專利名稱：一種大白菜eIF(iso)4E.c位點(diǎn)轉(zhuǎn)座子插入突變體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種基因的突變體及其相關(guān)位點(diǎn)特異性分子標(biāo)記的開發(fā)與應(yīng)用，尤其涉及一種大白菜真核生物翻譯起始因子eIF(iso)4E. c的轉(zhuǎn)座子插入突變體及該位點(diǎn)特異性分子標(biāo)記的開發(fā)和應(yīng)用。本發(fā)明的突變體能夠?yàn)檫x育含該突變位點(diǎn)的抗病毒大白菜種質(zhì)提供變異源，位點(diǎn)特異分子標(biāo)記能夠直接應(yīng)用于分子標(biāo)記輔助育種來選擇含有該突變位點(diǎn)的大白菜材料，提高eIF4E突變體的選擇效率，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
大白菜(Brassica rapa L. ssp pekinensis)是十字花科重要的蔬菜作物,原產(chǎn)于中國，目前在世界各地均有種植。尤其在我國蔬菜的常年供應(yīng)和淡季蔬菜調(diào)劑中已經(jīng)成為蔬菜產(chǎn)品供給的重要組成部分，因而對(duì)人們生活具有重要影響。在大白菜生產(chǎn)過程中，常遭病毒病、霜霉病和軟腐病等病害的威脅。就整體而言病毒病的危害最為嚴(yán)重，且沒有普遍適用的抗病毒病藥劑或其它行之有效的控制技術(shù)。培育抗病毒大白菜新品種是應(yīng)對(duì)病毒病危害的首選途徑[王雪，劉玉梅，李漢霞，張揚(yáng)勇，方智遠(yuǎn).蕓薹屬作物抗蕪菁花葉病毒育種研究進(jìn)展.園藝學(xué)報(bào).2005,32(5): 939-946]。苗立強(qiáng)等[苗立強(qiáng)，張耀偉，崔崇士 .我國白菜抗病育種研究進(jìn)展.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào).2008, 37 (4) : 52 9-533]研究發(fā)現(xiàn)，我國大白菜病毒病的病原分離物中70%是蕪菁花葉病毒(Turnip Mosaic Virus，TuMV)、還有少量黃瓜花葉病毒(Cucumber Mosaic Virus, CMV)和其它病毒。因此我國大白菜抗病毒病育種的主攻目標(biāo)是抗TuMV。
培育抗TuMV大白菜新品種的兩個(gè)關(guān)鍵要素是擁有豐富的抗TuMV種質(zhì)資源和高效的育種效率。我國是大白菜原產(chǎn)地，種質(zhì)資源非常豐富，其中不乏抗TuMV的優(yōu)良資源，同時(shí)也有更多品質(zhì)優(yōu)良但不抗病毒的資源。在常規(guī)育種實(shí)踐中，常通過回交轉(zhuǎn)育的手段獲得更多遺傳背景豐富的抗性材料。隨著分子標(biāo)記技術(shù)的興起及研究的深入，標(biāo)記輔助選擇在常規(guī)育種操作中已經(jīng)成為提高選擇效率、縮短育種年限的主要手段。一些跨國的育種集團(tuán)更是不惜重金把創(chuàng)新資源和開發(fā)與重要農(nóng)藝性狀緊密連鎖的分子標(biāo)記作為育種攻關(guān)的主要內(nèi)容。
一般而言，要尋找與某農(nóng)藝性狀緊密連鎖的分子標(biāo)記，往往需要先選擇在目標(biāo)性狀方面存在顯著差異的親本，并構(gòu)建分離群體$2，1 1，8(1，0!1等)，采用混合分群(BSA) 和傳統(tǒng)的分子標(biāo)記(如RAPD, SRAP, AFLP, SSR等)技術(shù)進(jìn)行分析,用相應(yīng)的軟件分析所得標(biāo)記與性狀的連鎖距離，最終得到與目標(biāo)性狀連鎖的分子標(biāo)記。目前報(bào)道的與大白菜抗蕪菁花葉病毒(TuMV)位點(diǎn)連鎖的分子標(biāo)記正是采用上述方法得到的。由于不同研究者所用材料和所選擇的標(biāo)記類型不同，所得到的與抗病毒特性連鎖的標(biāo)記距離亦不同，介于 3. 8-15. 36cM。由于這些標(biāo)記與性狀的連鎖程度不夠緊密，因而其用于大白菜抗TuMV輔助育種尚有一定的距離。
另一方面，由于擬南芥與大白菜同屬十字花科，其抗病毒相關(guān)功能基因已有較深入的研究；同時(shí)大白菜的全基因組序列已經(jīng)公布[Wang et al. , 2011, the genome of themesopoIyploidcrop species Brassica rapa. Nature Genetics. 43(10):1035-1039]。所以可以將擬南芥功能基因研究的結(jié)果和大白菜基因組序列信息結(jié)合，直接從抗病毒相關(guān)功能基因的角度入手，通過對(duì)大白菜自然群體在某一個(gè)重要功能基因位點(diǎn)的自然變異入手，尋找抗病毒相關(guān)功能基因的突變體；針對(duì)突變位點(diǎn)開發(fā)位點(diǎn)特異性分子標(biāo)記(Allelespecific marker, ASM)，則這種標(biāo)記本身與性狀直接相關(guān)，這無疑會(huì)使標(biāo)記輔助選擇更加精準(zhǔn)。在抗病毒功能基因研究方面近年來發(fā)現(xiàn)，由隱性單基因控制的抗病毒性狀多與真核生物翻譯起始因子4E及其異構(gòu)體的突變有關(guān)。Wittmann等[WittmannS，Chatel H，F(xiàn)ortin MG，Laliberte JF.1nteraction of the viral protein genomelinked of Turnip mosaic virus with thetranslational eukaryotic initiationfactor(iso)4E of Arabidopsis thaliana using the yeast two-hybridsystem.Virology.1997,234:84-92]和 L6onard 等[L6onard S，Plante D，WittmannS,DaigneaultNj Fortin MG，LaliberteJF. Complex formation between potyvirusVPg and translation eukaryoticinitiation factor 4E correlates with virusinfectivity. J. Virol. 2000，74:7730-7737]分別證明擬南芥 eIF4E 和 eIF (iso) 4E 可以同TuMV的病毒基因組結(jié)合蛋白(VPg)相互作用。這種相互作用的關(guān)鍵氨基酸與真核生物自身mRNA翻譯所需的關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)不同，所以eIF4E及eIF(iso)4E的一些氨基酸突變不影響植物自身的生長(zhǎng)發(fā)育、卻導(dǎo)致病毒與寄主不能發(fā)生互作，從而使寄主表現(xiàn)出抵抗病毒侵染的特性。Ryder 在生菜[Ryder EJ. 1970.1nheritance of resistancetocommon lettuce mosaic. Am Soc Horticult Sc1. 95:378 - 379]、Ruffel 在辣椒[RuffelS, DussaultMHj Palloix A,Moury B，Bendahmane A, Robaglia C,Caranta C.2002.A natural recessiveresistance gene against potato virus Y in peper correspondsto the eukaryotic initiation factor 4E(eIF4E) Plant J. 2002Dec;32(6) :1067-75]、Nieto 在舌甘瓜[Nieto C，Piron F，Dalmais M，Marco CF，Moriones E, Gomez-GuillamonML, Truniger V, Gomez P, Garcia-Mas J，Aranda MAj Bendahmane A. 2007. EcoTILLING forthe identification of allelic variants of melon eIF4E，afactor that controlsvirus susceptibility. BMC Plant Biology. 7，34-42]等重要蔬菜作用中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了不少這樣的突變體資源，Yeam 等[Yeam I，Kang BCj Lindeman W，F(xiàn)rantz JDj Faber N，andjahnMM. 2005. Allele-specific CAPS markers based on point mutations in resistancealleles at thepvrI locus encoding eIF4E in Capsicum.Theor.Appl.Genet.NNOj 178-186]在辣椒中針對(duì)突變位點(diǎn)開發(fā)了相應(yīng)的位點(diǎn)特異性CAPs標(biāo)記并用于抗病毒材料轉(zhuǎn)育時(shí)的輔助選擇。從其他作物的eIF4E和eIF (iso) 4E突變及其在抗病毒中的作用推測(cè)，大白菜自然群體中也可能存在eIF4E和eIF(is0)4E的突變體，且這種突變可能與大白菜的抗病毒特性有關(guān)。我國大白菜種質(zhì)資源十分豐富，但目前，國內(nèi)外有關(guān)大白菜抗病毒特性與eIF4E和eIF(iso)4E關(guān)系的研究很少，涉及的材料極為有限。Rusholme等[Rusholme RL,Higgins EE, Walsh JA, Lydiate DJ. Genetic control of broad-spectrum resistanceto turnip mosaic virus in Brassica rapa (Chinese cabbage). Journal of GeneralVirology. 2007,88:3177 - 3186]以高抗TuMV的大白菜自交系RLR22和病毒敏感材料R-0-18為親本，構(gòu)建BClFl群體，進(jìn)行抗TuMV (⑶N I和CZEl株系)遺傳研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)了一個(gè)大白菜抗病毒隱性遺傳位點(diǎn)retrOl和一個(gè)顯性位點(diǎn)ConTROl, RFLP標(biāo)記關(guān)聯(lián)分析分別發(fā)現(xiàn)了與retrO I連鎖的標(biāo)記pN202e I和與ConTRO I連鎖的標(biāo)記p085e I。進(jìn)一步采用southern 雜交的手段發(fā)現(xiàn)，在A基因組中分別有3個(gè)拷貝的eIF4E (分別位于染色體N1、N3和NS)和 3個(gè)拷貝的eIF(is0)4E (分別位于染色體N4、N5和NS)。作者根據(jù)雜交結(jié)果，推測(cè)位于第8 染色體上的eIF4E和eIF (iso) 4E可能與ConTROl有關(guān)，而位于第4染色體上的eIF (iso) 4E 可能與retrOl有關(guān)。文中沒有關(guān)于兩個(gè)基因的序列信息報(bào)道。Jenner等[Jenner CE, Nellist C F，Barker GC, Walsh JA. Turnip mosaic virus (TuMV)isable to usealleles of both eIF4E and eIF (iso)4E from multiple loci of the diploid Brassica rapa. Mol PlantMicrobe Interact. 2010, 3(11): 1498-1505]從病毒敏感材料 R-0-18 中克隆得到了 eIF4E 和 eIF(iso)4E 各三個(gè)拷貝，分別命名為 BraA. eIF(iso)4E. C、BraA. eIF4E. b、 BraA. eIF4E. c 和 BraA. eIF(iso)4Ε· a>BraA. eIF(iso)4E. b、BraA. eIF(iso)4E. c。除 BraA. eIF4E. b和BraA. eIF (iso) 4E. b以外，其余4個(gè)基因分別轉(zhuǎn)化擬南芥At. eIF (iso) 4E功能缺失突變體[Duprat A, Caranta C, ReversF, Menand B, Browning KS, Robaglia C. 2002. The Arabidopsis eukaryotic initiation factor (iso)4E is dispensable for plant growth but required for susceptibility to potyviruses. The PlantJournal, 32:927 - 934], 然后對(duì)所有轉(zhuǎn)基因株系接種TuMV加拿大株系CDNl，進(jìn)行病毒敏感性互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)。根據(jù)病情指數(shù)及ELISA結(jié)果，發(fā)現(xiàn)所轉(zhuǎn)的四個(gè)基因均能使突變體完全或部分恢復(fù)對(duì)TuMV侵染的敏感性。這表明，在TuMV侵染白菜類蔬菜作物時(shí)，eIF4E和eIF (iso) 4E都可能參與病毒與寄主的相互作用。同時(shí)作者指出，要想在大白菜中獲得與eIF4E和eIF(iso)4E有關(guān)的抗病毒材料，則這幾個(gè)基因需同時(shí)喪失功能。截止目前，大白菜在上述兩個(gè)基因位點(diǎn)的突變及相關(guān)突變體檢測(cè)的標(biāo)記開發(fā)國內(nèi)外未見報(bào)道。
鑒于此，有必要對(duì)我國豐富的大白菜抗/感TuMV材料中eIF4E和eIF (iso) 4E各個(gè)位點(diǎn)的多態(tài)性進(jìn)行廣泛篩查，以發(fā)現(xiàn)各位點(diǎn)可能存在的突變類型；同時(shí)針對(duì)突變位點(diǎn)與野生型的序列差異，開發(fā)與突變體檢測(cè)有關(guān)的位點(diǎn)特異性分子標(biāo)記。有以下幾個(gè)方面的潛在益處① 可以將該標(biāo)記用于篩查大白菜種群，提供高效的大白菜突變體檢測(cè)手段；②當(dāng)其他位點(diǎn)發(fā)現(xiàn)突變類型時(shí)，可以采用同樣的方法開發(fā)標(biāo)記；③當(dāng)多個(gè)位點(diǎn)的突變位于不同的材料中時(shí)，可以通過標(biāo)記輔助選擇手段將多位點(diǎn)的突變聚合在一起，創(chuàng)造廣譜抗TuMV大白菜新種質(zhì)在培育廣譜抗TuMV大白菜新品種時(shí)，可以實(shí)現(xiàn)標(biāo)記輔助選擇，提高育種效率。 由于這種標(biāo)記直接位于功能基因內(nèi)部，因此選擇的準(zhǔn)確率達(dá)100%。發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)，針對(duì)目前大白菜在eIF4E和eIF (iso) 4E基因位點(diǎn)突變體鑒定方面的空白，本發(fā)明首先獲一個(gè)eIF (iso) 4E. c位點(diǎn)的轉(zhuǎn)座子插入突變體，其次根據(jù)突變位點(diǎn)的序列特點(diǎn)，設(shè)計(jì)引物，開發(fā)了鑒定野生型和突變體的ASM共顯性標(biāo)記并用于標(biāo)記輔助選擇。
本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的
一種與大白菜eIF(is0)4E. c野生型和轉(zhuǎn)座子插入突變體鑒定直接相關(guān)的位點(diǎn)特異性顯性ASM標(biāo)記與野生型位點(diǎn)檢測(cè)相關(guān)的標(biāo)記命名為ASM-4E. c_W，片段大小1216bp，如SEQ IDNo.1所示；對(duì)應(yīng)的突變位點(diǎn)檢測(cè)相關(guān)的標(biāo)記命名為ASM-4e. c_I，片段大小4419bp，如 SEQ IDNo. 2 所示。用于鑒別上述特異性顯性分子標(biāo)記的引物是正向引物PFl :5’ -CGAAGAAGAATATGGCGA-3’ ；反向引物PRl :5’ - AAAAAACCGCTCAAACAAT-3’ ；如 SEQ ID NO. 3、4 所示。本發(fā)明采用同源克隆技術(shù)從一份大白菜抗TuMV和一份大白菜感TuMV自交系材料中分別克隆到了 eIF(iso)4E. c基因全序列，將2個(gè)序列與GenBank中已經(jīng)報(bào)道的B. rapa自交系R-0-18的eIF(iso)4E. c比較后，發(fā)現(xiàn)來自敏感材料的eIF(iso)4E. c與已經(jīng)報(bào)道的完全一致，而來自病毒抗性材料的eIF(iso)4E. c則在第三內(nèi)含子區(qū)插入了一個(gè)3195bp的片段，在NCBI比對(duì)時(shí)，沒有發(fā)現(xiàn)與該插入片段完全同源的序列，但發(fā)現(xiàn)部分序列與擬南芥hAT轉(zhuǎn)座子超家族有部分同源性。因此推斷該突變體是一個(gè)轉(zhuǎn)座子插入突變體。用小寫字 母即eIF(iS0)4e. c2表示，以區(qū)別于本課題組之前鑒定的一個(gè)eIF (iso) 4E. c堿基缺失突變體 eIF (iso) 4e. cl。由于大白菜有三個(gè)eIF(is0)4E基因，且三者之間同源性較高，我們分析了該基因野生型序列的保守序列，在轉(zhuǎn)座子兩側(cè)設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行一次PCR擴(kuò)增，野生型只得到較小的條帶，而突變體由于有轉(zhuǎn)座子插入，得到較大的條帶，一次PCR擴(kuò)增即可將野生型和突變體同時(shí)鑒別出來。該標(biāo)記為共顯性標(biāo)記。故雜合型得到兩條帶。所述ASM標(biāo)記的篩選過程如下(I)以大白菜抗TuMV自交系DaQinBai和TuMV敏感自交系06-247為材料，采用CTAB法，提取兩者的基因組DNA。(2)依據(jù)GenBank中已經(jīng)報(bào)道的B. rapa自交系R-0-18的eIF(iso)4E. c序列，在編碼區(qū)上下游設(shè)計(jì)引物。采用同源克隆技術(shù)，從兩份材料中分別克隆得到了其eIF(is0)4E.c并進(jìn)行測(cè)序。(3)將所得eIF(iso)4E. c與R-0-18的eIF(iso)4E. c序列分別進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)了一處大片段插入突變。(4)將插入部分的序列在NCBI進(jìn)行BLAST分析，發(fā)現(xiàn)插入?yún)^(qū)域與擬南芥hAT轉(zhuǎn)座子超家族同源關(guān)系最近，據(jù)此我們認(rèn)為該突變體為轉(zhuǎn)座子插入突變體。(5)用于擴(kuò)增該基因的引物就是位點(diǎn)特異標(biāo)記篩選的引物，據(jù)此我們認(rèn)為該引物能夠同時(shí)從抗/感材料中將野生型位點(diǎn)和突變位點(diǎn)擴(kuò)增出來，此即為共顯性位點(diǎn)特異性標(biāo)記(ASM)。所述標(biāo)記可以作為分子標(biāo)記應(yīng)用于大白菜種質(zhì)資源鑒定和育種輔助選育，選擇含有DaQinBai中eIF (iso) 4E. c突變類型的種質(zhì)材料或轉(zhuǎn)育后代。具體應(yīng)用方式為利用ASM標(biāo)記的一套引物對(duì)待測(cè)個(gè)體的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測(cè)擴(kuò)增片段大小，如果擴(kuò)增出1216bp的條帶，則為野生型；擴(kuò)出4419bp的條帶則為突變型；如果同時(shí)擴(kuò)出兩條帶，則為雜合型。本發(fā)明的有益效果是由于大白菜eIF4E位點(diǎn)上受多個(gè)基因的控制，在同一份材料中多基因同時(shí)突變的頻率較低。如果能夠分別在各個(gè)位點(diǎn)鑒定出各自的突變體，開發(fā)針對(duì)各個(gè)突變體檢測(cè)的位點(diǎn)特異性分子標(biāo)記，則可以通過聚合雜交并結(jié)合分子標(biāo)記輔助選擇，將多個(gè)突變位點(diǎn)聚合在同一份材料中。本發(fā)明利用同源克隆技術(shù)發(fā)現(xiàn)了 eIF(iS0)4E.C位點(diǎn)的一個(gè)轉(zhuǎn)座子插入突變體并開發(fā)了鑒定該位點(diǎn)的分子標(biāo)記。利用該標(biāo)記可以對(duì)回交轉(zhuǎn)育后代的基因型進(jìn)行準(zhǔn)確選擇，以尋創(chuàng)造遺傳背景更加豐富的突變體材料。其優(yōu)點(diǎn)具體如下
1.本發(fā)明獲得的了一個(gè)eIF(is0)4E. c位點(diǎn)大片段插入的突變體，該突變體有可能是導(dǎo)致材料抗病的主要原因，可以為通過回交手段轉(zhuǎn)育遺傳背景更豐富的突變體提供變異源。在大白菜eIF4E基因序列及突變型研究方面，僅Jenner等(2010)報(bào)道了 B. rapa的一個(gè)自交系R-0-18的序列，其它突變體未見報(bào)道。
2.針對(duì)該突變位點(diǎn)大片段插入，在插入位點(diǎn)兩側(cè)保守區(qū)設(shè)計(jì)引物，獲得了與野生型和突變體檢測(cè)直接相關(guān)的位點(diǎn)特異性共顯性標(biāo)記，該標(biāo)記的開發(fā)可以為種質(zhì)資源鑒定、 通過回交轉(zhuǎn)育等手段篩選和培育不同遺傳背景的突變體材料提供輔助選擇工具。本發(fā)明的應(yīng)用可大大簡(jiǎn)化篩選手段、縮短轉(zhuǎn)育年限，避免了常規(guī)育種方法中選擇的盲目性。


圖1 :兩份大白菜材料eIF(is0)4E. c基因的擴(kuò)增(瓊脂糖凝膠電泳)，W為野生型材料06-247的擴(kuò)增結(jié)果，m為突變體材料DaQinBai的擴(kuò)增結(jié)果，DL5000是DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)。
圖2 :轉(zhuǎn)座子插入突變示意圖，圖中雙向箭頭表示轉(zhuǎn)座子序列插入在野生型 eIF (iso) 4E. c基因的692bp之后，插入片段大小3195bp。
圖3 :插入片段BLAST比對(duì)部分結(jié)果(第三條示hAT 二聚化功能)。
圖4 :特異引物在回交群體中對(duì)部分單株的擴(kuò)增情況(M =DMA分子量標(biāo)準(zhǔn)DL5000. 從結(jié)果可以清楚地確定1-5是突變體單株，6-10是野生型單株)。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特別說明， 均為常規(guī)方法。
實(shí)施例1、不同大白菜自交系材料中eIF(is0)4E. c的克隆
1.1大白菜基因組DNA提取
(I)將大白菜幼苗葉片放入液氮預(yù)冷的研缽中，在液氮中充分研磨成粉末；
(2)待液氮揮發(fā)干，立即轉(zhuǎn)移到2ml的離心管中，每IOOmg材料約加入O. 6ml預(yù)熱至65°C的CTAB提取液，融化后，劇烈振蕩混勻樣品，65°C水浴放置40-60分鐘使細(xì)胞裂解；
(3)裂解結(jié)束后，取出樣品使其完全冷卻至室溫。加入等體積的氯仿 (chloroform),輕輕顛倒使混勻，室溫放置10分鐘；
(4)室溫，12000rpm 離心 15 分鐘；
(5)用移液器小心吸出上層水相，加入新的1. 5ml的離心管中，加入500 μ I的異丙醇(1:1體積)，充分混勻，室溫沉淀IOmin ；
(6) 4°C, 12000rpm 離心 IOmin,小心棄去上清液；
(7) DNA沉淀用lml75%乙醇洗滌。4°C，8000rpm離心IOmin收集沉淀；
(8)重復(fù)用75%乙醇洗滌一次DNA沉淀；
(9)去上清，DNA沉淀于無菌操作臺(tái)上晾干約10_15分鐘，DNA略顯透明，加入適當(dāng)體積(30-50 μ I)的IOmM的Tris. HCl (ρΗ8. O)使沉淀溶解(可放于4°C冰箱溶解過夜)；
(10)紫外分光光度計(jì)及l(fā)%Agr0Se凝膠電泳檢測(cè)DNA濃度及質(zhì)量。1. 2eIF(iso)4E. c的克隆及序列分析(I)檢索B. rapa自交系R-0-18的eIF(iso)4E.c基因全序列(GenBank:HM131211.1)，在編碼區(qū)上游和下游分別設(shè)計(jì)正反向引物，PFl:5’-CGAAGAAGAATATGGCGA-3’PRl :5’ -AAAAAACCGCTCAAACAAT-3’，如 SEQ ID NO. 3,4 所示。(2) PCR擴(kuò)增在20iil反應(yīng)體系中，包含IXLA taq buffer ；20ng的基因組DNA ；0. 4iiM正反向引物；0. 25mM dNTPmix; I個(gè)單位的LA taq。PCR循環(huán)條件95°C預(yù)變性5分鐘；接著是95 °C變性30秒，57. 5 °C退火30秒，72 °C延伸5分鐘，35-38個(gè)循環(huán)，最后72 °C延
伸10分鐘。(3) PCR產(chǎn)物的電泳檢測(cè)PCR結(jié)束后，取IOiilPCR擴(kuò)增產(chǎn)物加入IiU IOXloading buffer，在1%的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，電泳結(jié)束后EB染色，自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)觀察拍照。結(jié)果見圖1。(4) PCR產(chǎn)物的克隆測(cè)序電泳確認(rèn)目的條帶被擴(kuò)增后，取I Ul PCR擴(kuò)增產(chǎn)物加I U I pEasy-T3載體室溫連接10分鐘,轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞Transl-Tl (TransGen :0)501),轉(zhuǎn)化菌在含50 u g/ml卡那霉素的LB固體平板上37°C倒置培養(yǎng)16小時(shí)左右。菌落PCR檢測(cè)后挑取陽性克隆委托北京華大基因有限公司進(jìn)行DNA序列的測(cè)定。(5)所克隆的大白菜eIF(iso)4E. c序列分析將來自TuMV抗性材料DaQinBai和感病材料06-247的fcA. eIF(iso)4E. c基因組序列分別于已知的來自R-0-18的BrA.eIF(iso)4E.c進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)來自TuMV敏感材料06-247的BrA. eIF (iso) 4E. c基因組序列與R-0-18的完全同源，將其命名為BrA.eIF(iso)4E. c，稱為野生型；而來自TuMV抗性材料DaQinBai的BrA. eIF(iso)4E. c有大片段插入，我們將其命名為BrA. eIF(iso)4e. c2，稱為轉(zhuǎn)座子插入突變體。其序列如SEQID NO. 2所示,插入部位示意圖如圖2所示，即從基因組序列(從起始密碼算起)的第692bp(從起始密碼算起)之后插入，且685-692是插入位點(diǎn)的靶序列(TGTTTGAC，即8_bp hostduplication，簡(jiǎn)稱HD)，因?yàn)樵撔蛄性谵D(zhuǎn)座子序列的下游又重復(fù)了一次。同時(shí)轉(zhuǎn)座子區(qū)域兩側(cè)有 17bp 的末端反向重復(fù)(CTGTG (T/G) TTAMATAGCG, Terminal Inverted R印eat 或Inverted Terminal Repeat,簡(jiǎn)稱TIR或ITR)。上述兩點(diǎn)是hAT轉(zhuǎn)座子超家族的典型特征(Rubin E, Lithwick G, Levy AA. Structure and evolution of the hATtransposonsuperfamily. Genetics, 2001, 158(3):949-57)。(6)插入片段功能預(yù)測(cè)將插入部分的3195bp在NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST比對(duì)，發(fā)現(xiàn)與擬南芥第一染色部分序列同源性較高，其中插入部分第1570bp-2630bp與擬南芥hAT轉(zhuǎn)座子超家族同源性最高，檢索結(jié)果見圖3。由此推斷，我們得到的這個(gè)大片段插入的BrA.eIF(iS0)4E.C突變體是個(gè)轉(zhuǎn)座子插入突變體。實(shí)施例2共顯性ASM標(biāo)記的開發(fā)及驗(yàn)證由于BrA. eIF(iso)4E. c和BrA. eIF(iso)4e. c2的基因組序列存在三千多個(gè)堿基的插入突變，用于擴(kuò)增該基因的一對(duì)引物保守性較高，可以用于開發(fā)標(biāo)記。我們用擴(kuò)增該基因的引物在(DaQinBaiX06-247)XDaQinBai的回交群體進(jìn)行了驗(yàn)證。具體實(shí)施細(xì)則如下
(I)回交群體各單株基因組DNA提取如1.1所述。
(2) PCR擴(kuò)增PCR反應(yīng)液的配制及擴(kuò)增條件如1. 2第⑵條所述。
(3)PCR產(chǎn)物的檢測(cè)如實(shí)施例2所述。檢測(cè)結(jié)果如圖4所示，M是分子量標(biāo)準(zhǔn) DL5000,1-10是回交群體的10個(gè)單株。從擴(kuò)增結(jié)果可以看出這對(duì)引物能夠100%鑒定純合野生型、純合突變體，完 全可以用于種質(zhì)資源的篩選和育種輔助選擇。
權(quán)利要求
1.一種大白菜eIF(iso)4E. c位點(diǎn)轉(zhuǎn)座子插入突變體,其特征在于與野生型位點(diǎn)檢測(cè)相關(guān)的標(biāo)記命名為ASM-4E. c-W，片段大小1216bp，如SEQ ID No.1所示；對(duì)應(yīng)的突變位點(diǎn)檢測(cè)相關(guān)的標(biāo)記命名為ASM-4e. c-1，片段大小4419bp，如SEQ ID No. 2所示。
2.權(quán)利要求1所述的大白菜eIF(iso)4E.c位點(diǎn)轉(zhuǎn)座子插入突變體的引物,其特征在于引物序列如下正向引物 PFl :5’-CGAAGAAGAATATGGCGA-3’ ；反向引物 PRl :5’ - AAAAAACCGCTCAAACAAT-3’ ；如 SEQ ID Ν0·3、4 所示。
3.權(quán)利要求1所述的大白菜eIF(is0)4E.c位點(diǎn)轉(zhuǎn)座子插入突變體作為特異性分子標(biāo)記在鑒別大白菜eIF(iso)4E. c位點(diǎn)的基因型中的應(yīng)用。
4.權(quán)利要求2所述的引物在鑒別大白菜eIF(is0)4E.c位點(diǎn)的基因型中的應(yīng)用。
5.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的應(yīng)用，其特征在于具體應(yīng)用方式為利用引物對(duì)待測(cè)個(gè)體的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測(cè)擴(kuò)增片段大小，如果擴(kuò)增出1216bp的條帶，則為野生型；擴(kuò)出4419bp的條帶則為突變型；如果同時(shí)擴(kuò)出兩條帶，則為雜合型。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于所述PCR擴(kuò)增具體為在20μ I反應(yīng)體系中，包含 IXLA taq buffer ;20ng 的基因組DNA ;0. 4 μ M正反向引物；O. 25mM dNTPmix;l 個(gè)單位的LAtaq ；PCR循環(huán)條件95°C預(yù)變性5分鐘；接著是95°C變性30秒，57. 5°C退火30秒，72°C延伸5分鐘，35-38個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸10分鐘。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種與大白菜eIF(iso)4E.c野生型和轉(zhuǎn)座子插入突變體鑒定直接相關(guān)的位點(diǎn)特異性顯性ASM標(biāo)記與野生型位點(diǎn)檢測(cè)相關(guān)的標(biāo)記命名為ASM-4E.c-W，片段大小1216bp，如SEQ ID No.1所示；對(duì)應(yīng)的突變位點(diǎn)檢測(cè)相關(guān)的標(biāo)記命名為ASM-4e.c-I，片段大小4419bp，SEQ ID No.2所示。本發(fā)明利用同源克隆技術(shù)發(fā)現(xiàn)了eIF(iso)4E.c位點(diǎn)的一個(gè)轉(zhuǎn)座子插入突變體并開發(fā)了鑒定該位點(diǎn)的分子標(biāo)記。利用該標(biāo)記可以對(duì)回交轉(zhuǎn)育后代的基因型進(jìn)行準(zhǔn)確選擇，以尋創(chuàng)造遺傳背景更加豐富的突變體材料。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102994497SQ20121045527
公開日2013年3月27日 申請(qǐng)日期2012年11月13日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月13日
發(fā)明者劉栓桃, 趙智中, 張志剛, 李巧云, 盧金東 申請(qǐng)人:山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所