瓊脂包埋法固定化污泥中產(chǎn)氫微生物的改性方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明是通過(guò)添加厭氧菌瓊脂和γ-氧化鋁對(duì)瓊脂包埋法固定化污泥中的產(chǎn)氫微生物進(jìn)行改性。普通瓊脂與厭氧菌瓊脂的質(zhì)量比為2:1~4:1，γ-氧化鋁的添加量為1.5~2.5%，瓊脂溶液與污泥的體積比為2:3~3:2，滴球成形后接種于厭氧發(fā)酵制氫體系中。厭氧菌瓊脂能夠?yàn)楫a(chǎn)氫微生物提供營(yíng)養(yǎng)、縮短適應(yīng)期，被微生物利用后形成一定的孔道有利于傳質(zhì)。γ-氧化鋁無(wú)毒、無(wú)臭、硬度大、比表面積大、吸附性強(qiáng)、溶液透過(guò)速率快，有利于微生物的附著，有利于增強(qiáng)瓊脂小球的機(jī)械強(qiáng)度和促進(jìn)傳質(zhì)過(guò)程。本發(fā)明對(duì)瓊脂包埋法改性后，能夠提高累積產(chǎn)氫量、縮短產(chǎn)氫延遲時(shí)間、提高比產(chǎn)氫率和產(chǎn)氣中氫氣的濃度，保持系統(tǒng)持續(xù)穩(wěn)定地產(chǎn)氫。
【專(zhuān)利說(shuō)明】瓊脂包埋法固定化污泥中產(chǎn)氫微生物的改性方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種產(chǎn)氫微生物固定法的改性。通過(guò)添加少量厭氧菌瓊脂來(lái)縮短產(chǎn)氫微生物的適應(yīng)時(shí)間，并添加Y-氧化鋁提高瓊脂顆粒的機(jī)械性能，主要用于厭氧發(fā)酵制氫體系，提高微生物抗負(fù)荷能力、維持產(chǎn)氫系統(tǒng)的穩(wěn)定。
【背景技術(shù)】
[0002]隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，人們對(duì)化石燃料的開(kāi)采和利用與日俱增，而地球上儲(chǔ)備的化石燃料有限，從而導(dǎo)致了 “能源危機(jī)”。而且化石燃料燃燒帶來(lái)了嚴(yán)重的環(huán)境污染問(wèn)題。所以，尋求一種替代的、可再生的能源物質(zhì)成為必然。氫氣的燃燒熱值較高為142.35kJ/g，是汽油的2.75倍，酒精的3.9倍，焦炭的4.5倍。由于其燃燒只產(chǎn)生水，無(wú)二次污染，且可再生，因此被譽(yù)為“清潔能源”和“未來(lái)能源”。傳統(tǒng)的制氫方法有水電解制氫，水煤氣轉(zhuǎn)化制氫，煤、焦炭氣化制氫等。而這些方法需要消耗大量的能量，并沒(méi)有擺脫對(duì)化石燃料的依附。生物制氫是目前研究進(jìn)展最快并有希望成為規(guī)?；a(chǎn)的一種制氫方法，不依賴(lài)化石燃料、生產(chǎn)過(guò)程清潔、使用原料低廉。光合產(chǎn)氫和厭氧發(fā)酵產(chǎn)氫是生物制氫的兩種主要途徑，其中厭氧發(fā)酵法備受關(guān)注，主要由于發(fā)酵細(xì)菌產(chǎn)氫能力高、易實(shí)現(xiàn)持續(xù)產(chǎn)氫、設(shè)備簡(jiǎn)單、操作方便、可以利用較廣泛的生物質(zhì)等優(yōu)點(diǎn)。
[0003]在厭氧發(fā)酵產(chǎn)氫反應(yīng)體系中，接種微生物主要有懸浮態(tài)和固定化兩種形態(tài)。一般懸浮態(tài)微生物容易隨著出水而流失，使發(fā)酵系統(tǒng)中的生物量減少、產(chǎn)氫性能易受到影響。固定化微生物可以保證高濃度的產(chǎn)氫菌、防止產(chǎn)氫菌受到惡劣環(huán)境的沖擊等。因此尋找一種良好的固定化微生物的方法顯得尤為重要。專(zhuān)利CN10117767A報(bào)道了通過(guò)微生物固定化技術(shù)的得到的包埋顆粒的性能得到顯著提高。包埋法是目前細(xì)胞固定化技術(shù)中最常用、研究最廣的方法，是將微生物細(xì)胞截留在水不溶性的凝膠聚合物空隙的網(wǎng)絡(luò)空間中，阻止細(xì)胞的泄露同時(shí)允許底物滲入和產(chǎn)物擴(kuò)散。現(xiàn)有的包埋固定化載體主要分為有機(jī)合成高分子載體和天然高分子凝膠載體兩類(lèi)。有機(jī)合成高分子載體的優(yōu)點(diǎn)是抗微生物分解性好、機(jī)械強(qiáng)度高、化學(xué)性能穩(wěn)定等，但載體聚合物網(wǎng)絡(luò)的形成條件比較劇烈，對(duì)微生物細(xì)胞損害較大。而天然高分子凝膠是從自然界中分離提取出來(lái)的物質(zhì)，具有生物無(wú)毒、傳質(zhì)性能良好、成形方便、固定化密度高等優(yōu)點(diǎn)。瓊脂是從海藻中提取的多糖體，是一種天然高分子凝膠，是包埋技術(shù)中常用的一種載體。但是存在機(jī)械強(qiáng)度差、耐生物分解性差等缺點(diǎn)。在發(fā)酵后期，瓊脂顆粒內(nèi)部受到產(chǎn)氣的壓力而破碎上浮，使顆粒與有機(jī)質(zhì)的接觸面積減小，降低固定化微生物產(chǎn)氫率，同時(shí)有機(jī)質(zhì)的降解率也下降。因此，需要對(duì)瓊脂包埋法固定化產(chǎn)氫菌進(jìn)行改性，提高固定化細(xì)胞傳質(zhì)性能、增加通透性、增強(qiáng)機(jī)械強(qiáng)度和耐有毒物質(zhì)的能力。專(zhuān)利CN101668862A報(bào)道了用 有機(jī)合成高分子物質(zhì)作為聚合物材料截留固定化產(chǎn)氫細(xì)菌，最適PH轉(zhuǎn)變?yōu)檩^低pH范圍，因此耗氫菌影響較少、氫氣產(chǎn)率提高。但是這種方法得到的球粒形狀不一致、大小不均一，不利于考察固定化效果，且負(fù)載了純菌種不利于底物的多元化利用。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明是采用厭氧菌瓊脂和Y -氧化鋁作為添加劑，加入普通瓊脂與污泥的混合溶液中，一起在液體石蠟中滴球成形。改性后得到的固定化瓊脂顆粒小球在厭氧發(fā)酵制氫過(guò)程中體現(xiàn)出更好的產(chǎn)氫性能。
[0005]改性固定化瓊脂顆粒的具體制備步驟如下:
[0006]( I)將瓊脂和厭氧菌瓊脂加入蒸餾水中，瓊脂與厭氧菌瓊脂質(zhì)量比為2: f 4:1，加熱使瓊脂溶解；
[0007](2)在8(T90°C恒溫水浴鍋中，熱預(yù)處理污泥0.5~lh，去除產(chǎn)甲烷菌富集產(chǎn)氫菌；
[0008](3)將溶解的瓊脂和預(yù)處理后的污泥在5(T55°C下恒溫后混合，瓊脂溶液與污泥體積比為2: 3^3: 2，攪拌均勻，瓊脂最終濃度為2~3% ；
[0009](4)向混合液中加入的Y -氧化鋁，添加量為1.5^2.5%，攪拌均勻；
[0010](5)用針筒注射器吸取混合液，滴入上層是液體石蠟(C16飛20)下層是水的量筒中，顆粒粒徑為3~4mm，用無(wú)菌紗布濾出固定化污泥顆粒；
[0011](6)用0.8%無(wú)菌生理鹽水沖洗小球顆粒，洗凈后備用。
[0012]通過(guò)顯微鏡觀察瓊脂小球，表面有很多孔道，在孔道內(nèi)部布滿了生長(zhǎng)良好的微生物，微生物為桿狀，形態(tài)較為均一。通過(guò)微生物代謝產(chǎn)物的分析，丁酸和乙酸所占比例達(dá)70%以上，發(fā)酵類(lèi)型屬于“丁酸型”，因此這種桿狀菌可能是最常見(jiàn)的產(chǎn)氫菌——梭狀芽孢桿菌。說(shuō)明改性后的載體能夠形成一個(gè)生物保護(hù)龕，避免微生物受到低pH、有毒物質(zhì)等不良環(huán)境的影響。在產(chǎn)氫發(fā)酵后期，瓊脂顆粒沒(méi)有出現(xiàn)破損上浮，性質(zhì)仍較穩(wěn)定，說(shuō)明改性后的顆粒機(jī)械強(qiáng)度得到提高。
[0013]本發(fā)明的幾個(gè)具體說(shuō)明和優(yōu)點(diǎn):
[0014]第一，混合液中的污泥提供了多種產(chǎn)氫菌，可以利用不同底物。城市剩余污泥富含蛋白質(zhì)、碳水化合物、脂質(zhì)等有機(jī)物，具有廣甲燒菌、硫酸鹽還原菌、廣乙酸菌、廣氫!菌等多種微生物。用于制作固定化產(chǎn)氫菌時(shí)，需要一定的預(yù)處理手段抑制耗氫菌和富集產(chǎn)氫菌。產(chǎn)甲烷菌等耗氫菌不能生成孢子，采用加熱法預(yù)處理可以將其去除，保留能夠形成孢子的產(chǎn)氫菌。
[0015]第二，厭氧菌瓊脂的主要成分是胰酪蛋白胨、L-胱氨酸、硫代乙醇酸鈉、葡萄糖、氯化鈉、瓊脂等，這些營(yíng)養(yǎng)成分是供厭氧菌生長(zhǎng)所需。而產(chǎn)氫菌主要為厭氧菌和兼性厭氧菌，因此向混合液中加入適量的厭氧菌瓊脂可以縮短產(chǎn)氫菌的馴化期，從而縮短產(chǎn)氫延遲時(shí)間。當(dāng)形成的瓊脂小球中的營(yíng)養(yǎng)成分被微生物利用后能形成一定的孔道，加快了底物進(jìn)入小球孔道并被微生物利用進(jìn)行發(fā)酵的過(guò)程，產(chǎn)生的氣體也能夠更加順利地從小球中釋放出來(lái)。
[0016]第三，本發(fā)明采用的Y-氧化鋁(比表面積15(T200m2/g，孔徑5~10nm)，無(wú)毒、無(wú)味、無(wú)臭，吸附性強(qiáng)、溶液透過(guò)速率快、機(jī)械強(qiáng)度大。將Y-氧化鋁用于瓊脂包埋法固定化產(chǎn)氫微生物的改性過(guò)程，主要優(yōu)勢(shì)有:1.能夠吸附要降解的底物，使底物與微生物充分接觸從而加快反應(yīng)；2.抗壓硬度高，有利于增強(qiáng)瓊脂球形顆粒的抗壓能力和耐水力沖擊性；
3.得到的顆粒大小均一，能夠維持球形顆粒的機(jī)械強(qiáng)度的均勻性和保持球體形狀；4.具有多孔性且對(duì)微生物沒(méi)有毒性，有利于微生物的附著和傳質(zhì)過(guò)程；5.使用壽命長(zhǎng)，發(fā)酵反應(yīng)過(guò)程性質(zhì)穩(wěn)定；6.使用原料成本較低，制備工藝較簡(jiǎn)便。[0017]第四，液體石蠟是從原油分餾得到的無(wú)色無(wú)味的混合物，主要成分是ClfTC2tl的正構(gòu)烷烴。密度比水輕，不溶于水，性質(zhì)較溫和、無(wú)毒。來(lái)源廣泛，價(jià)格便宜。瓊脂包埋顆粒在液體石蠟中滴球成形，對(duì)產(chǎn)氫微生物沒(méi)有毒性，且液體石蠟作為分散介質(zhì)能夠分隔每一滴注入的混合溶液，使每一滴溶液?jiǎn)为?dú)成球，顆粒形成后不會(huì)發(fā)生聚合或團(tuán)聚，形成的顆粒為球形或橢球形且大小均一。在液體石蠟中成形的顆粒比在水溶液中成形的顆粒具有強(qiáng)度高、粒徑分布均勻、孔徑分布范圍窄等優(yōu)勢(shì)。成形的瓊脂顆粒從液體石蠟層進(jìn)入下層的水相后能夠迅速去除其表面附著的液體石蠟，并能提前適應(yīng)水相環(huán)境，有利于后續(xù)的發(fā)酵反應(yīng)的快速啟動(dòng)。
【具體實(shí)施方式】
[0018]模擬廢水組成:葡萄糖8gL，NH4Cl0.5gL，Na2HP046.27g/L和微量元素IOmL/L-culture, pH6.5~7.0。
[0019]微量元素:K2HP04125mgL,MgCl2.6H20100mg/L, MnSO4.6H2015mg/L,FeSO4.7H2025mg/L, CuSO4.5H205mg/L, CoCl2.H202mg/L。
[0020]滴球過(guò)程:用針筒式注射器吸取混合液，滴入上層是液體石蠟(ClfTC2tl)下層是水的量筒中。
[0021]實(shí)施例1
[0022]接種熱預(yù)處理后的懸浮態(tài)污泥IOmL于200mL的廢水中，反應(yīng)溫度37 ± I °C，搖床速率13(Tl50rpm。產(chǎn)氫延遲時(shí)間3.7h，累積產(chǎn)氫量180.9mL,比產(chǎn)氫率157.3mLH2/g-glucose,氫氣濃度38.8%，糖類(lèi)降解率71.9%。
[0023]實(shí)施例2
[0024]不添加厭氧菌瓊脂，瓊脂溶液與污泥體積比為1:1，瓊脂濃度為3%，混合液一共20mL，用注射器滴球直徑為3~4mm。將瓊脂顆粒加入到200mL廢水中，反應(yīng)溫度37土1°C，搖床速率13(Tl50rpm。產(chǎn)氫延遲時(shí)間8.5h，累積產(chǎn)氫量201.5mL,比產(chǎn)氫率167.8mLH2/g-glucose,氫氣濃度39.9%,糖類(lèi)降解率75.1%。
[0025]實(shí)施例3
[0026]瓊脂與厭氧菌瓊脂質(zhì)量比為3:1，瓊脂溶液與污泥體積比為1:1,瓊脂濃度為3%，混合液一共20mL，用注射器滴球直徑為3~4mm。將瓊脂顆粒加入到200mL廢水中，反應(yīng)溫度37±1°C，搖床速率13(Tl50rpm。產(chǎn)氫延遲時(shí)間4.lh，累積產(chǎn)氫量224.9mL，比產(chǎn)氫率175.9mLH2/g-glucose，氫氣濃度 45.1%，糖類(lèi)降解率 79.9%。
[0027]實(shí)施例4
[0028]瓊脂與厭氧菌瓊脂質(zhì)量比為3:1，瓊脂溶液與污泥體積比為1:1,瓊脂濃度為3%，
Y-氧化鋁添加量為2%，混合液一共20mL，用注射器滴球直徑為3~4mm。將瓊脂顆粒加入到200mL廢水中，反應(yīng)溫度37±1°C，搖床速率13(Tl50rpm。產(chǎn)氫延遲時(shí)間5.7h，累積產(chǎn)氫量264.0mL,比產(chǎn)氫率 189.4mLH2/g-glucose，氫氣濃度 50.9%，糖類(lèi)降解率 87.1%。
[0029]實(shí)施例5
[0030]瓊脂與厭氧菌瓊脂質(zhì)量比為4:1，瓊脂溶液與污泥體積比為3:2，瓊脂濃度為2.5%，Y -氧化鋁添加量為2%，混合液一共20mL，用注射器滴球直徑為3~4mm。將瓊脂顆粒加入到200mL廢水中，反應(yīng)溫度37±1°C，搖床速率13(Tl50rpm。產(chǎn)氫延遲時(shí)間6.2h，累積產(chǎn)氫量257.4mL,比產(chǎn)氫率187.5mLH2/g-glucose，氫氣濃度49.3%，糖類(lèi)降解率85.8%。
[0031]實(shí)施例6
[0032]瓊脂與厭氧菌瓊脂質(zhì)量比為6:1，瓊脂溶液與污泥體積比為1:1，瓊脂濃度為3%，
Y-氧化鋁添加量為2%，混合液一共20mL，用注射器滴球直徑為3~4mm。將瓊脂顆粒加入到200mL廢水中，反應(yīng)溫度37±1°C，搖床速率13(Tl50rpm。產(chǎn)氫延遲時(shí)間6.9h，累積產(chǎn)氫量260.8mL,比產(chǎn)氫率 187.6mLH2/g-glucose，氫氣濃度 50.3%，糖類(lèi)降解率 86.9%。
[0033]實(shí)施例7
[0034]瓊脂與厭氧菌瓊脂質(zhì)量比為3:2，瓊脂溶液與污泥體積比為1:1,瓊脂濃度為3%，
Y-氧化鋁添加量為2%，混合液一共20mL，用注射器滴球直徑為3~4mm。將瓊脂顆粒加入到200mL廢水中，反應(yīng)溫度37±1°C，搖床速率13(Tl50rpm。產(chǎn)氫延遲時(shí)間5.0h，累積產(chǎn)氫量231.8mL,比產(chǎn)氫率 177.3mLH2/g-glucose，氫氣濃度 46.2%，糖類(lèi)降解率 81.7%。
[0035]實(shí)施例8
[0036]瓊脂與厭氧菌瓊脂質(zhì)量比為3:1，瓊脂溶液與污泥體積比為1:1,瓊脂濃度為3%，
Y-氧化鋁添加量為1.5%，混合液一共20mL，用注射器滴球直徑為3~4mm。將瓊脂顆粒加入到200mL廢水中，反應(yīng)溫度37±1°C，搖床速率13(Tl50rpm。產(chǎn)氫延遲時(shí)間5.2h，累積產(chǎn)氫量246.4mL,比產(chǎn)氫率183.5mLH2/g-glucose，氫氣濃度47.1%，糖類(lèi)降解率83.9%。
[0037]實(shí)施例9
[0038]瓊脂與厭氧菌瓊脂質(zhì)量比為3:1，瓊脂溶液與污泥體積比為2:3，瓊脂濃度為
2.5%，Y -氧化鋁添加量為2.5%，混合液一共20mL，用注射器滴球直徑為3~4mm。將瓊脂顆粒加入到200mL廢水中，反應(yīng)溫度37±1°C，搖床速率13(Tl50rpm。產(chǎn)氫延遲時(shí)間5.0h，累積產(chǎn)氫量265.5mL,比產(chǎn)氫率188.lmLH2/g-glucose，氫氣濃度49.5%，糖類(lèi)降解率88.2%。
[0039]實(shí)施例10
[0040]瓊脂與厭氧菌瓊脂質(zhì)量比為3:1，瓊脂溶液與污泥體積比為2:1，瓊脂濃度為3%，
Y-氧化鋁添加量為2%，混合液一共20mL，用注射器滴球直徑為3~4mm，小球顆粒顏色明顯變淺。將瓊脂顆粒加入到200mL廢水中，反應(yīng)溫度37±1°C，搖床速率13(Tl50rpm。產(chǎn)氫延遲時(shí)間6.7h，累積產(chǎn)氫量233.9mL,比產(chǎn)氫率170.lmLH2/g-glucose，氫氣濃度42.5%，糖類(lèi)降解率85.9%。
[0041]實(shí)施例11
[0042]瓊脂與厭氧菌瓊脂質(zhì)量比為3:1，瓊脂溶液與污泥體積比為1:2，瓊脂濃度為3%，
Y-氧化鋁添加量為2%，混合液一共20mL，用注射器滴球，顆粒小球成形較困難，從液體石蠟層進(jìn)入水相后，部分污泥從顆粒中溢出進(jìn)入水相，顆粒破碎。
[0043]從具體實(shí)施例可見(jiàn)，實(shí)施例2包埋法固定化污泥細(xì)胞與實(shí)施例1懸浮態(tài)污泥相比，產(chǎn)氫延遲時(shí)間增加，但 是累積產(chǎn)氫量增加、比產(chǎn)量率增大、氫氣濃度提高，固定化能夠提升污泥細(xì)胞的耐沖擊負(fù)荷能力。實(shí)施例3通過(guò)添加厭氧菌瓊脂縮短了產(chǎn)氫延遲時(shí)間。實(shí)施例4添加Y-氧化鋁使瓊脂小球機(jī)械強(qiáng)度增大、持續(xù)產(chǎn)氫時(shí)間延長(zhǎng)、累積產(chǎn)氫量增加、氫氣濃度增大。實(shí)施例6、7是添加不同量的厭氧菌瓊脂，產(chǎn)氫能力都不如實(shí)施例4，添加量少則不利于縮短產(chǎn)氫延遲時(shí)間，添加量大則不利于瓊脂顆粒的機(jī)械強(qiáng)度。實(shí)施例10是混合液中瓊脂多、污泥少，形成的顆粒小球微生物負(fù)載量減少，累積產(chǎn)氫量降低。實(shí)施例11是混合液中瓊脂少、污泥多，不利于滴球成形?？傮w而言，添加適量的厭氧菌瓊脂和Y-氧化鋁能夠改善瓊脂包埋法固定化產(chǎn) 氫菌的產(chǎn)氫性能。
【權(quán)利要求】
1.瓊脂包埋法固定化污泥中產(chǎn)氫微生物的改性方法，其特征在于:添加厭氧菌瓊脂和Y-氧化鋁與普通瓊脂一起滴球成形，包括以下步驟: (1)普通瓊脂與厭氧菌瓊脂共同加熱溶解得到瓊脂溶液，所述的普通瓊脂與厭氧菌瓊脂質(zhì)量比為2:1~4:1 ; (2)將瓊脂溶液與預(yù)處理后的污泥混合均勻，所述的瓊脂溶液與預(yù)處理后的污泥體積比為2:3~3:2 ; (3)向混合液中加入Y-氧化鋁并攪拌均勻，添加的Y-氧化鋁的質(zhì)量為混合液的1.5~2.5% ； (4)用注射器吸取步驟(3)獲得的混合液，滴球成形； (5 )用無(wú)菌濾布濾出瓊脂顆粒后，用生理鹽水沖洗干凈備用。
2.按照權(quán)利要求1所述的改性方法，其特征在于:步驟(2)所得的混合液中瓊脂質(zhì)量濃度為2~3%。
3.按照權(quán)利要求1所述的改性方法，其特征在于:步驟(2)所用的污泥采用高溫法預(yù)處理，在8(T90°C恒溫水浴鍋中預(yù)處理0.5~lh，熱預(yù)處理可以去除產(chǎn)甲烷菌等耗氫菌并富集產(chǎn)氫菌。
4.按照權(quán)利要求1所述的改性方法，其特征在于:步驟(3)所述的用注射器吸取混合液滴球成形過(guò)程是將混合液滴入上層是液體石蠟、下層是水的量筒中，液體石蠟層高8~12cm。
5.按照權(quán)利要求1所述的改性方法，其特征在于:步驟(3)所述的用注射器吸取混合液，采用16G針頭的針筒式注射器，滴球能夠形成粒徑3~4_的瓊脂顆粒。
6.按照權(quán)利要求1所述的改性方法，其特征在于:步驟(4)所述的用生理鹽水沖洗瓊脂顆粒，生理鹽水質(zhì)量濃度為0.8%。
【文檔編號(hào)】C12N11/14GK103882001SQ201210563167
【公開(kāi)日】2014年6月25日 申請(qǐng)日期:2012年12月21日 優(yōu)先權(quán)日:2012年12月21日
【發(fā)明者】孫承林, 余麗, 于永輝, 于波, 楊旭, 蔣文天 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所