專利名稱：利用家蠶生物反應器表達輪狀病毒vp6蛋白的方法
利用家蠶生物反應器表達輪狀病毒VP6蛋白的方法技術領域
本發(fā)明是一種新的方式生產(chǎn)輪狀病毒VP6蛋白的方法以及所用的重組病毒 BmNPV-RVVP6的獲得方法。
背景技術：
一、家蠶生物反應器
家蠶生物反應器是利用家蠶BmNPV表達系統(tǒng)生產(chǎn)外源蛋白，其外源蛋白表達量高，產(chǎn)物的天然性質(zhì)好。它沒有哺乳類細胞培養(yǎng)系統(tǒng)外源蛋白生產(chǎn)效率低、設備條件要求高等問題，也沒有大腸桿菌的內(nèi)毒素、表達產(chǎn)物糖苷化及生物活性低等缺陷。由于該系統(tǒng)潛在的諸多優(yōu)勢，為人類生產(chǎn)急需的蛋白質(zhì)類藥物、基因工程疫苗和基因工程殺蟲劑等提供了嶄新的途徑，因此近年來受到廣泛重視。
BmNPV基因組是超螺旋的閉環(huán)雙鏈DNA，主要編碼100余種結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白。多角體蛋白基因不是病毒復制的必需基因，在感染晚期進行高效表達。其編碼的多角體蛋白只起到包埋病毒粒子的作用，與病毒粒子的形成沒有直接關系。多角體蛋白基因即使部分或全部被其他外源基因取代，仍能形成有感染性的病毒粒子。根據(jù)這一特性，將外源基因通過基因操作手段替換BmNPV基因中的多角體蛋白基因，從而使BmNPV在蠶體細胞內(nèi)大量表達外源蛋白。
Bm-BacPAK6 DNA 是 Clontech 公司產(chǎn)品，是野生型 BmNPV DNA 與商品化的 BacPAK6 同源重組的產(chǎn)物，其上有3個Bsu36I(Aoc I)酶切位點(圖I)。經(jīng)酶切線性化的Bm_BacPAK6 DNA由于0RF1629被破壞，所以不具感染性。只有與外源DNA發(fā)生同源重組，修復必需基因 0RF1629后，才能使病毒正常地進行繁殖和復制，同時將目的融合基因?qū)氲讲《净蚪M中。由于外源基因的插入導致了 LacZ基因失活，使在X-gal存在時不顯色，少量酶切不完全的線型化病毒具有完整的LacZ基因，在X-gal存在時呈藍色，通過藍白斑的篩選可以篩選處重組病毒，在經(jīng)過2 3輪的篩選就可以獲得純度較高的重組病毒。
共轉(zhuǎn)染后第4天左右，細胞瓶中有一個小區(qū)域的細胞呈發(fā)病感染狀，繼續(xù)培養(yǎng)直至有大量的病毒粒子從細胞中釋放出來。然后取出共轉(zhuǎn)染上清lmL，加2μ I的X-gal，將病毒在27 1條件下繼續(xù)培養(yǎng)24小時，病毒液顏色不變藍，可以初步判別同源重組已經(jīng)成功。
將不同梯度的共轉(zhuǎn)染上清稀釋液感染BmN單層細胞，進行空斑篩選。待培養(yǎng)的細胞產(chǎn)生空斑時，選取第一輪篩選不能產(chǎn)生β -半乳糖苷酶的空斑病毒株(白斑)進入下一輪篩選，以次類推，依次完成第二和第三輪空斑篩選，最后獲得純化的病毒株。
家蠶生物反應器優(yōu)點
家蠶昆蟲桿狀病毒(BmNPV)表達系統(tǒng)是目前被公認的表達量很高的真核表達系統(tǒng)，以家蠶核型多角體病毒作為表達載體，具有特殊的優(yōu)越性(I)在強有力的多角體蛋白啟動子的調(diào)控下，外源基因可在蠶體內(nèi)表達，表達效率可高于培養(yǎng)細胞10-100倍，每頭蠶的表達量可達毫克級；(2)桿狀病毒具有嚴格的宿主專一性，它對脊椎動物或植物均無致病性，是一種比較安全的表達載體；(3)桿狀病毒質(zhì)粒既能表達原核基因又能表達各種真核基因，這些真核基因在昆蟲細胞中可利用信號肽將目的蛋白分泌到胞外，還能有效地進行蛋白質(zhì)翻譯后的加工、轉(zhuǎn)運、糖基化、脂?；土姿峄龋磉_產(chǎn)物的抗原性等生物學活性與天然蛋白質(zhì)相比毫不遜色；(4)家蠶血淋巴中含有蛋白分解酶的抑制物，本身就可作為佐劑，蠶體內(nèi)含豐富脂類物質(zhì)，類似于生物膠囊，保護抗原蛋白不會在胃腸道迅速降解， 表達產(chǎn)物具有口服免疫的前景。(5 )宿主家蠶是人目前唯一可以無菌大規(guī)模飼養(yǎng)經(jīng)濟昆蟲， 可以低成本地大規(guī)模飼養(yǎng)，特別是在家蠶起源地的中國，容易形成自主產(chǎn)業(yè)。說明家蠶桿狀病毒表達系統(tǒng)(BmNPV)是一種更加快速、穩(wěn)定、可靠的系統(tǒng)。
二.輪狀病毒VP6簡介
輪狀病毒(Rotavirus，RV)是世界范圍內(nèi)引起嬰幼兒傳染性重癥腹瀉和幼齡動物腹瀉的主要病原，全世界3歲以下的兒童中約有90%受到RV感染，每年因輪狀病毒腹瀉造成的死亡人數(shù)超過100萬。目前，發(fā)展有效的疫苗，特別是開發(fā)適合給嬰幼兒服用的口服疫苗，仍然是對RV感染最有力的預防和控制措施。
研究表明，VP6蛋白是輪狀病毒第6個基因編碼的內(nèi)殼蛋白，約占病毒蛋白的50 %，并且VP6含有組和亞組特異性抗原，刺激機體產(chǎn)生的抗體對病毒感染有保護作用。Yang 等進行了鼠和牛VP6 DNA注射疫苗研制和試驗，結(jié)果表明疫苗對鼠RV具有部分抵抗作用。 李國華等從我國腹瀉患兒的糞便中克隆到輪狀病毒地方株T114 VP6的全基因序列，將其在苜蓿銀紋夜蛾核型桿狀病毒(AcMNPV)系統(tǒng)中進行表達，結(jié)果表明VP6可以桿狀病毒系統(tǒng)中表達，具有正常的抗原反應性和天然VP6的三體結(jié)構(gòu)。但是，由于嬰幼兒體質(zhì)和發(fā)育特點對疫苗安全性具有特殊要求，使得生物反應器的選擇成為制約嬰幼兒口服輪狀病毒疫苗開發(fā)的關鍵問題。
目前輪狀病毒VP6生產(chǎn)中所遇到的問題
基因長度高，化學合成困難，收率低，生成的副產(chǎn)難以除去，合成路線步驟繁多等缺陷；在生物合成中一般原核表達載體產(chǎn)生的目的蛋白生物活性極低或無生物活性；植物表達系統(tǒng)一般產(chǎn)量低，周期長，難以大規(guī)模投入生產(chǎn)，更難以滿足市場需要；而酵母和動物表達系統(tǒng)生產(chǎn)藥物成本極高,產(chǎn)量極低,也存在相同的問題。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術問題是提供一種應用家蠶生物反應器來進行輪狀病毒VP6 的生產(chǎn)，既能獲得高活性的目的產(chǎn)物，又能降低成本，可規(guī)?；a(chǎn)，以適應市場需求。
為了解決上述技術問題，本發(fā)明提供一種重組病毒BmNPV_RVVP6的獲得方法，其特征是包括以下步驟
I)、選用A組輪狀病毒VP6基因，該基因編碼的序列為SEQ ID NO: I所示；
2)、構(gòu)建重組轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒pBacPAK8_RVVP6 ；
3 )、將構(gòu)建所得的重組轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒pBacPAK8_RVVP6與已線性化的病毒 Bm-BacPAK6 DNA經(jīng)脂質(zhì)體介導共轉(zhuǎn)染家蠶細胞，獲得重組病毒BmNPV_RVVP6。
作為本發(fā)明的重組病毒BmNPV_RVVP6的獲得方法的改進步驟2)為
VP6基因的PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)純化后，得純化后PCR產(chǎn)物，用限制性內(nèi)切酶EcoR I和 BamH I雙酶切，隨后插入經(jīng)過同樣酶切(即，用限制性內(nèi)切酶EcoR I和BamH I雙酶切)的轉(zhuǎn)移質(zhì)粒PBacPAK8 (純化后載體質(zhì)粒PBacPAK8)中，并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌(E. coli) TGl感受態(tài)細胞進行陽性菌落篩選，得質(zhì)粒pBacPAK8-RVVP6。
作為本發(fā)明的重組病毒BmNPV_RVVP6的獲得方法的進一步改進步驟2)包括以下步驟
①、純化后載體質(zhì)粒PBacPAK8和純化PCR產(chǎn)物的雙酶切；
②、酶切產(chǎn)物處理
雙酶切后，1%凝膠電泳，分別割膠回收PCR酶切后小片段以及PBacPAK8載體大片段；利用膠回收試劑盒分別純化回收；
③、重組連接載體DNA和目的基因；
連接反應體系
權(quán)利要求
1.重組病毒BmNPV-RVVP6的獲得方法，其特征是包括以下步驟 1)、選用A組輪狀病毒VP6基因，該基因編碼的序列為SEQID NO: I所示； 2)、構(gòu)建重組轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒pBacPAK8-RVVP6； 3)、將構(gòu)建所得的重組轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒pBacPAK8-RVVP6與已線性化的病毒Bm_BacPAK6DNA經(jīng)脂質(zhì)體介導共轉(zhuǎn)染家蠶細胞，獲得重組病毒BmNPV-RVVP6。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的重組病毒BmNPV-RVVP6的獲得方法，其特征是所述步驟2)為 VP6基因的PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)純化后，得純化后PCR產(chǎn)物，用限制性內(nèi)切酶EcoR I和BamH I雙酶切，隨后插入經(jīng)過同樣酶切的轉(zhuǎn)移質(zhì)粒PBacPAK8中，并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌TGl感受態(tài)細胞進行陽性菌落篩選，得質(zhì)粒pBacPAK8-RVVP6。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的重組病毒BmNPV-RVVP6的獲得方法，其特征是所述步驟2)包括以下步驟 ①、純化后載體質(zhì)粒PBacPAK8和純化PCR產(chǎn)物的雙酶切； ②、酶切產(chǎn)物處理 雙酶切后，凝膠電泳，分別割膠回收PCR酶切后小片段以及PBacPAK8載體大片段；利用膠回收試劑盒分別純化回收； ③、重組連接載體DNA和目的基因； 連接反應體系
4.根據(jù)權(quán)利要求1、2或3所述的重組病毒BmNPV-RVVP6的獲得方法，其特征是所述步驟3)為 提取家蠶桿狀病毒Bm-BacPAK6 DNA,并用Bsu36 I酶切使之線性化，得線性化家蠶桿狀病毒Bm-BacPAK6 DNA ;提取pBacPAK8-RVVP6質(zhì)粒與線性化家蠶桿狀病毒Bm-BacPAK6 DNA共轉(zhuǎn)染入家蠶BmN細胞。
5.利用家蠶生物反應器表達輪狀病毒VP6蛋白的方法，其特征是包括以下步驟 將重組病毒BmNPV-RVVP6接種于家蠶細胞，從而進行重組蛋白RVVP6在家蠶細胞中的表達鑒定。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種重組病毒BmNPV-RVVP6的獲得方法，包括以下步驟1)選用A組輪狀病毒VP6基因；2)構(gòu)建重組轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒pBacPAK8-RVVP6；3)將構(gòu)建所得的重組轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒pBacPAK8-RVVP6與已線性化的病毒Bm-BacPAK6 DNA經(jīng)脂質(zhì)體介導共轉(zhuǎn)染家蠶細胞，獲得重組病毒BmNPV-RVVP6。本發(fā)明用BmNPV-RVVP6感染家蠶BmN、5齡幼蟲和蠶蛹，使重組蛋白VP6在家蠶中獲得表達的技術，該方法原料易得，生產(chǎn)成本低，且無毒害，為新型輪狀病毒疫苗的研制提供了新途徑。
文檔編號C12N15/66GK102978240SQ201210451970
公開日2013年3月20日 申請日期2012年11月12日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月12日
發(fā)明者李司, 張耀洲 申請人:浙江理工大學