專利名稱：一種扁座殼孢發(fā)酵生產(chǎn)蛋白酶的培養(yǎng)基及方法
技術領域：
本發(fā)明涉及真菌的發(fā)酵培養(yǎng)基及工藝。更具體地，本發(fā)明涉及一種扁座殼孢發(fā)酵生產(chǎn)蛋白酶的培養(yǎng)基及方法。
背景技術：
蛋白酶是一類可以催化蛋白質水解反應的酶，它廣泛存在于各種生物體中，不僅對生物體蛋白質的新陳代謝起調節(jié)作用，從 細胞水平、器官水平和機體水平，呈現(xiàn)多種多樣的功能。它們參與細胞的正常生理以及異常的病理條件下的諸如蛋白質水解、細胞生長和遷移、酶原激活、激素釋放等各種復雜的過程(汪章勛等，2005)。蛋白酶在食品、化工、醫(yī)療、農(nóng)業(yè)、環(huán)保等許多方面發(fā)揮重要的作用，例如可用做生物農(nóng)藥的蟲生真菌，其蛋白酶活力與其毒力密切相關(Paoletti，200)。扁座殼孢(Aschersonia placenta)是一類重要的蟲生真菌,隸屬于子囊菌門、糞菌綱、肉座菌目、麥角菌科、座殼孢屬，在對粉虱、介殼蟲等一些刺吸式口器害蟲的自然控制中發(fā)揮著重要作用，具有可持續(xù)大面積控制害蟲，對環(huán)境影響小等優(yōu)點，是一種很有潛力的資源菌(邱君志等，2004)。國外也有許多國家在用扁座殼孢防治粉虱均取得上成功，如荷蘭、捷克斯洛伐克用芽生孢子通過液體發(fā)酵培養(yǎng)進行小規(guī)模試驗生產(chǎn)，以防治白粉虱，也取得了成功(邱君志等，2005)。迄今為止，有些國家已經(jīng)開發(fā)出粉虱扁座殼孢菌的制劑，并將其商業(yè)化，用于粉虱的防治(李增智等，1987)。扁座殼孢菌作為微生物農(nóng)藥具有對生態(tài)環(huán)境影響小、成本低、選擇性強、對人畜安全等特點，具有光明的前景(邱君志等，2004)，但是它還具有殺蟲效果慢、受外界條件影響大等缺點，因此必須對其作用于害蟲的機理進行深入研究，進而取得能克服上述兩個缺點的優(yōu)良菌株以應用于生產(chǎn)運用中。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種扁座殼孢發(fā)酵生產(chǎn)蛋白酶的培養(yǎng)基及方法。本發(fā)明首先提供了一種扁座殼孢發(fā)酵生產(chǎn)蛋白酶的培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基的原料含麩皮或者甘油lw%，酵母粉或者酵母膏I w %，Mn2+或者Mg2+4X10_4mol/L，培養(yǎng)基初始pH=7. 0_9· O ο更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基的原料按重量分數(shù)計，含有1%果糖，1%酵母粉，4X 10_4mol/L Mg2+，pH 8· O。其次，本發(fā)明還提供了一種扁座殼孢發(fā)酵生產(chǎn)蛋白酶的方法，所述方法包含以下步驟
(a)將扁座殼孢接種種子培養(yǎng)基，制得發(fā)酵種子液；
(b)將步驟(a)中制得的發(fā)酵種子液按接種于所述的培養(yǎng)基，250mL的三角瓶裝液量為150mL，接種量8mL，于26°C，轉速160 r/min下培養(yǎng)。所述種子培養(yǎng)基的原料含有按培養(yǎng)基重量計算，20% 土豆汁1L，葡萄糖20g，自然pH。本發(fā)明采用的座殼孢為扁座殼孢(何學友等，油茶黑膠粉虱及扁座殼孢對其自然控制作用，中國森林病蟲，2011年7月)。采用本發(fā)明優(yōu)化后的培養(yǎng)基，菌齡5d，發(fā)酵周期10d，發(fā)酵產(chǎn)生結果扁座殼孢產(chǎn)蛋白酶為80U/mL以上。本發(fā)明的有益效果本發(fā)明的發(fā)酵方法有發(fā)酵周期短；條件溫和，易于控制；提供的用于扁座殼孢發(fā)酵生產(chǎn)蛋白酶的培養(yǎng)基，具有蛋白酶產(chǎn)率高，蛋白酶活力高等優(yōu)點。


圖1不同濃度的酪氨酸標準溶液標準曲線。 圖2不同碳源對產(chǎn)蛋白酶的影響。圖3不同氮源對產(chǎn)蛋白酶的影響。圖4不同金屬離子對產(chǎn)蛋白酶的影響。圖5不同維生素對產(chǎn)蛋白酶的影響。圖6不同初始pH對產(chǎn)蛋白酶的影響。圖7不同培養(yǎng)時間對產(chǎn)蛋白酶的影響。
具體實施例方式本發(fā)明用下列實施例來進一步說明本發(fā)明，但本發(fā)明的保護范圍并不限于下列實施例。實施例1
單因素實驗確定培養(yǎng)基最優(yōu)成分
(I)種子培養(yǎng)基和基礎培養(yǎng)基配制
(a)20% 土豆汁1L，葡萄糖20g，自然pH。分裝于250mL的三角瓶，每個三角瓶含150mL。1. OlMPa，滅菌20min。使用前可加入抗生素對培養(yǎng)基預處理。(b)基礎培養(yǎng)基(液體誘導培養(yǎng)基，w/v) 0. 5%明膠、1. l%Na2HP04 · 12H20、1. 2%NaH2P04 · 2Η20、ρΗ6· 5。(2)發(fā)酵種子的制作將扁座殼孢接種于馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基上，于27°C下培養(yǎng)5d，待其產(chǎn)孢子，即活化；將活化后的菌株用接種針將孢子粉接種至種子培養(yǎng)基，26°C，轉速160r/min下培養(yǎng)10d，即為發(fā)酵液。(3)酶液的制備取步驟(2)下的發(fā)酵液在4°C下，5000 r/min離心，15min，得上清液即為粗酶液待用。按酶活性測定在在波長275nm處測定吸光值。換算成酶活單位U/
mLo(4)蛋白酶酶活測定取Iml酶液在60°C水浴5min，加入三氯乙酸搖勻，將其放入40°C水浴IOmin,再加酪素Iml靜置IOmin過濾,定容至IOml,作為對照。再取Iml酶液加酪素Iml在40°C水浴IOmin,加入三氯乙酸2ml搖勻靜置IOmin過濾,定容至IOml,在275nm波長下測紫外吸光度。酶活力(U/g或U/mL) =AXKXVXn/(tXm) (A為樣品的吸光度；K為吸光常數(shù)為反應試劑的總體積；n為酶液的稀釋倍數(shù)；t為反應時間；m為酶液質量或體積，g或mL)。
(5)標準曲線的制作在0-10(^8/1^范圍內(nèi)，以27511111處的吸光值為橫坐標(父)、酪氨酸的濃度為縱坐標(Y)制定標準曲線。具體步驟如下
a.用超純水配置濃度為10、20、30、40、50、60、70、80、90和100 μ g/mL的酪氨酸。b.測定反應液在275nm處的吸光值，在上述反應體系中以超純水取代酪氨酸為空白對照。試驗設置3個重復，其平均值用于制作標準曲線。結果見圖1。(6)不同碳源、氮源、金屬離子、pH、培養(yǎng)時間對產(chǎn)蛋白酶的影響
(a)碳源對酶產(chǎn)量的影響，在基礎液體培養(yǎng)基中分別加入1%蛋白胨和1%供篩選碳源葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、甘油、麥麩、玉米粉。進行接種搖瓶培養(yǎng)，于26°C，轉速160 r/min下培養(yǎng)，10d，取發(fā)酵液檢測酶活。以基礎液體培養(yǎng)基的蛋白酶活力作為對照，根據(jù)實驗數(shù)據(jù)選擇 對產(chǎn)酶最有利的碳源。結果見圖2。(b)氮源對酶產(chǎn)量的影響，在基礎液體培養(yǎng)基中分別加入1%麩皮和1%的供篩選氮源硫酸銨、蛋白胨、氯化銨、酵母膏、明膠、牛肉浸膏、酵母浸粉、碳酸氫銨。進行接種搖瓶培養(yǎng)，于26°C，轉速160 r/min下培養(yǎng)，10d，取發(fā)酵液檢測酶活。以基礎液體培養(yǎng)基的蛋白酶活力作為對照，根據(jù)實驗數(shù)據(jù)選擇對產(chǎn)酶最有利的氮源。結果見圖3。(C)金屬離子對產(chǎn)酶的影響,在基礎液體培養(yǎng)基中分別加入4X 10_4mol/l的供篩選 Ca2+、K+、Mg2+、Mn2+、Zn2+、Fe2+。進行接種搖瓶培養(yǎng)，于 26°C，轉速 160 r/min 下培養(yǎng)，10d，取發(fā)酵液檢測酶活。以基礎液體培養(yǎng)基的蛋白酶活力作為對照，根據(jù)實驗數(shù)據(jù)選擇對產(chǎn)酶最有利的金屬離子。結果見圖4。(d)維生素對酶產(chǎn)量的影響，在基礎液體培養(yǎng)基中分別加入O. 01%的供篩選的維生素B1、維生素B2、維生素B6、維生素E和維生素C。進行接種搖瓶培養(yǎng)，于26°C，轉速160r/min下培養(yǎng)，10d，取發(fā)酵液檢測酶活。以基礎液體培養(yǎng)基的蛋白酶活力作為對照，根據(jù)實驗數(shù)據(jù)選擇對產(chǎn)酶最有利的維生素。結果見圖5。(e)pH對酶產(chǎn)量的影響，把基礎液體培養(yǎng)基的pH分別用用O. lmol/L NaOH或HCl調至5、6、7、8、9，0進行接種搖瓶培養(yǎng)，于26°C，轉速160 r/min下培養(yǎng)，10d，取發(fā)酵液檢測酶活。以基礎液體培養(yǎng)基的蛋白酶活力作為對照，根據(jù)實驗數(shù)據(jù)選擇對產(chǎn)酶最有利的初始pH值。結果見圖6。(f)培養(yǎng)時間對產(chǎn)酶的影響，將扁座殼孢菌絲接到基礎液體培養(yǎng)基中，進行接種搖瓶培養(yǎng)，每天測一次發(fā)酵液中蛋白酶酶活至蛋白酶酶活連續(xù)兩天出現(xiàn)下降為止，以確定最佳的發(fā)酵培養(yǎng)時間。結果見圖7。實驗結果
從圖2可知，加入各種不同碳源的培養(yǎng)基均有助于扁座殼孢產(chǎn)蛋白酶，其中麥麩最利于產(chǎn)酶，其次是甘油，加入麥芽糖和葡萄糖對產(chǎn)酶的提高作用不明顯。由圖3可見，在培養(yǎng)基中加入不同的氮源對該菌產(chǎn)蛋白酶影響較大。有機氮都可以促進產(chǎn)酶，其中酵母膏的作用最強，其次是酵母粉和蛋白胨；然而，無機氮對該菌產(chǎn)酶有不同程度的抑制作用，其中硫酸銨的抑制作用最明顯。從圖4可以看出只有加入Mg2+的培養(yǎng)基有利于蛋白酶的活性增強，其余金屬離子均在不同程度上抑制該菌產(chǎn)生蛋白酶，其中Zn2+的抑制作用最大。從圖5可以看出，加入VB1、VB2、VB6、VE和^這5種不同維生素的培養(yǎng)基都不利于扁座殼孢產(chǎn)蛋白酶。其中，VB6對該菌產(chǎn)酶的抑制作用最強。
從圖6可以看出，不同的初始pH對產(chǎn)酶存在不同程度的影響。當培養(yǎng)基的初始pH為8. O時，該菌所產(chǎn)的蛋白酶活性最高，pH為9. O時酶活急劇下降，因此該酶可能是堿性的。從圖7可以看出，在前期試驗基礎上，結果表明扁座殼孢培養(yǎng)5d后，有一定的酶活力；在5-9d內(nèi)酶活力緩慢升高，而在flOd是迅速升高，并且在培養(yǎng)至第IOd時酶的活力最高；此后隨著時間的延長，酶的活力開始緩慢下降。隨著時間的變化，其酶活力的變化如圖7所示。實施例2 正交實驗確定最優(yōu)發(fā)酵條件 (O正交實驗確定最佳培養(yǎng)基
根據(jù)以上的實驗結果，選擇蛋白酶活最高的兩個碳源因素(麩皮和甘油)，選擇蛋白酶活最高的兩個氮源因素(酵母浸粉和酵母膏)以及兩個蛋白酶活最高的金屬離子(Mg2+和Mn2+)選擇正交進行正交試驗。以酶活力高低作為指標，通過正交設計確定最佳碳源、氮源和金屬離子。為了避免累贅實施例中的培養(yǎng)基配法、粗酶液的制作、酶活測定方法均與實施例I的方法相同。表I扁座殼孢蛋白酶四因子二水平(24)正交實驗設計
水平1-源aMii B金■離子C I
1I 曾油鮮母浸粉
2I S酵母膏I
表2扁座殼孢蛋白酶四因子二水平(24)正交實驗設計實驗結果
--]-1--1--τ---)
辤旮；ABCSlSAiUinL I|
1III53'54;1ΠI
2I2213,10:121|
52I261.99=5.17|
422I56.38r4.09|
.................................................................................................................................................................................................-·...............................................................-.........................................................................................................................................................................-4
Kl 199.92 346.59 329.76|
-------------Better factors and level shown I
K2 355.11 20S..14 225.2^|
----as follows; A2. BLCl I
R 155.19 138,15 104.49|
注Kl為各因素水平I的所有酶活力之和，K2為各因素水平2的所有酶活力之和，K3為各因素水平3的所有酶活力之和，K4為各因素水平4的所有酶活力之和，R為極差，酶活力的數(shù)字代表3次重復的平均值(mean) 土標準差(S. D)。由表I和表2可知，3個培養(yǎng)基條件(碳源、氮源和金屬離子)對扁座殼孢蛋白酶的產(chǎn)生具有不同程度的影響。表2中的R值表明碳源(155. 19)是一個比其他培養(yǎng)基條件更重要的因素，其次是氮源(138. 15)，對產(chǎn)酶影響最小的培養(yǎng)基因素是金屬離子(104.49)。正交分析表明最適合該酶產(chǎn)生的培養(yǎng)基條件為A2, B1, C1 (碳源為麩皮，氮源為酵母粉，金屬離子為Mg2+)。(2)正交實驗確定最優(yōu)培養(yǎng)條件
分別選擇三個蛋白酶活最高的菌齡、接種量、培養(yǎng)時間和通氣量，并對其選擇正交進行正交試驗。以酶活力高低作為指標，通過正交設計確定最優(yōu)的菌齡、接種量、培養(yǎng)時間和通氣量。為了避免累贅實施例中的培養(yǎng)基配法、粗酶液的制作、酶活測定方法均與實施例1的方法相同。表3扁座殼孢蛋白酶四因子三水平(34)正交實驗
權利要求
1.一種扁座殼孢發(fā)酵生產(chǎn)蛋白酶的培養(yǎng)基，其特征在于，所述培養(yǎng)基的原料含有麩皮或者甘油lwt%，酵母粉或者酵母膏I wt%，Mn2+或者Mg2+4X 10_4mOl/L，培養(yǎng)基初始pH=7. 0_9· O ο
2.根據(jù)權利要求1所述的扁座殼孢發(fā)酵生產(chǎn)蛋白酶的培養(yǎng)基，其特征在于，所述培養(yǎng)基的原料按重量分數(shù)計，含有1%果糖，1%酵母粉，4Χ 10_4mol/L Mg2+，pH 8. O。
3.一種扁座殼孢發(fā)酵生產(chǎn)蛋白酶的方法，其特征在于，所述方法包含以下步驟 Ca)將扁座殼孢接種種子培養(yǎng)基，制得發(fā)酵種子液； (b)將步驟(a)中制得的發(fā)酵種子液按接種于權利要求1或2所述的培養(yǎng)基，250mL的三角瓶裝液量為150mL，接種量8mL，于26°C，轉速160 r/min下培養(yǎng)。
4.根據(jù)權利要求3所述的扁座殼孢發(fā)酵生產(chǎn)蛋白酶的方法，其特征在于，所述種子培養(yǎng)基的原料含有按培養(yǎng)基重量算，20% 土豆汁1L，葡萄糖20g，自然pH。
全文摘要
本發(fā)明涉及真菌的發(fā)酵培養(yǎng)基及工藝。更具體地，本發(fā)明涉及一種扁座殼孢發(fā)酵生產(chǎn)蛋白酶的培養(yǎng)基及方法。所述培養(yǎng)基的原料含有麩皮1wt%，酵母粉1wt%，Mg2+4×10-4mol/L，培養(yǎng)基初始pH=7.0-9.0。該方法通過將發(fā)酵種子液按接種于培養(yǎng)基，250mL的三角瓶裝液量為150mL，接種量8mL，于26℃，轉速160r/min下培養(yǎng)。本發(fā)明的發(fā)酵方法有發(fā)酵周期短；條件溫和，易于控制；提供的用于扁座殼孢發(fā)酵生產(chǎn)蛋白酶的培養(yǎng)基，具有蛋白酶產(chǎn)率高，蛋白酶活力高等優(yōu)點。
文檔編號C12N9/58GK103013962SQ201210543640
公開日2013年4月3日 申請日期2012年12月17日 優(yōu)先權日2012年12月17日
發(fā)明者邱君志, 蘇禮超, 李小霞, 涂潔, 宋飛飛, 邱云鋒, 郭慶豐, 何肖云, 毛麗慧, 張偉 申請人:福建農(nóng)林大學