專利名稱：一種快速檢測端粒酶活性的試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
一種快速檢測端粒酶活性的試劑盒
背景技術(shù)：
端粒(Telomere)是一段DNA重復(fù)序列，位于染色體末端，可以保持染色體的完整性。1990年，Harley等證實端粒的長度可以隨著細(xì)胞分裂次數(shù)的增多而逐漸變短。這一發(fā)現(xiàn)在端粒和細(xì)胞衰老之間建立了緊密的聯(lián)系。端粒重復(fù)序列的長度可能起著一種分子鐘(molecular clock)的作用。不同年齡的人的體細(xì)胞的壽命明顯不同,其端粒的長度也不相同。是隨著年齡的增長而縮短。來自新生兒的體細(xì)胞可在體外傳代培養(yǎng)80—90代，來自70歲老人的體細(xì)胞在體外只能傳代培養(yǎng)20 30代，而且端粒的重復(fù)序列長度也縮短很多。端粒酶(Telomerase)是細(xì)胞中負(fù)責(zé)端粒延長的一種酶,是基本的核蛋白逆轉(zhuǎn)錄酶，可將端粒DNA加至真核細(xì)胞染色體末端。端粒在不同物種細(xì)胞中對于保持染色體穩(wěn)定 性和細(xì)胞活性有重要作用，端粒酶能延長縮短的端粒(縮短的端粒其細(xì)胞復(fù)制能力受限)，從而增強體外細(xì)胞的增殖能力。但是，在正常人體細(xì)胞中，端粒酶的活性受到相當(dāng)嚴(yán)密的調(diào)控。實驗證明，體細(xì)胞里沒有端粒酶的活性，所以體細(xì)胞每分裂一次，端粒也就縮短一些。隨著細(xì)胞不斷地進(jìn)行分裂，端粒的長度將越來越短，當(dāng)達(dá)到一個臨界長度時，細(xì)胞染色體會失去穩(wěn)定性，使細(xì)胞不能再進(jìn)行分裂而進(jìn)入凋亡(apoptosis)。端粒的長度決定了細(xì)胞的壽命，因此可用丟失的端粒重復(fù)序列的長度來推測細(xì)胞有絲分裂的次數(shù)，所以端粒被稱為分子鐘或有絲分裂鐘(mitotic clock)。端粒除了涉及到染色體穩(wěn)定性,細(xì)胞的衰老和死亡外,還與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。在人體內(nèi)的各種細(xì)胞中，生殖細(xì)胞和干細(xì)胞染色體的末端比體細(xì)胞染色體的末端長出幾千個堿基對，并且在這兩類細(xì)胞里能檢測到端粒酶的活性。除此之外，其他所有體細(xì)胞里都未測得端粒酶的活性。惟一的例外是來源于體細(xì)胞的惡性腫瘤細(xì)胞卻又重新出現(xiàn)了端粒酶活性，發(fā)揮其合成端粒重復(fù)序列的功能，以補償正常的端粒序列丟失，使端粒的重復(fù)序列不會達(dá)到導(dǎo)致細(xì)胞死亡的臨界長度，從而獲得細(xì)胞的“永生性”(immortality)。這樣，惡性腫瘤細(xì)胞在體內(nèi)或體外都能無限制地分裂增殖。目前，檢測端粒酶活性最常用的方法是基于PCR反應(yīng)的端粒重復(fù)序列擴(kuò)增法(telomeric repeat amplification protocol, TRAP)。以人類細(xì)胞為例，這種方法使用 PCR反應(yīng)擴(kuò)增由端粒酶通過特定引物延長的6堿基重復(fù)序列(TTAGGG)，使該重復(fù)序列的量達(dá)到能被檢測到的程度，從而間接的測定端粒酶的活性。雖然這種方法被廣泛應(yīng)用，但是該方法仍然有其不可忽視的缺點步驟相對復(fù)雜，耗時長，容易得到假陽性或假陰性結(jié)果等?；谝陨显?，最近一些無需通過PCR反應(yīng)擴(kuò)增端粒重復(fù)序列而達(dá)到擴(kuò)增檢測信號目的的方法被開發(fā)出來，包括使用多價過核苷酸，納米金顆粒，具有催化功能的分子信標(biāo)等。但是這些技術(shù)都沒有得到廣泛的應(yīng)用，可能的原因是這些技術(shù)的步驟仍然很復(fù)雜，與原來的TRAP方法比較，并不具備很大的優(yōu)勢。

實用新型內(nèi)容實用新型目的本專利涉及一種基于核酸外切酶III (exonuclease III)可以逐步移除雙鏈DNA3’平末端或3’縮進(jìn)末端單個核苷酸的特性，測量樣品細(xì)胞內(nèi)端粒酶活性的方法。一種快速檢測端粒酶活性的試劑盒，其特征在于包括盒體，4個試劑管；所述的試劑管分別裝有延伸反應(yīng)混合物，標(biāo)記的分子信標(biāo)序列，ExoIII, Ix NEB Buffer I。所述的反應(yīng)混和物成分為20mM Tris-HCl, pH 8. 3 ；1. 5 mM MgCl2 ；63 mM KCl ；O. 05% Tween 20 (w/v) ；1 mM EGTA ; 10 μ M dATP ；10 μ M dGTP ；10 μ M dCTP ； 10 μ M dUTP ；300 ηΜ延伸反應(yīng)引物；0. I mg/ml BSA ;其中所述的延伸反應(yīng)引物序列為5’_AAT CCG TCGAGC AGA GTT-3’ ；所述的標(biāo)記的分子信標(biāo)序列為5’ -(熒光基團(tuán))-HG GGT TAC TAA CCCTAA CCC TAA CCC T-(淬滅基團(tuán))-AA CCC TAA CCT TT-3’，其中斜體字母代表鎖核酸LNA。所述的熒光基團(tuán)包括5’6-FAM、5’ TET、5’ HEX、5’ TAMRA、5’ CY5、中間6-FAM-dT、3，6-FAM、3，TAMRA、中間 TAMRA_dT、5，R0X、3，R0X、5，Texas Red、5，Cy3、中間 Cy3、3，Cy3、3，Cy5、5，Cy5、5，Cy5. 5、5，AMCA、3，AMCA、5，J0E、3，JOE,Alexa Fluor 488、·5’ Methylene Blue、3’ Methylene Blue、FR610 ;所述的淬滅基團(tuán)包括3’ BHQ _1、3’ BHQ_2、3， Dabcyl、5， Dabcyl、3， Eclipse。一種快速檢測端粒酶活性的試劑盒的應(yīng)用，其特征在于按步驟實現(xiàn)A.從細(xì)胞中提取含端粒酶的樣品；B.在2 UL含端粒酶樣品中分別加入48 μ L延伸反應(yīng)混合物，30°C孵育I h，獲得延伸產(chǎn)物；其中所述的延伸反應(yīng)引物序列為5’ -AAT CCG TCG AGC AGA GTT-3’ ；C.將上述延伸產(chǎn)物，分別添加含Ix NEB Buffer 1,100 U ExoIII, 2 μ M標(biāo)記的分子信標(biāo)序列，將反應(yīng)混合物置于37 0C 2 h后，使用可見光分光光度計讀取結(jié)果；其中所述的標(biāo)記的分子信標(biāo)序列為5’ -(熒光基團(tuán))-HG GGT TAC TAA CCC TAA CCC TAA CCCT-(淬滅基團(tuán))-AA CCC TAA CCT TT-3’，其中斜體字母代表鎖核酸LNA。原理說明I、分子信標(biāo)(MBs)與靶序列結(jié)合，產(chǎn)生檢測信號的原理(圖I)MBs是一種可特異識別核酸序列的發(fā)夾型莖環(huán)雙標(biāo)記寡核苷酸熒光探針，具有高特異性、高敏感性、操作簡便、可用于定量分析等優(yōu)點。兩端的核酸序列互補配對，因此標(biāo)記在一端的熒光基團(tuán)與標(biāo)記在另一端的淬滅基團(tuán)緊緊靠近。熒光基團(tuán)被激發(fā)后產(chǎn)生的光子被淬滅劑淬滅，由熒光基團(tuán)產(chǎn)生的能量以紅外而不是可見光形式釋放出來。在復(fù)性溫度下，因為模板存在時形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)雙鏈解開，并與模板序列配對。與模板配對后，分子信標(biāo)將成鏈狀而非發(fā)夾狀，使得熒光基團(tuán)與淬滅劑分開，熒光基團(tuán)被激發(fā)，因淬滅作用被解除，發(fā)出激發(fā)光子，從而可被檢測器檢測到。2、通過exonuclease III (ExoIII)移除3’端單個核苷酸,達(dá)到突光信號不斷再生、增強的原理(圖2):ExoIII具有從雙鏈DNA的3' -OH末端降解生成5’ -單核苷酸的3' - 外切酶活性。該酶對雙鏈DNA具有高度特異性，能降解平滑末端、3'縮進(jìn)末端及有切口的DNA，但是不能降解3'-突出末端。利用ExoIII的特性，在與端粒酶延伸產(chǎn)物雜交并激活熒光基團(tuán)后，MBs 3’端核苷酸被反應(yīng)體系中的ExoIII逐步移除，最終使得被降解的MBs與靶序列分離，這使得靶序列能夠重新與完整的MBs雜交，并激活其熒光基團(tuán)。這種靶序列與MBs雜交-激活熒光基團(tuán)-ExoIII降解MBs-靶序列與MBs分離的步驟不斷循環(huán)，從而解決了靶序列與MBs只能以I :1的比例結(jié)合的局限性，使得熒光信號被極大的增強，直至能被檢測器檢測到。有益效果I、本實用新型通過設(shè)計特異性引物，能夠?qū)崿F(xiàn)端粒酶的提取。2、端粒酶是已知的惡性腫瘤特異性最強的生物標(biāo)志物，其酶活性在腫瘤的早期診斷和預(yù)后評估中均具有很大的潛在價值。同時，在生殖細(xì)胞和造血干細(xì)胞等非腫瘤細(xì)胞中，也能檢測出端粒酶活性，因而單憑端粒酶活性的有無難以區(qū)分正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞。所以端粒酶活性的定量分析是癌癥診斷和預(yù)防中重要的手段。本專利涉及的基于ExoIII 3’-5’外切酶活性的端粒酶檢測方法，有步驟簡單，耗時短，準(zhǔn)確性高，成本低等特點，具有非常大的大規(guī)模及商業(yè)化應(yīng)用潛力。
3、本實用新型的核心是利用核酸外切酶III (exoneclease III)可以逐步移除雙鏈DNA 3’端的單個核苷酸，而對單鏈DNA無活性的特性，使得與端粒酶延伸序列特異結(jié)合的分子信標(biāo)(molecy Lar beacons,MBs)不斷被激活-移除,然后新的MBs重新與目標(biāo)序列結(jié)合-激活-移除，從而使MBs信號(熒光，顯色反應(yīng)等)被不斷的擴(kuò)增，達(dá)到能被檢測到的程度。檢測信號的強度直接反映了端粒酶延伸產(chǎn)物的多少，從而間接反映了細(xì)胞內(nèi)端粒酶活性的強弱。該技術(shù)步驟簡單，耗時短，并且避免了 PCR反應(yīng)帶來的可能的假陽性或假陰性結(jié)果。另外，該技術(shù)4、本試劑盒所需的儀器耗材價格低廉，具有用于大規(guī)模檢測端粒酶活性的商業(yè)化潛力。


圖I.應(yīng)用MBs對靶序列進(jìn)行定量分析的原理。在無靶序列的情況下，MBs呈發(fā)夾型結(jié)構(gòu)，其熒光基團(tuán)在淬滅基團(tuán)的作用下，不發(fā)射熒光；在與靶序列雜交后，MBs的熒光基團(tuán)與淬滅基團(tuán)分離，產(chǎn)生能夠被檢測到的熒光信號。圖2.應(yīng)用ExoIII的特性檢測端粒酶活性的原理。I. MBs與靶序列，即端粒酶延伸產(chǎn)物雜交，產(chǎn)生熒光信號，并在其3’ -OH端形成3’縮進(jìn)末端，從而成為ExoIII外切酶活性的底物；2.在ExoIII逐步移除MBs 3’ -OH端的寡核苷酸后，MBs與延伸產(chǎn)物分離；分離后的延伸產(chǎn)物可以重新與完整的MBs結(jié)合，并重復(fù)之前的步驟，使得熒光信號得到增強。圖3. HeLa細(xì)胞端粒酶活性。從約8000個HeLa細(xì)胞中提取的樣品中端粒酶活性所對應(yīng)的熒光強度比空白對照(Lysis buffer)或滅活后的HeLa細(xì)胞樣品對應(yīng)的熒光信號強 40% 左右(P < 0.05)。圖4.不同細(xì)胞中端粒酶活性檢測結(jié)果。與空白對照(Lysis buffer)或已知無端粒酶活性的WI-38細(xì)胞所的信號強度相比，HeLa細(xì)胞或HeLa+WI_38細(xì)胞樣品中信號強度顯著增強(P〈0.05)。圖5.使用傳統(tǒng)TRAP法檢測端粒酶活性結(jié)果。其中A為1_3泳道電泳，B為4_5電泳圖；在空白對照(Lysis buffer)、滅活HeLa細(xì)胞及無端粒酶活性的WI-38細(xì)胞中(泳道2、3、5)，沒有觀察到端粒酶延伸反應(yīng)產(chǎn)生的端粒重復(fù)序列片段條帶，而在已知有端粒酶活性的HeLa細(xì)胞或HeLa+WI_38細(xì)胞樣品中(泳道I、4),可以觀察到間接反應(yīng)端粒酶活性的端粒重復(fù)片段條帶。圖6為本實用新型示意圖，其中5為盒體，1-4分別為第一至第四試劑管。
具體實施方式
ExoIII 和 NEB Buffer I 購自 New England Biolabs 公司，所有突光集團(tuán) / 淬滅集團(tuán)標(biāo)記的MBs (LNA-DNA)及寡核苷酸引物由生工生物工程(上海)公司合成，由HPLC純化，并由質(zhì)譜測序。其中熒光基團(tuán)為CAL Fluor Red 610 (FR610)，淬滅基團(tuán)為black holequencher (BHQ)0用于檢測端粒酶活性的LNA-DNA嵌合體MB序列為5’- (FR610)
GGT TAC TAA CCC TAA CCC TAA CCC T- (BHQ) -AA CCC TAA CCT TT-3’(斜體字母代表鎖核酸LNA);端粒酶延伸反應(yīng)引物為5’-AAT CCG TCG AGC AGA GTT-3’。腫瘤細(xì)胞(HeLa細(xì)胞株，購自ATCC)和人胚肺二倍體成纖維細(xì)胞(WI-38細(xì)胞株，購自ATCC)培養(yǎng)條件參照ATCC提供的培養(yǎng)方法。實施例I.·[0033]一種快速檢測端粒酶活性的試劑盒，其特征在于包括盒體5，4個試劑管；其中第一試劑管I裝有延伸反應(yīng)混合物，第二試劑管2裝有標(biāo)記的分子信標(biāo)序列，第三試劑管3裝有ExoIII，第四試劑管4裝有Ix NEB Buffer I。一種快速檢測端粒酶活性的試劑盒的應(yīng)用，按如下步驟實現(xiàn)一、細(xì)胞樣品中端粒酶的提取分別收集腫瘤細(xì)胞(HeLa細(xì)胞株，購自ATCC)和人胚肺二倍體成纖維細(xì)胞(WI-38細(xì)胞株，購自ATCC)，離心后將細(xì)胞按200 yL/106細(xì)胞的比例重新懸浮于裂解液(lx CHAPSLysis buffer, ATCC)中，冰上靜置30 min ;之后于12000 g,4°C離心20 min ;收集上清于_80°C保存，獲得兩種含端粒酶上清，即HeLa細(xì)胞端粒酶上清和WI-38細(xì)胞端粒酶上清。二、端粒酶延伸反應(yīng)在2 μ L (含總蛋白約5μ g/μ L)的兩種含端粒酶待測上清樣品中分別加入48μ L延伸反應(yīng)混合物，30°C孵育I h，獲得延伸產(chǎn)物，即HeLa細(xì)胞延伸產(chǎn)物和WI-38細(xì)胞延伸產(chǎn)物；其中延伸反應(yīng)混合物成分為20mM Tris-HCl, pH 8. 3 ；1. 5 mM MgCl2 ；63 mM KCl ；O. 05% Tween 20 (w/v) ；1 mM EGTA ；10 μΜ dATP ；10 μ M dGTP ；10 μ M dCTP ；10 μ M dUTP ；300 ηΜ延伸反應(yīng)引物，其中引物核苷酸序列為5’ -AAT CCG TCG AGC AGA GTT-3’ ；0. I mg/ml BSA。端粒酶活性檢測反應(yīng)體系為50 μ L，將上述延伸產(chǎn)物，分別添加含Ix NEB Buffer 1,100 UExoIII,2 μΜ標(biāo)記的分子信標(biāo)序列；將反應(yīng)混合物置于37 V 2 h后，使用可見光分光光度計讀取結(jié)果λ ex=590 nm，從HeLa細(xì)胞中提取的樣品中端粒酶活性所對應(yīng)的熒光強度比空白對照(Lysis buffer)或滅活后(B卩加熱處理后滅活后)的HeLa細(xì)胞樣品對應(yīng)的熒光信號強40%左右(P < 0.05)，見圖3;λ em=610 nm,與空白對照(Lysis buffer)或已知無端粒酶活性的WI-38細(xì)胞所的信號強度相比，HeLa細(xì)胞或HeLa+WI-38細(xì)胞樣品中信號強度顯著增強(P < 0.05)見(圖4)。所述的分子信標(biāo)序列為5’ -(熒光基團(tuán))-HG GGT TAC TAA CCC TAA CCC TAACCC T-(淬滅基團(tuán))-AA CCC TAA CCT TT-3’(斜體字母代表鎖核酸LNA);其中本例中的熒光基團(tuán)為FR610，淬滅基團(tuán)為3’ BHQ-I。[0044]電泳使用10%的non-denaturing PAGE膠，電泳條件為400 V, I. 5 h。電泳完成后使用溴乙唳溶液染色，于紫外燈下觀察結(jié)果；在空白對照(Lysis buffer)、滅活HeLa細(xì)胞及無端粒酶活性的WI-38細(xì)胞中(泳道2、3、5)，沒有觀察到端粒酶延伸反應(yīng)產(chǎn)生的端粒重復(fù)序列片段條帶，而在已知有端粒酶活性的HeLa細(xì)胞或HeLa+WI-38細(xì)胞樣品中(泳道I、4)，可以觀察到間接反應(yīng)端粒酶活性的端粒重復(fù)片段條帶(圖5)對比例TRAPassay該方法使用Trapeze Telomerase Detection Kit (Millipore)。I.在特定序列的引物 TS Primer(5’-AAT CCG TCG AGC AGA GTT-3’)存在的條件下，獲得端粒酶延伸反應(yīng)產(chǎn)物，并使用PCR擴(kuò)增該延伸反應(yīng)產(chǎn)物。端粒酶基因延伸反應(yīng)及后續(xù)PCR擴(kuò)增延伸反應(yīng)產(chǎn)物的反應(yīng)混合物成分如下
權(quán)利要求1.一種快速檢測端粒酶活性的試劑盒，其特征在于包括盒體，4個試劑管；其中第一試劑管裝有延伸反應(yīng)混合物，第二試劑管裝有標(biāo)記的分子信標(biāo)序列，第三試劑管裝有ExoIII，第四試劑管裝有Ix NEB Buffer I。
專利摘要本實用新型涉及試劑盒，特別涉及一種實時定量PCR測量樣品中染色體端粒平均長度的絕對值的試劑盒。一種用RT-qPCR法測量端粒平均長度絕對值的試劑盒，其特征在于包括盒體，襯墊，PCR反應(yīng)液，Taq酶，136B4Forward，36B4Reverse，TelomereForward，TelomereReverse，84-mer，36B4片段，襯墊上設(shè)有容器空分別放置PCR反應(yīng)液，Taq酶，136B4Forward，36B4Reverse，TelomereForward，TelomereReverse，84-mer。本實用新型采用試劑盒可以方便，快捷測定端粒的平均長度的絕對值，使用工業(yè)生產(chǎn)或檢測。
文檔編號C12Q1/68GK202671545SQ201220273298
公開日2013年1月16日 申請日期2012年6月12日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月12日
發(fā)明者葉汝章, 張娟, 全利, 滕凌, 葉亞東, 朱文華, 潘鸝, 胡娟, 郝小江, 朱兆云, 路易斯伊格納羅 申請人:云南路易斯中藥現(xiàn)代化工程技術(shù)研究中心