連接，下接頭與吸附柱(23)相連接，在圓形容器內(nèi)放置過濾膜。
8.根據(jù)權(quán)利要求1或7所述的木材中松材線蟲核酸快速提取裝置，其特征在于:所述過濾器(22)的內(nèi)徑為5 50mm。
9.根據(jù)權(quán)利要求1或7所述的木材中松材線蟲核酸快速提取裝置，其特征在于:所述過濾器(22)中過濾膜選自混合纖維膜、醋酸纖維膜、硝酸纖維膜、尼龍膜、聚醚砜膜或玻璃纖維膜；過濾膜的厚度為0.f 10mm，過濾膜的孔徑為0.f lOum。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的木材中松材線蟲核酸快速提取裝置，其特征在于:在所述吸附柱(23)內(nèi)壁、吸頭(25)內(nèi)壁上均涂有硅油。
專利摘要本實用新型公開了一種木材中松材線蟲核酸快速提取裝置，包括相互配合使用的木材收集裝置和核酸速提裝置；所述的木材獲取裝置包括收集器、鉆頭和電鉆；所述的核酸速提裝置包括注射器、過濾器、吸附柱和吸頭，在吸附柱內(nèi)設(shè)吸附膜；在收集木屑時，所述的鉆頭與電鉆相連，所述的收集器設(shè)在鉆頭與待測木材之間；在所述的收集器下方設(shè)注射器；在提取核算時，所述的注射器先與吸頭相連吸取裂解液，然后與過濾器、吸附柱和吸頭依次連接提取核酸。該木材中松材線蟲核酸快速提取裝置，可以直接快速地提取樣本中的核酸，提取過程無需使用離心機等儀器設(shè)備，節(jié)約了大量時間，簡化了許多操作步驟，成本低，操作快，具有很好的實用性。
文檔編號C12M1/12GK203007255SQ201220581808

公開日2013年6月19日 申請日期2012年11月7日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月7日
發(fā)明者詹國輝, 張兆麟, 陳云芳, 顧見明 申請人:蘇州市外來有害生物防控技術(shù)中心