專利名稱：一種骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的體外擴(kuò)增純化培養(yǎng)方法及培養(yǎng)基的制作方法
一種骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的體外擴(kuò)增純化培養(yǎng)方法及培養(yǎng)基技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明要求保護(hù)一種利于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外擴(kuò)增純化培養(yǎng)方法，以及在培養(yǎng)過程中所用的細(xì)胞培養(yǎng)基。
背景技術(shù)：
骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在適當(dāng)?shù)臈l件刺激下可分化為成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞等細(xì)胞類型，而且易于分離培養(yǎng)，具有較強(qiáng)的自我更新、分化能力和免疫抑制等優(yōu)點，使其在組織器官缺損性疾病、組織器官退行性疾病以及細(xì)胞治療和組織工程領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用前景。近來有眾多的國內(nèi)外研究探索骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的體外分離和培養(yǎng)方法，主要有貼壁分離、密度梯度離心和細(xì)胞分選等方法，結(jié)果顯示通過貼壁傳代分離的細(xì)胞純度低，梯度離心和細(xì)胞分選可獲得較高純度的細(xì)胞，而細(xì)胞活力相對較低，且所需骨髓量較大，影響后續(xù)的研究和應(yīng)用。而且通過這些方法獲得的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在傳代培養(yǎng)過程中逐漸失去增殖分化能力。近來有文獻(xiàn)報道將一些細(xì)胞因子應(yīng)用于干細(xì)胞相關(guān)的研究中，對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的體外生長具有一定的生物學(xué)效應(yīng)。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的一種利于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外擴(kuò)增純化培養(yǎng)方法，以及在培養(yǎng)過程中所用的細(xì)胞培養(yǎng)基。
本發(fā)明采用的技術(shù)方案是一種骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的體外擴(kuò)增純化培養(yǎng)方法，所述方法包括取骨髓細(xì)胞，經(jīng)篩網(wǎng)過濾后的單細(xì)胞懸液接種于培養(yǎng)皿中進(jìn)行貼壁培養(yǎng)，初始接種密度2飛X IO6個/mL (優(yōu)選約為5X IO6個/mL)細(xì)胞培養(yǎng)基，培養(yǎng)3飛小時(優(yōu)選為3小時)后更換細(xì)胞培養(yǎng)基(組成同前)，此后每隔8 15小時(優(yōu)選12小時)再次更換細(xì)胞培養(yǎng)基(組成同前)，直到接種后6(Γ80 小時(優(yōu)選為75小時)，然后再每隔3天更換細(xì)胞培養(yǎng)基(組成同前)繼續(xù)培養(yǎng)，直到細(xì)胞長至80°/Γ90%融合，以胰酶消化，消化時間不超過2分鐘，細(xì)胞傳代繼續(xù)培養(yǎng)，獲得純化后的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；所述細(xì)胞培養(yǎng)基終濃度組成如下bFGF 8^12 yg/L,EGF 8^12 μ g/L, PDGF-BB 8 12 μ g/L，胎牛血清10%，青霉素100U/mL，鏈霉素100mg/L，溶劑為基礎(chǔ)培養(yǎng)基； 所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基為DMEM培養(yǎng)液、F12培養(yǎng)液或其混合物。
優(yōu)選的，所述細(xì)胞培養(yǎng)基終濃度組成如下bFGF (小鼠堿性成纖維細(xì)胞生長因子) 10 μ g/L，EGF (小鼠表皮生長因子)10 μ g/L, PDGF-BB (小鼠血小板衍生生長因子_BB) 10 μ g/L,胎牛血清10%，青霉素100U/mL，鏈霉素100mg/L，溶劑為基礎(chǔ)培養(yǎng)基；所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基為DMEM培養(yǎng)液和F12培養(yǎng)液體積比I: I的混合液。細(xì)胞傳代具體步驟包括=PBS緩沖液洗滌細(xì)胞，添加0. 25%胰酶(含有0. 0296EDTA)室溫消化細(xì)胞，添加完全培養(yǎng)基終止消化，細(xì)胞懸液經(jīng)離心分離去除上層清液，再添加完全培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞，接種于新的培養(yǎng)皿中繼續(xù)培養(yǎng)，細(xì)胞接種密度為5X105/mL。完全培養(yǎng)基即細(xì)胞培養(yǎng)基中去掉生長因子成分，其組成如下胎牛血清10%，青霉素100U/mL，鏈霉素IOOmg/L，溶劑為基礎(chǔ)培養(yǎng)基；所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基為DMEM培養(yǎng)液、F12培養(yǎng)液或其混合物。
本發(fā)明還涉及一種用于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的體外擴(kuò)增純化培養(yǎng)的細(xì)胞培養(yǎng)基，其終濃度組成如下bFGF 8 12 μ g/L, EGF 8 12 μ g/L, PDGF-BB 8 12 μ g/L，胎牛血清 10%， 青霉素100U/mL，鏈霉素100mg/L，溶劑為基礎(chǔ)培養(yǎng)基；所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基為DMEM培養(yǎng)液、F12 培養(yǎng)液或其混合物。
優(yōu)選的，所述細(xì)胞培養(yǎng)基終濃度組成如下bFGF 10 μ g/L, EGF 10 μ g/L, PDGF-BB 10 μ g/L，胎牛血清10%，青霉素100U/mL，鏈霉素100mg/L，溶劑為基礎(chǔ)培養(yǎng)基；所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基為DMEM培養(yǎng)液和F12培養(yǎng)液體積比I: I的混合液。
本發(fā)明在以往的研究基礎(chǔ)上，采用細(xì)胞貼壁傳代和培養(yǎng)液中添加細(xì)胞因子(bFGF 、EGF和TOGF-BB)相結(jié)合的方法，獲得的骨髓干細(xì)胞純度高，體外增殖能力強(qiáng)，并且具有較好的向成骨細(xì)胞分化的能力。
細(xì)胞因子對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的體外增殖和分化具有重要的影響。H)GF、FGF信號通路是影響間充質(zhì)干細(xì)胞生長和分化的兩條關(guān)鍵通路，bFGF和EGF可以抑制造血干細(xì)胞的生長，有利于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的純化和生長。本發(fā)明提供的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的體外分離和擴(kuò)增的培養(yǎng)方法，通過低密度接種，早期更換培養(yǎng)液，聯(lián)合添加細(xì)胞因子和胰酶傳代消化相結(jié)合的細(xì)胞貼壁傳代培養(yǎng)方法，從而達(dá)到提高骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的體外純化率和增殖分化能力的目的。
本發(fā)明的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分離及其培養(yǎng)的方法，具有如下優(yōu)點(1)根據(jù)細(xì)胞貼壁速度不同，低密度接種后早期更換培養(yǎng)液可以去除骨髓中的造血干細(xì)胞、其它類型的細(xì)胞以及上清液中存在的細(xì)胞殘片，利于細(xì)胞的早期純化；(2)根據(jù)細(xì)胞對胰酶的敏感性不同，室溫條件下消化不超過2分鐘，可以將對胰酶敏感的間充質(zhì)干細(xì)胞先消化下來，進(jìn)一步純化細(xì)胞；而且短時間消化不影響細(xì)胞的活力，有利于細(xì)胞的擴(kuò)增；(3)培養(yǎng)液中添加的細(xì)胞因子有利于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖，可以抑制造血系干細(xì)胞的貼壁生長，利于細(xì)胞的純化；同時還可以保持細(xì)胞的未分化狀態(tài)，有利于細(xì)胞的分化研究。


圖I為初始接種后72小時細(xì)胞形態(tài)。
圖2為初始接種后I周細(xì)胞形態(tài)。
圖3為初始接種后15天的細(xì)胞形態(tài)。
圖4為傳至第3代的細(xì)胞形態(tài)。
圖5為擴(kuò)增至第3代細(xì)胞的流式細(xì)胞檢測分析圖(FL1-H是NA組細(xì)胞抗體的同型 IgG對照，F(xiàn)L2-H是A組細(xì)胞抗體的同型IgG對照)。
圖6為成骨誘導(dǎo)不同時間的成骨細(xì)胞特異性基因表達(dá)圖。
圖7為成骨誘導(dǎo)2周的堿性磷酸酶染色圖。
圖8為成骨細(xì)胞誘導(dǎo)3周的Alizarin Red S染色圖。
其中，NA表示添加細(xì)胞因子EGF和TOGF-BB的對比例，A表示添加細(xì)胞因子bFGF， EGF和PDGF-BB的實施例。
具體實施方式
下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于此實施例I:所用試劑胎牛血清(Hyclone)，青霉素、鏈霉素、DMEM培養(yǎng)液、F12培養(yǎng)液(Gibco) bFGF, EGF,PDGF-BB (PeproTech)1、取6周左右的ICR雄性成年小鼠(購買于浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心)，頸椎脫臼處死，無菌條件下取出股骨和脛骨；2、無菌剪刀剪開兩端骨骺，用注射器吸取完全培養(yǎng)基沖洗骨髓腔，完全培養(yǎng)基組份: 10% (v/v)胎牛血清，青霉素100U/mL，鏈霉素100mg/L，溶劑為DMEM/F12培養(yǎng)液(即DMEM與 Fl2體積比1:1混合液)；3、獲得的骨髓細(xì)胞懸液經(jīng)200目篩網(wǎng)過濾，接種于10cm的培養(yǎng)皿中，初始接種密度約為5X IO6個/mL，細(xì)胞培養(yǎng)基為完全培養(yǎng)基聯(lián)合添加細(xì)胞因子bFGF，EGF和TOGF-BB，終濃度均為10 μ g/L，初始接種細(xì)胞的培養(yǎng)基體積為2mL，可覆蓋培養(yǎng)皿底；4、初始接種后置于37°C，飽和濕度，含5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3小時，然后取出培養(yǎng)皿，更換細(xì)胞培養(yǎng)基，體積為2 mL ；5、初次更換培養(yǎng)基12小時后，再次更換細(xì)胞培養(yǎng)基，體積仍為2mL, 12小時后，再次更換細(xì)胞培養(yǎng)基，至初次接種后75小時，更換細(xì)胞培養(yǎng)基體積增加為8 mL,之后每3天更換一次細(xì)胞培養(yǎng)基，體積為8 mL,待細(xì)胞長至80%融合時進(jìn)行消化傳代，在倒置顯微鏡下觀察培養(yǎng)不同時間的細(xì)胞形態(tài)；6、細(xì)胞傳代PBS緩沖液洗滌細(xì)胞兩次后，添加0.25% (w/v)胰酶(含有0. 02% (w/v) EDTA)ImL室溫消化細(xì)胞2 min, 2mL完全培養(yǎng)基終止消化，細(xì)胞懸液經(jīng)300g離心5 min后， 完全培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞，接種于新的培養(yǎng)皿中繼續(xù)培養(yǎng)，細(xì)胞接種密度為5X 105/mL ；對比例步驟與實施例中所述步驟相同，二者不同之處是本實施例中的培養(yǎng)液只添加相同濃度的細(xì)胞因子EGF和I3DGF-BB。
骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的表型特征取傳至第3代的小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，0.25% (w/v)的胰酶室溫消化2 min，完全培養(yǎng)基終止后300g離心5 min, PBS洗滌后再加入500 μ I PBS重新懸浮細(xì)胞，分別加入PE和 FITC標(biāo)記的抗小鼠間充質(zhì)干細(xì)胞表面抗原抗體⑶45和⑶90以及對應(yīng)的同種熒光標(biāo)記的非特異性同型抗體各I μ L,室溫避光孵育30 min, 800 r/min離心5min,棄掉抗體孵育液后再加入200 μ I PBS緩沖液懸浮細(xì)胞，采用BD FACSCalibur流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面抗原的表達(dá)。
骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化和鑒定取傳至第3代的小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞接種于12孔板，待細(xì)胞達(dá)到80%融合時，更換成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基含細(xì)胞因子的培養(yǎng)基DMEM/F12 + 10%胎牛血清，I X 10_8 mol/L地塞米松， 50 μ mol/L抗壞血酸,10 mmol/L甘油磷酸鈉,每3天更換I次培養(yǎng)基。提取誘導(dǎo)分化3、7 和14天的小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞總RNA，SYBGreen熒光定量PCR檢測誘導(dǎo)分化的成骨細(xì)胞5特異性基因Collagen I和Osteocalcin的表達(dá),分別選擇誘導(dǎo)分化14天和28天的小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，經(jīng)4%多聚甲醛固定30分鐘后進(jìn)行堿性磷酸酶染色和茜素紅S染色檢測小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨細(xì)胞分化結(jié)果。
結(jié)果如附圖1，2，3所示，初始接種的骨髓細(xì)胞經(jīng)過早期換液，在胰酶消化傳代之前，實施例和對比例的細(xì)胞形態(tài)一致，顯微鏡下觀察到獲得的原代細(xì)胞形態(tài)單一，呈長梭狀多邊形，折光性強(qiáng)，邊緣清楚，而且呈現(xiàn)集落式生長模式，與對比例相比較，實施例中的原代細(xì)胞增殖速度相對較快。
原代純化的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)過胰酶消化傳代后，對比例的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞逐漸失去原代培養(yǎng)時的梭狀形，變成寬大扁平的形態(tài)，邊緣模糊，增殖緩慢，呈現(xiàn)老化狀態(tài) (圖4，NA所示)。實施例的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞傳至第3代時形態(tài)沒有發(fā)生明顯改變(圖4，A 所示)，而且增殖速度較快。經(jīng)過流式檢測，實施例中的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞基本不表達(dá)CD45， ⑶90表達(dá)陽性的細(xì)胞比例超過90% (圖5，A所示)，對比例的細(xì)胞中仍有部分⑶45表達(dá)陽性的細(xì)胞，表達(dá)⑶90的細(xì)胞比例不超過70%(圖5，NA所示)。可見，培養(yǎng)液中聯(lián)合添加三種細(xì)胞因子更有利于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的體外擴(kuò)增和細(xì)胞純化。
如圖6，7，8所示，經(jīng)過傳代培養(yǎng)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)過不同時間的成骨誘導(dǎo)后，實施例中的成骨細(xì)胞特異性基因的表達(dá)和堿性磷酸酶的表達(dá)都明顯高于對比例，且鈣化物的形成量較多。本發(fā)明采用的細(xì)胞體外擴(kuò)增純化培養(yǎng)方法有利于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化。
權(quán)利要求
1.一種骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的體外擴(kuò)增純化培養(yǎng)方法，所述方法包括取骨髓細(xì)胞，經(jīng)篩網(wǎng)過濾后的單細(xì)胞懸液接種于培養(yǎng)皿中進(jìn)行貼壁培養(yǎng)，初始接種密度2飛X IO6個/mL細(xì)胞培養(yǎng)基，培養(yǎng)3飛小時后首次更換細(xì)胞培養(yǎng)基，此后每隔8 15小時再次更換細(xì)胞培養(yǎng)基，直到接種后6(Γ80小時，然后再每隔3天更換細(xì)胞培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，直到細(xì)胞長至809Γ90%融合，以胰酶消化，消化時間不超過2分鐘，細(xì)胞傳代繼續(xù)培養(yǎng)，獲得純化的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；所述細(xì)胞培養(yǎng)基終濃度組成如下bFGF 8 12 μ g/L,EGF 8 12 μ g/L, PDGF-BB 8 12μ g/L，胎牛血清10%，青霉素100U/mL，鏈霉素100mg/L，溶劑為基礎(chǔ)培養(yǎng)基；所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基為DMEM培養(yǎng)液、F12培養(yǎng)液或其混合物。
2.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于所述細(xì)胞培養(yǎng)基終濃度組成如下bFGF10μ g/L, EGF 10 μ g/L, PDGF-BB 10 μ g/L，胎牛血清 10%，青霉素 100U/mL，鏈霉素 100mg/L，溶劑為基礎(chǔ)培養(yǎng)基；所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基為DMEM培養(yǎng)液和F12培養(yǎng)液體積比I: I的混合液。
3.一種用于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的體外擴(kuò)增純化培養(yǎng)的細(xì)胞培養(yǎng)基，其終濃度組成如下bFGF 8 12 μ g/L, EGF 8 12 μ g/L, PDGF-BB 8 12 μ g/L，胎牛血清 10%，青霉素 100U/mL,鏈霉素100mg/L，溶劑為基礎(chǔ)培養(yǎng)基；所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基為DMEM培養(yǎng)液、F12培養(yǎng)液或其混合物。
4.如權(quán)利要求3所述的細(xì)胞培養(yǎng)基，其特征在于所述細(xì)胞培養(yǎng)基終濃度組成如下bFGF 10 μ g/L, EGF 10 μ g/L, PDGF-BB 10 μ g/L，胎牛血清 10%，青霉素 100U/mL，鏈霉素100mg/L,溶劑為基礎(chǔ)培養(yǎng)基；所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基為DMEM培養(yǎng)液和F12培養(yǎng)液體積比I: I的混合液。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種利于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨干細(xì)胞分化的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外擴(kuò)增純化培養(yǎng)方法，以及在培養(yǎng)過程中所用的細(xì)胞培養(yǎng)基。本發(fā)明所用細(xì)胞培養(yǎng)基組成如下bFGF8~12μg/L，EGF8~12μg/L，PDGF-BB8~12μg/L，胎牛血清10%，青霉素100U/mL，鏈霉素100mg/L，溶劑為基礎(chǔ)培養(yǎng)基；所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基為DMEM培養(yǎng)液、F12培養(yǎng)液或其混合物。本發(fā)明采用早期更換細(xì)胞培養(yǎng)液、細(xì)胞貼壁傳代和培養(yǎng)液中聯(lián)合添加細(xì)胞因子(bFGF、EGF和PDGF-BB)相結(jié)合的方法，獲得的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞純度高，體外增殖能力強(qiáng)，并且具有較好的向成骨細(xì)胞分化的能力。
文檔編號C12N5/0775GK102978156SQ20121053394
公開日2013年3月20日 申請日期2012年12月8日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月13日
發(fā)明者李靜, 周國順, 戴利成 申請人:湖州市中心醫(yī)院