一種昆蟲性別調(diào)控構(gòu)建物，調(diào)控方法及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種具有調(diào)控昆蟲性別功能的轉(zhuǎn)基因構(gòu)建物。具體地，本發(fā)明所述的構(gòu)建物包括：?jiǎn)?dòng)子、doublesex基因、和終止子，還包括四環(huán)素阻遏反式激活蛋白編碼元件（TAV），并且所述元件插入在doublesex基因的第三個(gè)外顯子中。所述的構(gòu)建物在雌性昆蟲個(gè)體中特異表達(dá)四環(huán)素阻遏反式激活蛋白，導(dǎo)致雌性個(gè)體在發(fā)育早期死亡而雄性個(gè)體不受影響；通過在飼料中添食四環(huán)素來控制毒性蛋白的表達(dá)，從而建立了一種可調(diào)控昆蟲性別的轉(zhuǎn)基因系統(tǒng)。
【專利說明】一種昆蟲性別調(diào)控構(gòu)建物，調(diào)控方法及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物技術(shù)和發(fā)育調(diào)控領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及一種昆蟲性別調(diào)控構(gòu)建物，調(diào)控方法及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]專養(yǎng)雄蠶在蠶業(yè)生產(chǎn)上是一項(xiàng)非常重要的技術(shù)，因?yàn)樾坌Q繭的繭層率和鮮繭出絲率要比雌蠶繭高，而且雄蠶食桑量少，葉絲轉(zhuǎn)化率高；此外，雄蠶體質(zhì)強(qiáng)健，更容易飼養(yǎng)，而且雄蠶絲纖度細(xì)、凈度好，適于剿制高品位生絲。為此，世界各國(guó)科學(xué)家對(duì)專養(yǎng)雄蠶技術(shù)進(jìn)行了一系列的探索。
[0003]1975年俄羅斯科學(xué)家Strunnikov V.A.等運(yùn)用輻射誘變等技術(shù)手段，育成了家蠶性連鎖平衡致死系。在性連鎖平衡致死系內(nèi)自交，其后代雌雄性個(gè)體各有一半存活，使品系得以保持。當(dāng)平衡致死系的雄蟲與常規(guī)品系的雌蟲交配的后代只有雄蟲能夠存活，雌蟲全部致死，達(dá)到專養(yǎng)雄蠶的目的。1996年，浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院從俄羅斯科學(xué)院引進(jìn)了以家蠶性連鎖平衡致死系S-8、S-14，并開展了利用性連鎖平衡致死技術(shù)實(shí)現(xiàn)專養(yǎng)雄蠶的研究。經(jīng)10年攻關(guān)研究，創(chuàng)建了家蠶性連鎖平衡致死系細(xì)胞控制基因和導(dǎo)入方法(專利號(hào):ZL01132108.3)、回交改良家蠶性連鎖平衡致死系的方法(專利號(hào):ZL01126809.3)、一種雜交改良家蠶性連鎖平衡致死系性狀的方法(專利號(hào):200810061660.5)三項(xiàng)國(guó)家發(fā)明專利；建立了一個(gè)低成本的雄蠶雜交種繁育方法；育成了秋華X平30、華菁X平60等家蠶性連鎖平衡致死實(shí)用蠶品種，雄蠶率達(dá)99.8%，繭層率和出絲率比常規(guī)品種提高23%，綜合經(jīng)濟(jì)效￡fL提聞20%左右。
[0004]利用輻射處理等手段可以使雄蟲不育，然后通過大量飼養(yǎng)不育雄蟲并進(jìn)行野外釋放，不育雄蟲與自然種群中的雌蟲交配后不能產(chǎn)生后代，從而達(dá)到害蟲防治的目的。這種昆蟲不育技術(shù)(Sterile Insect Technique, SIT)在防治螺旋蠅、柑橘大實(shí)蠅等害蟲方面已經(jīng)取得了成功。但是該方法也存在著一些問題，如處理后的害蟲競(jìng)爭(zhēng)力差、大規(guī)模飼養(yǎng)成本高
坐寸ο
[0005]由于性連鎖平衡致死體系使用的家蠶品種是通過輻射突變所獲得，品種內(nèi)的染色體結(jié)構(gòu)和遺傳穩(wěn)定性存在著變異的可能。因此，本領(lǐng)域目前迫切需要開發(fā)新型技術(shù)來彌補(bǔ)性連鎖平衡致死系統(tǒng)的不足。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的就是提供一種昆蟲性別調(diào)控構(gòu)建物。
[0007]本發(fā)明的另一目的就是提供一種昆蟲性別調(diào)控方法及其應(yīng)用。
[0008]在本發(fā)明的第一方面，提供了一種轉(zhuǎn)基因構(gòu)建物，所述的構(gòu)建物具有下述元件:doublesex基因(雙性基因)和四環(huán)素阻遏反式激活蛋白編碼元件(TAV)，并且所述四環(huán)素阻遏反式激活蛋白編碼元件 (TAV)插入在doublesex基因(雙性基因)的選擇性剪切外顯子中。[0009]在另一優(yōu)選例中，所述四環(huán)素阻遏反式激活蛋白編碼元件(TAV)插入在doublesex基因(雙性基因)的第三個(gè)外顯子中。
[0010]在另一優(yōu)選例中，所述的構(gòu)建物還包括四環(huán)素結(jié)合序列(TetO)。
[0011]在另一優(yōu)選例中，所述的構(gòu)建物還包括選自下組的元件或其組合:啟動(dòng)子、終止子、POly(A)元件、轉(zhuǎn)運(yùn)元件、基因靶向元件、篩選標(biāo)記基因、增強(qiáng)子、抗性基因、轉(zhuǎn)座酶編碼基因。
[0012]在另一優(yōu)選例中，所述的doublesex基因來自鱗翅目昆蟲。
[0013]在另一優(yōu)選例中，所述的鱗翅目昆蟲包括(但不限于):家蠶、亞洲玉米螟、棉鈴蟲、或小菜蛾。
[0014]在另一優(yōu)選例中，所述的doublesex基因來自家蠶。
[0015]在另一優(yōu)選例中，所述的doublesex基因(雙性基因)具有SEQ ID NO:1所示的序列。
[0016]在另一優(yōu)選例中，所述的四環(huán)素阻遏反式激活蛋白編碼元件具有SEQ IDNO:2所示的序列。
[0017]在另一優(yōu)選例中，所述的篩選標(biāo)記基因?yàn)闊晒獾鞍拙幋a基因，優(yōu)選gfp(綠色熒光蛋白編碼基因、或DsRed紅色熒光蛋白編碼基因。
[0018]在另一優(yōu)選例中 ，所述的四環(huán)素結(jié)合序列(TetO)具有SEQ ID NO:3所示的序列。
[0019]在另一優(yōu)選例中，所述的doublesex基因與啟動(dòng)子或終止子可操作地連接。
[0020]在本發(fā)明的第二方面，提供了一種載體，所述載體含有第一方面所述的轉(zhuǎn)基因構(gòu)建物。
[0021]在另一優(yōu)選例中，所述載體選自:細(xì)菌質(zhì)粒、噬菌體、酵母質(zhì)粒、或動(dòng)物細(xì)胞載體、穿梭載體。
[0022]在另一優(yōu)選例中，所述的載體為轉(zhuǎn)座子載體。
[0023]在本發(fā)明的第三方面，提供了一種宿主細(xì)胞，所述的宿主細(xì)胞含有第一方面所述的構(gòu)建物或第二方面所述的載體，或所述的宿主細(xì)胞染色體整合有第一方面所述的構(gòu)建物或第二方面所述的載體。
[0024]在另一優(yōu)選例中，所述的宿主細(xì)胞還包括含有編碼轉(zhuǎn)座酶基因的載體或其染色體上整合有轉(zhuǎn)座酶基因。
[0025]在另一優(yōu)選例中，所述的宿主細(xì)胞為昆蟲細(xì)胞。
[0026]在另一優(yōu)選例中，所述的昆蟲為鱗翅目昆蟲，包括(但不限于):家蠶，亞洲玉米螟、棉鈴蟲、小菜蛾等。
[0027]在本發(fā)明的第四方面，提供了第一方面所述的構(gòu)建物，第二方面所述的載體，或第三方面所述的宿主細(xì)胞的用途，被用于昆蟲性別調(diào)控，或用于制備調(diào)控昆蟲性別的組合物。
[0028]在本發(fā)明的第五方面，提供了一種制備轉(zhuǎn)基因昆蟲的方法，包括步驟:
[0029](a)提供昆蟲細(xì)胞或昆蟲卵，所述昆蟲細(xì)胞或昆蟲卵含有權(quán)利要求1-3任一所述的構(gòu)建物或權(quán)利要求4所述的載體、或其染色體整合有權(quán)利要求1-3任一所述的構(gòu)建物或權(quán)利要求4所述的載體；
[0030](b)將步驟(a)所述的昆蟲細(xì)胞或昆蟲卵再生為昆蟲，從而獲得所述的轉(zhuǎn)基因昆蟲。[0031 ] 在另一優(yōu)選例中，所述的昆蟲為鱗翅目昆蟲。
[0032]在另一優(yōu)選例中，步驟(a)所述的宿主細(xì)胞為家蠶初產(chǎn)卵細(xì)胞。
[0033]在本發(fā)明的第六方面，提供了一種轉(zhuǎn)基因昆蟲，所述的轉(zhuǎn)基因昆蟲含有第三方面所述的宿主細(xì)胞，或所述的轉(zhuǎn)基因昆蟲染色體整合有第一方面所述的構(gòu)建物或第二方面所述的載體，或所述的轉(zhuǎn)基因昆蟲是由第三方面所述的宿主細(xì)胞再生而成的。
[0034]在另一優(yōu)選例中，所述的轉(zhuǎn)基因昆蟲是用第五方面所述的方法制備的。
[0035]在本發(fā)明的第七方面，提供了第六方面所述轉(zhuǎn)基因昆蟲的用途，所述的轉(zhuǎn)基因昆蟲用于:
[0036](1)生產(chǎn)蠶絲；
[0037](2)提高蠶繭繭層率；
[0038](3)提高葉絲轉(zhuǎn)化率；
[0039](4)提高蠶絲纖度；
[0040](5)提高蠶絲凈度； [0041](6)或其組合。
[0042]在本發(fā)明的第八方面，提供了一種調(diào)節(jié)昆蟲性別的方法，包括步驟:
[0043](a)提供昆蟲細(xì)胞或昆蟲卵，所述昆蟲細(xì)胞或昆蟲卵含有第一方面所述的構(gòu)建物或第二方面所述的載體、或其染色體整合有第一方面所述的構(gòu)建物或第二方面所述的載體，并所述的昆蟲細(xì)胞或昆蟲卵再生為昆蟲；
[0044](b)在缺乏四環(huán)素的條件下飼喂步驟(a)所述的昆蟲，獲得雄性昆蟲存活比例大于95%的昆蟲群。
[0045]在另一優(yōu)選例中，所述的昆蟲為鱗翅目昆蟲，優(yōu)選家蠶。
[0046]在另一優(yōu)選例中，所述的調(diào)節(jié)昆蟲性別為:提高雄性昆蟲在總昆蟲中的比例。
[0047]在另一優(yōu)選例中，步驟(b)獲得雄性昆蟲存活比例大于96% (優(yōu)選大于98%)的昆蟲群。
[0048]應(yīng)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文(如實(shí)施例)中具體描述的各技術(shù)特征之間都可以互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在
此不再一一累述。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0049]下列附圖用于說明本發(fā)明的具體實(shí)施方案，而不用于限定由權(quán)利要求書所界定的本發(fā)明范圍。
[0050]圖1:轉(zhuǎn)基因載體pBac-1ElDsRed2-tet0_tTA示意圖；DsRed表示作為分子標(biāo)記的紅色突光蛋白DsRed ；Tet0x7表示四環(huán)素結(jié)合序列；E1_E5表示doublesex基因的5個(gè)外顯子結(jié)構(gòu)；TAV表示四環(huán)素阻遏反式激活蛋白編碼序列，其位于doublesex基因的第3個(gè)外顯子內(nèi)部。
[0051]圖2:轉(zhuǎn)基因家蠶陽(yáng)性個(gè)體；圖2A:正常視野下的蠶卵；圖2B紅色熒光視野下的蠶卵。
[0052]圖3:死亡的雌性個(gè)體和正常發(fā)育的雄性個(gè)體；左側(cè)為死亡的個(gè)體，顏色較深；右側(cè)為正常發(fā)育的個(gè)體，顏色較淺?！揪唧w實(shí)施方式】
[0053]本發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入的研究，首次提供了一種具有調(diào)控昆蟲性別功能的轉(zhuǎn)基因構(gòu)建物。具體地，所述的構(gòu)建物包括:啟動(dòng)子、doublesex基因、和終止子，還包括四環(huán)素阻遏反式激活蛋白編碼元件(TAV)，并且所述元件插入在doublesex基因的第三個(gè)外顯子中。所述的構(gòu)建物在雌性昆蟲個(gè)體中特異表達(dá)四環(huán)素阻遏反式激活蛋白，導(dǎo)致雌性個(gè)體在發(fā)育早期死亡而雄性個(gè)體不受影響；通過在飼料中添食四環(huán)素來控制毒性蛋白的表達(dá)，從而建立了一種可調(diào)控昆蟲性別的轉(zhuǎn)基因系統(tǒng)。在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。
[0054]術(shù)語
[0055]如本文所用，術(shù)語“啟動(dòng)子”或“啟動(dòng)子區(qū)(域)”是指一種準(zhǔn)確有效起始基因轉(zhuǎn)錄功能的核酸序列，引導(dǎo)基因核酸序列轉(zhuǎn)錄為mRNA，其通常存在于目的基因編碼序列的上游(5，端)，一般地，啟動(dòng)子或啟動(dòng)子區(qū)域提供RNA聚合酶和正確起始轉(zhuǎn)錄所必需的其它因子的識(shí)別位點(diǎn)。
[0056]在本文中，所述啟動(dòng)子或啟動(dòng)子區(qū)(域)包括啟動(dòng)子的變體，啟動(dòng)子變體可以通過插入或刪除調(diào)控區(qū)域，進(jìn)行隨機(jī)或定點(diǎn)突變等來獲得。
[0057]如本文所用，“外源的”或“異源的”是指不同來源的兩條或多條核酸或蛋白質(zhì)序列之間的關(guān)系。例如，如果啟動(dòng)子與目的基因序列的組合通常不是天然存在的，則啟動(dòng)子對(duì)于該目的基因來說是外源的。特定序列對(duì)于其所插入的細(xì)胞或生物體來說是“外源的”。
[0058]如本文所用，“順式調(diào)控元件”是指對(duì)基因的轉(zhuǎn)錄起始和轉(zhuǎn)錄效率起調(diào)節(jié)作用的保守性堿基序列。
[0059]本發(fā)明的啟動(dòng)子可以被可操作地與外源基因連接，該外源基因相對(duì)于啟動(dòng)子而言可以是外源(異源)的。
[0060]本發(fā)明所述的外源基因(也稱為目的基因)優(yōu)選doublesex基因，與啟動(dòng)子或終止子可操作地連接。所述的doublesex基因優(yōu)選來自于鱗翅目昆蟲(如家蠶)，并具有SEQID NO:1所示的序列。
[0061]如本文所用，術(shù)語“鱗翅目昆蟲”沒有特別的限制，包括(但不限于):家蠶，亞洲玉米螟，棉鈴蟲，小菜蛾。
[0062]doublesex基因(雙性基因)
[0063]如本文所用，術(shù)語“doublesex基因”與“雙性基因”可以互換使用。doublesex基因是昆蟲性別決定機(jī)制中的最下游基因，在性別發(fā)育中起到重要作用。
[0064]編碼家蠶doublesex基因開放閱讀框的序列由5個(gè)外顯子組成,其中第3和第4外顯子在雌性中表達(dá)，而在雄性中不表達(dá)，從而在不同性別中由于性別特異性的選擇性剪接作用最終導(dǎo)致編碼不同的蛋白(見Suzuki etal, Dev Genes Evol.2003)。
[0065]在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選例中，doublesex基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.:1所示。應(yīng)理解，所述的doublesex基因還包括SEQ ID N0.:1所示核苷酸序列的活性片段，變體，或類似物。
[0066]所述的活性片段，變體， 或類似物可以是SEQ ID N0.:1所示核苷酸序列具有50%或以上(優(yōu)選60%以上，70%以上，80%以上，更優(yōu)選90%以上，更優(yōu)選95%以上，最優(yōu)選98%以上，如99%)同源性的具有相同或相似功能的核苷酸。核苷酸變體可以經(jīng)過若干個(gè)(通常為1-60個(gè)，較佳地1-30個(gè)，更佳地1-20個(gè)，最佳地1-10個(gè))取代、缺失或添加至少一個(gè)核苷酸所得的衍生序列，以及在5’末端和/或3’末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)(通常為20個(gè)以內(nèi)，較佳地為10個(gè)以內(nèi)，更佳地為5個(gè)以內(nèi))核苷酸。核苷酸變異體包括取代變異體、缺失變異體和插入變異體。如本領(lǐng)域所知的，等位變異體是一個(gè)多核苷酸的替換形式，它可能是一個(gè)或多個(gè)核苷酸的取代、缺失或插入，但不會(huì)從實(shí)質(zhì)上改變所述核苷酸的功能。
[0067]根據(jù)本文所述的核苷酸序列，本【技術(shù)領(lǐng)域】人員可方便地用各種已知方法制得本發(fā)明的編碼核酸。這些方法例如但不限于:PCR，DNA人工合成等，具體的方法可參見J.薩姆布魯克，《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》。作為本發(fā)明的一種實(shí)施方式，可通過分段合成核苷酸序列再進(jìn)行重疊延伸PCR的方法來構(gòu)建所述的核酸序列。
[0068]選擇性剪切外顯子
[0069]選擇性剪切外顯子是指doublesex基因的第三、四外顯子(SEQ ID N0:1的647位-904位)。doublesex基因的外顯子在不同性別昆蟲中有不同的剪切方式，在雄性昆蟲中，doublesex基因的第三、四外顯子會(huì)被剪切掉，而雌性昆蟲會(huì)保留。四環(huán)素阻遏反式激活蛋白編碼元件(TAV)如果插入到doublesex基因第三或第四外顯子中，在雄性昆蟲中，TAV會(huì)與doublesex基因第三或第四外顯子被選擇性剪切掉，TAV不表達(dá)，在雌性昆蟲中，doublesex基因第三或第四外顯子不被剪切，TAV表達(dá)。
[0070]四環(huán)素結(jié)合序列(TetO)與四環(huán)素阻遏反式激活蛋白編碼元件(TAV)的調(diào)控作用，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員均可以從常規(guī)途徑獲得所述技術(shù)方法和知識(shí)，如(Hinrichs etal, Science, 1994)。
[0071]轉(zhuǎn)基因構(gòu)建物 [0072]本發(fā)明提供了一種轉(zhuǎn)基因構(gòu)建物，所述的構(gòu)建物具有下述元件:doublesex基因(雙性基因)和四環(huán)素阻遏反式激活蛋白編碼元件(TAV)，并且所述四環(huán)素阻遏反式激活蛋白編碼元件(TAV)插入在doublesex基因(雙性基因)的選擇性剪切外顯子中。
[0073]優(yōu)選地，所述四環(huán)素阻遏反式激活蛋白編碼元件(TAV)插入在doublesex基因(雙性基因)的第三個(gè)外顯子中。
[0074]所述的構(gòu)建物還可以包括四環(huán)素結(jié)合序列(TetO);所述的四環(huán)素結(jié)合序列(TetO)具有SEQ ID NO: 3所示的序列。
[0075]在另一優(yōu)選例中，所述的構(gòu)建物還包括選自下組的元件或其組合:啟動(dòng)子、終止子、poly(A)元件、轉(zhuǎn)運(yùn)元件、基因靶向元件、篩選標(biāo)記基因、增強(qiáng)子、抗性基因、轉(zhuǎn)座酶編碼基因。
[0076]所述的篩選標(biāo)記基因優(yōu)選熒光蛋白編碼基因，更優(yōu)選gfp(綠色熒光蛋白編碼基因或DsRed紅色熒光蛋白編碼基因。
[0077]在另一優(yōu)選例中，所述的四環(huán)素阻遏反式激活蛋白編碼元件具有SEQ IDNO:2所示的序列。
[0078]載體，宿主細(xì)胞
[0079]本發(fā)明還提供了一種載體，所述載體含有本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因構(gòu)建物。優(yōu)選地，所述載體選自:細(xì)菌質(zhì)粒、噬菌體、酵母質(zhì)粒、或動(dòng)物細(xì)胞載體、穿梭載體；所述的載體為轉(zhuǎn)座子載體。用于制備重組載體的方法是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的。只要其能夠在宿主體內(nèi)復(fù)制和穩(wěn)定，任何質(zhì)粒和載體都是可以被米用的。[0080]本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以使用熟知的方法構(gòu)建含有本發(fā)明所述的啟動(dòng)子和/或目的基因序列的表達(dá)載體。這些方法包括體外重組DNA技術(shù)、DNA合成技術(shù)、體內(nèi)重組技術(shù)
坐寸ο
[0081]本發(fā)明還提供了一種宿主細(xì)胞，所述的宿主細(xì)胞含有所述的構(gòu)建物或載體，或所述的宿主細(xì)胞染色體整合有所述的構(gòu)建物或載體。在另一優(yōu)選例中，所述的宿主細(xì)胞還包括含有編碼轉(zhuǎn)座酶基因的載體或其染色體上整合有轉(zhuǎn)座酶基因。
[0082]優(yōu)選地，所述的宿主細(xì)胞為昆蟲細(xì)胞。在另一優(yōu)選例中，所述的昆蟲為鱗翅目昆蟲，包括(但不限于):家蠶，亞洲玉米螟，棉鈴蟲，小菜蛾等。
[0083]本發(fā)明的構(gòu)建物或載體，可以用于轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞。宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞，如大腸桿菌，鏈霉菌屬、農(nóng)桿菌:或是低等真核細(xì)胞，如酵母細(xì)胞；或是高等動(dòng)物細(xì)胞，如昆蟲細(xì)胞。本領(lǐng)域一般技術(shù)人員都清楚如何選擇適當(dāng)?shù)妮d體和宿主細(xì)胞。用重組DNA轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞可用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)技術(shù)進(jìn)行。當(dāng)宿主為原核生物(如大腸桿菌)時(shí)，可以用CaCl2法處理，也可用電穿孔法進(jìn)行。當(dāng)宿主是真核生物，可選用如下的DNA轉(zhuǎn)染方法:磷酸鈣共沉淀法，常規(guī)機(jī)械方法(如顯微注射、電穿孔、脂質(zhì)體包裝等)。轉(zhuǎn)化植物也可使用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化或基因槍轉(zhuǎn)化等方法，例如葉盤法、幼胚轉(zhuǎn)化法、花芽浸泡法等。
[0084]應(yīng)用
[0085]本發(fā)明還提供了一種制備轉(zhuǎn)基因昆蟲的方法，包括步驟:提供本發(fā)明所述的轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞(優(yōu)選家蠶初產(chǎn)卵細(xì)胞)；將所述的宿主細(xì)胞再生為昆蟲，從而獲得所述的轉(zhuǎn)基因昆蟲。所述的昆蟲優(yōu)選為鱗翅目昆蟲。
[0086]本發(fā)明還提供了一 種用上述方法制備的一種轉(zhuǎn)基因昆蟲。并且所述的轉(zhuǎn)基因昆蟲可以用于:生廣香絲；提聞香苗苗層率；提聞葉絲轉(zhuǎn)化率；提聞香絲纖度；提聞香絲凈度；或其組合。
[0087]本發(fā)明還提供了一種調(diào)節(jié)昆蟲性別的方法，包括步驟:獲得本發(fā)明所述的轉(zhuǎn)基因昆蟲；在缺乏四環(huán)素的條件下飼喂所述的昆蟲，獲得雄性昆蟲存活比例大于95%，優(yōu)選大于96%，更優(yōu)選大于98%的昆蟲群。在另一優(yōu)選例中，所述的調(diào)節(jié)昆蟲性別為:提高雄性昆蟲在總昆蟲中的比例。
[0088]在本方面的一個(gè)具體實(shí)施例中，將本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因載體與可表達(dá)轉(zhuǎn)座酶的輔助質(zhì)?；旌虾笸ㄟ^顯微注射導(dǎo)入原胚期蠶卵，25°C條件下保護(hù)至孵化。孵化后的蟻蠶飼養(yǎng)至成蟲后，自交或回交獲得Gl代蠶卵，在Gl代胚胎發(fā)育后期(6-8天)在熒光顯微鏡下篩選出全身表達(dá)紅色熒光的轉(zhuǎn)基因個(gè)體。
[0089]Gl代轉(zhuǎn)基因個(gè)體飼養(yǎng)至成蟲后與正常個(gè)體回交得到G2代轉(zhuǎn)基因雜合個(gè)體。G2代轉(zhuǎn)基因雜合個(gè)體采用兩種方式飼養(yǎng):1.在飼料中添加四環(huán)素，雌性和雄性都可以正常發(fā)育。2.飼料中不添加四環(huán)素，雌性個(gè)體在幼蟲早期死亡，而雄性個(gè)體發(fā)育不受影響。
[0090]本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)在于:
[0091](I)本發(fā)明通過建立轉(zhuǎn)基因昆蟲品系，在雌性個(gè)體中特異表達(dá)四環(huán)素阻遏反式激活蛋白，導(dǎo)致雌性個(gè)體在發(fā)育早期死亡而雄性個(gè)體不受影響；
[0092](2)通過在飼料中添食四環(huán)素來控制毒性蛋白的表達(dá)，是一種可調(diào)控的轉(zhuǎn)基因系統(tǒng)，便于建立純和保持品系；
[0093](3)本發(fā)明首次利用轉(zhuǎn) 基因手段開發(fā)出雌性致死的轉(zhuǎn)基因家蠶品系，雌性致死的作用機(jī)制清晰；
[0094](4)本發(fā)明突破了以往通過傳統(tǒng)育種方法選育費(fèi)時(shí)費(fèi)力，且作用機(jī)制不明了的瓶頸；
[0095](5)本發(fā)明不僅可在蠶業(yè)生產(chǎn)中發(fā)揮重要的作用，也可推廣到害蟲特別是鱗翅目害蟲的遺傳防治，為害蟲防治提供新的途徑。
[0096]下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如 Sambrook 等人，分子克隆:實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress, 1989)中所述的條件,或按照制造廠商所建議的條件。
[0097]實(shí)施例1
[0098]家蠶雌性特異致死轉(zhuǎn)基因系統(tǒng)的構(gòu)建
[0099]1.PBac-1ElDsRed2-tet0-tTA 轉(zhuǎn)基因載體的構(gòu)建
[0100]本實(shí)施例采用的PBaC-1ElDSRed2-tet0-tTA轉(zhuǎn)基因載體是基于廣泛應(yīng)用于昆蟲轉(zhuǎn)基因研究的 Piggybac 轉(zhuǎn)座子(Piggybac 轉(zhuǎn)座子見 Fraser et al., Insect MolecularBiology, 1996)加以改造完成的。
[0101]首先在Piggybac轉(zhuǎn)座子載體中導(dǎo)入了由IEl啟動(dòng)子(Kojima etal, VirusResearch, 2008)驅(qū)動(dòng)的色突光蛋白DsRed (DsRed基因序列如SEQ ID NO:4所示)，構(gòu)建成為pBac-1ElDSRed2轉(zhuǎn)基因載體。成功轉(zhuǎn)入此載體后，轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性個(gè)體從胚胎后期可以全身表達(dá)紅色熒光，便于篩選。
[0102]克隆來自家蠶的doublesex基因(doublesex基因序列如SEQ ID N0:1所示)，并將編碼四環(huán)素阻遏反式激活蛋白TAV的DNA序列(TAV的DNA序列如SEQ IDNO:2所示)插入doublesex基因的第三個(gè)外顯子內(nèi)(第三個(gè)外顯子的序列如SEQID NO:5所示)，插入位點(diǎn)為第三個(gè)外顯子的第44位-第45位之間，構(gòu)成了一個(gè)融合基因(融合基因序列為SEQ IDNO:6)。
[0103]由于性別特異的基因選擇性剪接作用(雄性中表達(dá)doublesex基因不需要第三外顯子的介入)，轉(zhuǎn)基因雌性個(gè)體將完整表達(dá)TAV，而雄性個(gè)體則不表達(dá)。
[0104]在TAV和doublesex融合基因的上游導(dǎo)入了四環(huán)素結(jié)合序列TetO (TetO的序列如SEQ ID NO:3所示)，最終構(gòu)建了目的轉(zhuǎn)基因載體PBac-1ElDsRed2-tet0-tTA (圖1)。
[0105]實(shí)施例2
[0106]轉(zhuǎn)基因系統(tǒng)的建立
[0107]將實(shí)施例1制備的轉(zhuǎn)基因載體pBac-1ElDsRed2-tet0_tTA與可表達(dá)Piggybac轉(zhuǎn)座酶的質(zhì)粒 PHA3PIG (該質(zhì)粒見 Tamura et al., Nature Biotechnology, 2000)等量混合后注射到家蠶初產(chǎn)卵(產(chǎn)下后4-8小時(shí))中。
[0108]注射質(zhì)粒的純化采用Qiagen公司的Plasmid Midi kit試劑盒,蠶卵的注射方法參照Kanda & Tamura (1991)描述的方法進(jìn)行顯微注射,注射后的蠶卵用無毒速干膠封口。注射后的蠶卵放在保濕盒子中，在25°C條件下進(jìn)行催青直到孵化。
[0109]孵化后收集蟻蠶用桑葉飼養(yǎng)至上 簇結(jié)繭，蛹期25°C條件下保護(hù)至化蛾后，將當(dāng)代(GO)的蠶蛾自交后，獲得Gl代蠶卵。在Gl代蠶卵的胚胎發(fā)育后期利用熒光顯微鏡下挑出具有紅色熒光的轉(zhuǎn)基因個(gè)體進(jìn)行飼養(yǎng)(圖2)。[0110]發(fā)明人共注射了 768粒家蠶卵(G0代)，孵化了 492頭，最終發(fā)育到成蟲正常交配后得到的卵圈有95個(gè)(Gl代)。在這些卵的發(fā)育后期檢測(cè)到12個(gè)卵圈具有陽(yáng)性個(gè)體(紅色熒光)。通過進(jìn)一步的確認(rèn)，挑選其中三個(gè)品系實(shí)施了下一步的試驗(yàn)，在這三個(gè)獨(dú)立品系中得到的結(jié)果具有非常高的重復(fù)性。
[0111]實(shí)施例3
[0112]雌性特異性致死效果的鑒定
[0113]鑒定方法:
[0114]雌性特異性致死效果可以通過如下步驟進(jìn)行鑒定:在桑葉上噴灑濃度為200 μ g/μ I四環(huán)素水溶液，喂食轉(zhuǎn)基因家蠶，在此條件下轉(zhuǎn)基因家蠶無論雌雄都可以正常發(fā)育；而如果在桑葉上不添加四環(huán)素喂食轉(zhuǎn)基因家蠶，則有一半左右的家蠶會(huì)再幼齡期死亡(圖3)。而死亡的幼蟲經(jīng)PCR檢測(cè)，未擴(kuò)增出雄性特異條帶，可判斷為雌性。
[0115]而作為對(duì)照，非轉(zhuǎn)基因家蠶在喂食了添加200μ g/μ I四環(huán)素水溶液或無添加四環(huán)素水溶液后對(duì)發(fā)育無不良影響。
[0116]在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考 那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
【權(quán)利要求】
1.一種轉(zhuǎn)基因構(gòu)建物，其特征在于，所述的構(gòu)建物具有下述元件:doublesex基因(雙性基因)和四環(huán)素阻遏反式激活蛋白編碼元件(TAV)，并且所述四環(huán)素阻遏反式激活蛋白編碼元件(TAV)插入在doublesex基因(雙性基因)的選擇性剪切外顯子中。
2.如權(quán)利要求1所述的構(gòu)建物，其特征在于，所述四環(huán)素阻遏反式激活蛋白編碼元件(TAV)插入在doublesex基因(雙性基因)的第三個(gè)外顯子中。
3.如權(quán)利要求1所述的構(gòu)建物，其特征在于，所述的構(gòu)建物還包括四環(huán)素結(jié)合序列(TetO)。
4.一種載體，其特征在于，所述載體含有權(quán)利要求1-3任一所述的轉(zhuǎn)基因構(gòu)建物。
5.一種宿主細(xì)胞，其特征在于，所述的宿主細(xì)胞含有權(quán)利要求1-3任一所述的構(gòu)建物或權(quán)利要求4所述的載體，或所述的宿主細(xì)胞染色體整合有權(quán)利要求1-3任一所述的構(gòu)建物或權(quán)利要求4所述的載體。
6.權(quán)利要求1所述的構(gòu)建物，權(quán)利要求4所述的載體，或權(quán)利要求5所述的宿主細(xì)胞的用途，其特征在于，被用于昆蟲性別調(diào)控，或用于制備調(diào)控昆蟲性別的組合物。
7.一種制備轉(zhuǎn)基因昆蟲的方法，其特征在于，包括步驟: (a)提供昆蟲細(xì)胞或昆蟲卵，所述昆蟲細(xì)胞或昆蟲卵含有權(quán)利要求1-3任一所述的構(gòu)建物或權(quán)利要求4所述的載體、或其染色體整合有權(quán)利要求1-3任一所述的構(gòu)建物或權(quán)利要求4所述的載體； (b)將步驟(a)所述的昆蟲細(xì)胞或昆蟲卵再生為昆蟲，從而獲得所述的轉(zhuǎn)基因昆蟲。
8.—種轉(zhuǎn)基因昆蟲，其特征在于，所述的轉(zhuǎn)基因昆蟲含有權(quán)利要求5所述的宿主細(xì)胞，或所述的轉(zhuǎn)基因昆蟲染色體整合有權(quán)利要求1-3任一所述的構(gòu)建物或權(quán)利要求4所述的載體，或所述的轉(zhuǎn)基因昆蟲是由權(quán)利 要求5所述的宿主細(xì)胞再生而成的。
9.權(quán)利要求8所述轉(zhuǎn)基因昆蟲的用途，其特征在于，所述的轉(zhuǎn)基因昆蟲用于: (1)生產(chǎn)蠶絲； (2)提聞香苗苗層率； (3)提高葉絲轉(zhuǎn)化率； (4)提高蠶絲纖度； (5)提高蠶絲凈度； (6)或其組合。
10.一種調(diào)節(jié)昆蟲性別的方法，其特征在于，包括步驟: (a)提供昆蟲細(xì)胞或昆蟲卵，所述昆蟲細(xì)胞或昆蟲卵含有權(quán)利要求1-3任一所述的構(gòu)建物或權(quán)利要求4所述的載體、或其染色體整合有權(quán)利要求1所述的構(gòu)建物或權(quán)利要求4所述的載體，并所述的昆蟲細(xì)胞或昆蟲卵再生為昆蟲； (b)在缺乏四環(huán)素的條件下飼喂步驟(a)所述的昆蟲，獲得雄性昆蟲存活比例大于95%的昆蟲群。
【文檔編號(hào)】C12N5/10GK103882013SQ201210559254
【公開日】2014年6月25日 申請(qǐng)日期:2012年12月20日 優(yōu)先權(quán)日:2012年12月20日
【發(fā)明者】黃勇平, 譚安江, 孟智啟, 牛寶龍, 尤朗 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院