專利名稱：蝦虎魚類線粒體coⅲ及nd3基因擴增引物、設(shè)計和擴增方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于魚類線粒體基因組研究領(lǐng)域，具體涉及一種高效擴增多種蝦虎魚類線粒體細(xì)胞色素 c (Cytc)氧化酶亞基III (cytochrome c oxidase subunit III ;C0 III)基因大部分序列及NADH還原酶復(fù)合體亞基3 (NADH dehydrogenase subunits 3 ;ND3)基因全序列的擴增引物及其設(shè)計和擴增方法。
背景技術(shù)：
魚類線粒體基因組由13個編碼蛋白質(zhì)基因、22個tRNA基因、2個rRNA基因(12SrRNA及16S rRNA)共37個編碼基因及一段主要的非編碼區(qū)(控制區(qū))組成，具有結(jié)構(gòu)簡單、拷貝數(shù)多、嚴(yán)格的母系遺傳、幾乎不發(fā)生重組、編碼效率高、進化速度快且不同區(qū)域進化速度存在差異等特點。由于魚類線粒體基因組所具有的這些特點，使其成為魚類分子群體遺傳學(xué)、系統(tǒng)發(fā)生學(xué)及保護生物學(xué)等研究領(lǐng)域的重要分子標(biāo)記。蝦虎魚類隸屬于鱸形目、蝦虎魚亞目，是世界上種類最多，分布最廣的魚類之一。估計全世界的蝦虎魚種類有2000多種，它們形成一個龐大的生物類群，在水環(huán)境尤其是海洋生態(tài)環(huán)境中占有重要的地位。蝦虎魚多為肉食性的小型魚類，遍布全世界，尤以熱帶為多，主要為海水魚類,大部分營底棲生活,主要特征是其腹鰭愈合成一吸盤狀。近年來，由于過度捕撈、氣候環(huán)境變化等原因，許多傳統(tǒng)的經(jīng)濟魚種資源已經(jīng)形不成漁訊，有些甚至枯竭，但蝦虎魚類因其適應(yīng)能力強、生命周期短、繁殖力強等原因，資源量卻逐年增加。大部分蝦虎魚類經(jīng)濟價值不高，國內(nèi)外有關(guān)于蝦虎魚類的研究相對較少，因其種類繁多，外部形態(tài)特征極為相似，導(dǎo)致不易鑒別和認(rèn)定。目前，蝦虎魚類的分類還不甚清晰，很多種類的分類地位還比較混亂。 線粒體全基因組及線粒體基因組上的相關(guān)基因作為分子標(biāo)記已被廣泛地用于蝦虎魚群體遺傳學(xué)、系統(tǒng)發(fā)生學(xué)及保護生物學(xué)等研究領(lǐng)域。CO III及ND3作為脊椎動物線粒體蛋白質(zhì)編碼基因中3個編碼細(xì)胞色素c(Cytc)氧化酶亞基及7個編碼NADH還原酶復(fù)合體亞基的基因之一，其所含的系統(tǒng)發(fā)育信息位于13個編碼蛋白基因中的中上等，可應(yīng)用于脊椎動物的系統(tǒng)進化和分類研究。然而未曾有報道過擴增線粒體CO III及ND3基因序列的通用引物，尤其是針對蝦虎魚類。因此設(shè)計特異性擴增蝦虎魚類線粒體CO III及ND3基因序列的通用引物，從而為高效獲得蝦虎魚線粒體CO III及ND3基因序列及線粒體基因組全序列奠定基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容
針對上述現(xiàn)有技術(shù)存在的空缺，本發(fā)明旨在提供一對可高效特異擴增多種蝦虎魚類線粒體CO III及ND3基因序列的單鏈寡核苷酸引物，從而為快速有效獲取蝦虎魚類線粒體CO III及ND3基因序列以進行系統(tǒng)進化和分類研究提供一個有力工具。本發(fā)明的目的還在于提供所述蝦虎魚類線粒體CO III及ND3基因擴增引物的設(shè)計方法，以及利用所述的蝦虎魚類線粒體CO III及ND3基因擴增引物對蝦虎魚類線粒體CO III及ND3基因進行擴增的方法。為實現(xiàn)本發(fā)明的發(fā)明目的，發(fā)明人提供如下技術(shù)方案:
蝦虎魚類線粒體CO III及ND3基因擴增引物，由兩條單鏈寡核苷酸鏈組成，其中輕鏈引物為SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列；重鏈引物為SEQ ID N0.2所示的核苷酸序列。本發(fā)明的輕鏈引物Gobies-CO II1-ND3-F (SEQ ID N0.1所示)有21個堿基:ATACCACATAGTAGACCCCAG，位于 0)111基因上；重鏈引物601^68-0)111-冊3-1 (SEQ ID N0.2所示)有 21 個堿基:GACTTTAACCACGAGCTTTTG，位于 tRNA_Arg 基因上。本發(fā)明所述的蝦虎魚類線粒體CO III及ND3基因擴增引物對在東海海域采集的17種蝦虎魚類，均能獲得片段長度為1150 bp左右的特異性擴增產(chǎn)物，經(jīng)測序及與GenBank中同源序列的比較，確認(rèn)為包含線粒體ND3基因全序列、tRNA-Gly基因全序列、及長度為720bp左右的CO III基因絕大部分序列的擴增產(chǎn)物，體現(xiàn)出本發(fā)明較廣的擴增范圍與較強的擴增能力，從而為快速有效獲取蝦虎魚類線粒CO III及ND3基因序列以進行系統(tǒng)進化及分類研究提供一個有力工具。作為優(yōu)選，根據(jù)本發(fā)明所述的蝦虎魚類線粒體CO III及ND3基因擴增引物，其中所述的蝦虎魚類包括但不限于下述:中華烏塘鱧、青彈涂魚、斑紋舌蝦虎魚、髭縞蝦虎魚、孔蝦虎魚、綠斑細(xì)棘蝦虎魚、紅狼牙蝦虎魚、普氏細(xì)棘蝦虎魚、斑尾刺蝦虎魚、大彈涂魚、矛尾蝦虎魚、舟山韁蝦虎魚、平頭竿蝦虎魚、雙帶縞蝦虎魚、犬齒背眼蝦虎魚、臺灣溝蝦虎魚、睛尾蝌蚪蝦虎魚。
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本發(fā)明還提供了上述蝦虎魚類線粒體CO III及ND3基因擴增引物的設(shè)計方法，即登錄NCBI網(wǎng)站中的GenBank數(shù)據(jù)庫(http://www.ncb1.nlm.nih.gov/)搜索已測定的奸虎魚類其他物種及近緣物種的線粒體基因組的COIII基因和tRNA-Arg基因序列，經(jīng)同源性比較，找到保守序列，并利用Premier Primer5.0軟件設(shè)計出奸虎魚類線粒體CO III及ND3基因擴增引物。所用的Premier Primer5.0軟件在生物軟件網(wǎng)http://www.bio-soft, net/下載。本發(fā)明還提供了一種對蝦虎魚類線粒體CO III及ND3基因進行擴增的方法，其是采用上述的蝦虎魚類線粒體CO III及ND3基因擴增引物對待測樣品的DNA模板溶液進行PCR擴增。作為優(yōu)選，根據(jù)本發(fā)明所述的一種對蝦虎魚類線粒體CO III及ND3基因進行擴增的方法，其中PCR擴增的條件為:95°C預(yù)變性5min，然后95°C變性30s，56°C退火30s，72°C延伸lmin20s，共35個循環(huán)，最后72°C延伸5min。作為優(yōu)選，根據(jù)本發(fā)明所述的一種對蝦虎魚類線粒體CO III及ND3基因進行擴增的方法，其中PCR擴增的反應(yīng)體系組成為:PCR反應(yīng)體系為25μ ，內(nèi)含dNTP (2.5mM) 2μ 、IOXTaq DNA聚合酶Buffer 2.5μ 、ΙΟμΜ的輕鏈引物和重鏈引物各 μ 、Taq DNA聚合酶(5U/ul) 0.2μ 、含 IOOng 的 DNA 模板溶液 WL 及 ddH20 17.3μ 。作為優(yōu)選，根據(jù)本發(fā)明所述的一種對蝦虎魚類線粒體CO III及ND3基因進行擴增的方法，其中所述的待測樣品來自包括但不限于下述蝦虎魚類:中華烏塘鱧、青彈涂魚、斑紋舌蝦虎魚、髭縞蝦虎魚、孔蝦虎魚、綠斑細(xì)棘蝦虎魚、紅狼牙蝦虎魚、普氏細(xì)棘蝦虎魚、斑尾刺蝦虎魚、大彈涂魚、矛尾蝦虎魚、舟山韁蝦虎魚、平頭竿蝦虎魚、雙帶縞蝦虎魚、犬齒背眼蝦虎魚、臺灣溝蝦虎魚、睛尾蝌蚪蝦虎魚。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點:本發(fā)明提供的蝦虎魚類線粒體CO III及ND3基因擴增引物，可以高效特異性地擴增多種蝦虎魚類線粒體CO III及ND3基因序列，能應(yīng)用于蝦虎類不同分類階元系統(tǒng)進化和分類研究。同時本發(fā)明所述通用引物及其設(shè)計方法也可作為通用引物PCR擴增原理及關(guān)鍵參數(shù)研究的具體實例，促進本發(fā)明所涉及領(lǐng)域的前進發(fā)展，因而具備重要發(fā)明價值和理論意義。


圖1為本發(fā)明蝦虎魚類線粒體CO III及ND3基因擴增引物用以擴增不同蝦虎魚類線粒體CO III及ND3基因序列的電泳圖譜。其中M =DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)(DL2000)，1-17依次為:中華烏塘鱧、青彈涂魚、斑紋舌蝦虎魚、髭縞蝦虎魚、孔蝦虎魚、綠斑細(xì)棘蝦虎魚、紅狼牙蝦虎魚、普氏細(xì)棘蝦虎魚、斑尾刺蝦虎魚、大彈涂魚、矛尾蝦虎魚、舟山韁蝦虎魚、平頭竿蝦虎魚、雙帶縞蝦虎魚、犬齒背眼蝦虎魚、臺灣溝蝦虎魚、睛尾蝌蚪蝦虎魚。
具體實施例方式下面結(jié)合實施例和說明書附圖，更具體地說明本發(fā)明的內(nèi)容。應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明的實施并不局限于下面的實施例，對本發(fā)明所做的任何形式上的變通和/或改變都將落入本發(fā)明保護范圍。在本發(fā)明中，若非特指，所有的份、百分比均為重量單位，所有的設(shè)備和原料等均可從市場購得或是本行業(yè)常用的。若無特別指明，實施例采用的方法為本領(lǐng)域通用技術(shù)。主要材料、試劑和儀器設(shè)備:
軟件及序列資源:Premier Primer5.0引物設(shè)計軟件(下載自生物軟件網(wǎng)http://www.bio-soft, net/),奸虎魚類線粒體基因組序列資源(下載自NCBI中Genbank數(shù)據(jù)庫http: //www.ncb1.nlm.nih.gov/),序列分析軟件MEGA5.0(下載自生物軟件網(wǎng) http: //www.bio-soft, net/)。
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PCR擴增檢測相關(guān)試劑儀器:海洋動物基因組DNA提取試劑盒(TIANGEN，北京)，瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(TIANGEN，北京)，常規(guī)臺式離心機(Thermo)，Bio-Rad C1000TMThermal Cycler擴增儀器(Bio-Rad，美國)，微量移液器(Enppdorf，德國)，96孔PCR板(Axygen)，dNTP (TIANGEN，北京)，IOXTaq DNA 聚合酶 Buffer (TIANGEN，北京)，Taq DNA 聚合酶(TIANGEN，北京)，滅菌雙蒸水，DL2000 DNA marker (TIANGEN,北京)，瓊脂糖(Biowest，香港)，電泳儀(DYY-6C型，北京六一)，凝膠成像儀(Bio-Rad⑶2000，美國)。克隆測序相關(guān)試劑儀器:高壓蒸氣滅菌鍋(SANYO，日本)，加氨芐(Amp)抗生素的滅菌LB培養(yǎng)基，LB固體培養(yǎng)平皿(上海生工)，超凈工作臺(SW — CJ一IG型，名牌之星，中國)，恒溫水浴鍋(上海精宏)，DH5a感受態(tài)細(xì)胞(TIANGEN)，Amp抗生素(上海生工)，5-溴-4-氯-3-吲哚-β -D-半乳糖苷(上海生工)，異丙基硫代-β -D-半乳糖苷(上海生工)，pGEM-T載體(Promega，美國)，恒溫培養(yǎng)箱(PH070A型，上海一恒科學(xué)儀器有限公司)，恒溫振蕩搖床(培英，太倉市實驗設(shè)備廠)自動DNA測序儀(ABI 3730型，美國)。實施例中未注明具體條件的實驗方法，是按照常規(guī)條件，例如Sambrook等作者的分子克隆實驗室手冊(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商說明書建議的條件。
實施例11、蝦虎魚類線粒體CO III及ND3基因擴增引物的設(shè)計和合成:
登錄NCBI網(wǎng)站中的GenBank數(shù)據(jù)庫搜索已測定的蝦虎魚類其他物種及近緣物種的線粒體基因組的CO III基因和tRNA-Arg基因序列，將序列載入到分析軟件MEGA5.0中，利用ClustalW算法進行多序列對位比對分析，找到保守序列，將所找到的保守序列載入到Premier Primer5.0軟件在手動設(shè)計模式下(即在manual選項下選擇Low,具體參數(shù)為默認(rèn)設(shè)置)設(shè)計出蝦虎魚類線粒體CO III及ND3基因擴增引物:其中輕鏈引物 Gobies-CO II1-ND3-F (SEQ ID N0.1 所示)有 21 個堿基:ATACCACATAGTAGACCCCAG，位于CO III基因上；重鏈引物Gobies-CO II1-ND3-R (SEQ ID N0.2所示)有21個堿基:GACTTTAACCACGAGCTTTTG，位于 tRNA-Arg 基因上。由南京金斯瑞生物科技有限公司根據(jù)發(fā)明人的要求合成符合SEQ ID N0.1和SEQID N0.1所示核苷酸序列的引物。2、對蝦虎魚類線粒體CO III及ND3基因進行擴增
本發(fā)明中的17個待測樣本均采集于我國的東海海域。其中擴增的蝦虎魚類為以下種類:中華烏塘鱧、青彈涂魚、斑紋舌蝦虎魚、髭縞蝦虎魚、孔蝦虎魚、綠斑細(xì)棘蝦虎魚、紅狼牙蝦虎魚、普氏細(xì)棘蝦虎魚、斑尾刺蝦虎魚、大彈涂魚、矛尾蝦虎魚、舟山韁蝦虎魚、平頭竿蝦虎魚、雙帶縞蝦虎魚、犬齒背眼蝦虎魚、臺灣溝蝦虎魚、睛尾蝌蚪蝦虎魚。利用海洋動物基因組DNA提取試劑盒提取待測樣本的基因組DNA，方法按照試劑盒說明書進行，瓊脂糖電泳檢測提取的基因組DNA。用于擴增多種蝦虎魚類線粒體CO III及ND3基因的PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件如下:PCR 反應(yīng)體系為 25μ ，內(nèi)含 dNTP (TIANGEN)，10XTaqDNA 聚合酶 Buffer (TIANGEN), ΙΟμΜ的輕鏈引物 Gobies-CO II1-ND3-F 和 ΙΟμΜ 的重鏈引物 Gobies- CO II1-ND3-R, Taq DNA 聚合酶(TIANGEN)，含IOO ng的上述提取的基因組DNA模板溶液，ddH20，其中:
10 X TaqDNA 聚合酶 Buffer 2.5μdNTP2μ
Gobies- CO II1-ND3-F μ
Gobies- CO II1-ND3-R μ
Template DNAIM-L
ddH2017.3μ
Taq DNA 聚合酶0.2μ 。擴增反應(yīng)在Bio-Rad C1000 Thermal Cycler儀器上進行，擴增條件為:95°C預(yù)變性5min，然后95°C變性30s，56°C退火30s，72°C延伸lmin20s，共35個循環(huán)，最后72°C延伸5min。擴增產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測其大小和純度。不同蝦虎魚類線粒體CO III及ND3基因擴增產(chǎn)物的電泳圖譜見圖1。運用設(shè)計的引物擴增多數(shù)蝦虎魚類線粒CO III及ND3基因序列，均獲得了單一的目的片段，產(chǎn)物大小約為1150 bp，并對PCR擴增產(chǎn)物直接進行測序，其步驟為:PCR擴增產(chǎn)物初步定量后，濃度達(dá)到約lOOng/μΙ的樣品，寄送南京金斯瑞生物科技有限公司，委托其進行雙向測序，測序引物為 Gobies-CO II1-ND3-F (ΙΟμΜ)和 Gobies-CO II1-ND3-R (ΙΟμΜ)。經(jīng)測序及與GenBank中的同源序列進行比對，確認(rèn)為包含線粒體ND3基因全序列、tRNA-Gly基因全序列、及長度為720 bp左右的CO III基因絕大部分部分序列的擴增產(chǎn)物。運用設(shè)計的引物擴增普氏細(xì)棘蝦虎魚和青彈涂魚線粒體CO III及ND3基因，均獲得了單一的目的片段，產(chǎn)物大小約為1150 bp,并使用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(TIANGEN，上海)對PCR擴增產(chǎn)物進行膠回收純化，純化產(chǎn)物同pGEM-T載體(Promega公司，美國)連接，轉(zhuǎn)化，鑒定陽性克隆并測序。其步驟為:經(jīng)膠回收純化的PCR擴增產(chǎn)物在T4 DNA連接酶的作用下與PGEM-T載體進行連接反應(yīng)。連接反應(yīng)體系為載體 μ ，T4 DNA連接酶 μ ，連接Buffer 5ul，PCR純化產(chǎn)物3μ1。連接反應(yīng)于冰上操作，反應(yīng)液置于4°C冰箱連接過夜(至少12小時)。取DH5a感受態(tài)細(xì)胞(TIANGEN，北京)，熱激法進行轉(zhuǎn)化，用含有氨芐抗生素(Amp)LB平板(使用前預(yù)先均勻涂布40ul 20mg/ml的5-溴-4-氯-3- Π引哚-β -D-半乳糖苷(X-Gal)和30ul 0.2mol/L的異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG))進行藍(lán)白篩選，并通過菌液PCR擴增確認(rèn)挑取的陽性克隆子。陽性克隆子經(jīng)擴大培養(yǎng)后的菌液寄送南京金斯瑞生物科技有限公司進行雙向直接測序。測序引物為SP6/T7。序列分析儀為ABI 3730全自動DNA測序儀。經(jīng)測序及與GenBank中的同源序列進行比對，確認(rèn)為包含線粒體ND3基因全序列、tRNA-Gly基因全序列、及長度為720 bp左右的CO III基因絕大部分序列的擴增產(chǎn)物。實用性
本發(fā)明所述的蝦虎魚類線粒體CO III及ND3基因擴增引物對在東海海域采集的17種海洋蝦虎魚類的DNA模板溶液進行PCR擴增，均能獲得片段在1150 bp左右的特異性擴增產(chǎn)物，經(jīng)測序及與GenBank中同源序列的比較，確認(rèn)為包含線粒體ND3基因全序列、tRNA-Gly基因全序列、及長度為720 bp左右的COIII基因絕大部分序列的擴增產(chǎn)物，體現(xiàn)出本發(fā)明較廣的擴增范圍與較強的擴增能力，因此，本發(fā)明所述的蝦虎魚類線粒體CO III及ND3基因擴增引物在蝦虎魚類不同階元系統(tǒng)進化及分類研究領(lǐng)域可予以應(yīng)用。

盡管發(fā)明人已經(jīng)對本發(fā)明的技術(shù)方案做了較為詳細(xì)的闡述和列舉，應(yīng)當(dāng)理解，對于本領(lǐng)域一個熟練的技術(shù)人員來說，對上述實施例作出修改和/或變通或者采用等同的替代方案是顯然的，都不能脫離本發(fā)明精神的實質(zhì)，本發(fā)明中出現(xiàn)的術(shù)語用于對本發(fā)明技術(shù)方案的闡述和理解，并不能構(gòu)成對本發(fā)明的限制。
權(quán)利要求
1.蝦虎魚類線粒體COIII及ND3基因擴增引物，其特征是由兩條單鏈寡核苷酸鏈組成，其中輕鏈引物為SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列；重鏈引物為SEQ ID N0.2所示的核苷酸序列。
2.如權(quán)利要求1所述的蝦虎魚類線粒體COIII及ND3基因擴增引物，其特征是所述的蝦虎魚類包括中華烏塘鱧、青彈涂魚、斑紋舌蝦虎魚、髭縞蝦虎魚、孔蝦虎魚、綠斑細(xì)棘蝦虎魚、紅狼牙蝦虎魚、普氏細(xì)棘蝦虎魚、斑尾刺蝦虎魚、大彈涂魚、矛尾蝦虎魚、舟山韁蝦虎魚、平頭竿蝦虎魚、雙帶縞蝦虎魚、犬齒背眼蝦虎魚、臺灣溝蝦虎魚、睛尾蝌蚪蝦虎魚。
3.—種如權(quán)利要求1所述的蝦虎魚類線粒體CO III及ND3基因擴增引物的設(shè)計方法，其特征是登錄NCBI網(wǎng)站中的GenBank數(shù)據(jù)庫搜索已測定的蝦虎魚類其他物種及近緣物種的線粒體基因組的CO III基因和tRNA-Arg基因序列，經(jīng)同源性比較，找到保守序列，并利用Premier Primer5.0軟件設(shè)計出奸虎魚類線粒體CO III及ND3基因擴增引物。
4.一種對蝦虎魚類線粒體COIII及ND3基因進行擴增的方法，其特征是采用如權(quán)利要求1所述的蝦虎魚類線粒體CO III及ND3基因擴增引物對待測樣品的DNA模板溶液進行PCR擴士豳>曰ο
5.如權(quán)利要求4所述的一種對蝦虎魚類線粒體COIII及ND3基因進行擴增的方法，其特征是PCR擴增的條件為:95°C預(yù)變性5min，然后95°C變性30s，56°C退火30s，72°C延伸lmin20s，共35個循環(huán)，最后72°C延伸5min。
6.如權(quán)利要求4所述的一種對蝦虎魚類線粒體COIII及ND3基因進行擴增的方法，其特征是PCR擴增的反應(yīng)體系組成為:PCR反應(yīng)體系為25μ ，內(nèi)含2.5mM的dNTP 2PL、10XTaqDNA聚合酶Buffer 2.5μ 、ΙΟμΜ的輕鏈引物和重鏈引物各lPL、5U/ul的Taq DNA聚合酶0.2μ 、含 IOOng 的 DNA 模板溶液 WL 及 ddH20 17.3μ 。
7.如權(quán)利要求4所述的一種對蝦虎魚類線粒體COIII及ND3基因進行擴增的方法，其特征是所述的待測樣品來自中華烏塘鱧、青彈涂魚、斑紋舌蝦虎魚、髭縞蝦虎魚、孔蝦虎魚、綠斑細(xì)棘蝦虎魚、紅狼牙 蝦虎魚、普氏細(xì)棘蝦虎魚、斑尾刺蝦虎魚、大彈涂魚、矛尾蝦虎魚、舟山韁蝦虎魚、平頭竿蝦虎魚、雙帶縞蝦虎魚、犬齒背眼蝦虎魚、臺灣溝蝦虎魚、睛尾蝌蚪蝦虎魚。
全文摘要
本發(fā)明屬于魚類線粒體基因組研究領(lǐng)域，具體涉及一種COⅢ及ND3基因擴增引物，由兩條單鏈寡核苷酸鏈組成，其中輕鏈引物為SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；重鏈引物為SEQIDNo.2所示的核苷酸序列。本發(fā)明還提供了該擴增引物的設(shè)計和擴增方法。本發(fā)明可高效特異性地擴增多種蝦虎魚類線粒體COⅢ及ND3基因序列，能應(yīng)用于蝦虎類不同分類階元系統(tǒng)進化和分類研究。
文檔編號C12N15/11GK103074335SQ201210482530
公開日2013年5月1日 申請日期2012年11月22日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月22日
發(fā)明者徐田軍, 王日昕, 金逍逍, 孫悅娜 申請人:浙江海洋學(xué)院