專利名稱：水曲柳懸浮培養(yǎng)體系的建立方法
技術(shù)領(lǐng)域：
一種利用基本培養(yǎng)基和附加不同激素成份對(duì)水曲柳懸浮培養(yǎng)體系的建立方法，本發(fā)明屬于植物細(xì)胞工程技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
水曲柳(Fraxinusm andshu rica.)屬于木犀科白臘樹屬，是一種高大落葉喬木，為我國(guó)東北珍貴的“三大硬闊”之一，木材材質(zhì)優(yōu)良，紋理美觀，廣泛應(yīng)用于各領(lǐng)域。國(guó)外已有研究發(fā)現(xiàn)其樹皮中含有香豆素類成分，包括秦皮甲素(Esculin)，秦皮乙素(Esculetin),秦皮苷(Fraxin),異秦皮定(Isofraxidin),白臘樹精(Mandshurin, Fraxinol) 0香豆素類化合物不僅能直接抑制癌細(xì)胞，而且可以通過(guò)增 強(qiáng)機(jī)體免疫力產(chǎn)生抗癌作用。但目前香豆素類化合物主要來(lái)自于木樨科白蠟樹樹皮和葉中，這極大的造成了資源的浪費(fèi)和破壞，不利于可持續(xù)發(fā)展。如果能運(yùn)用細(xì)胞工程手段，利用細(xì)胞大量培養(yǎng)及代謝產(chǎn)物分離，提高水曲柳中香豆素類物質(zhì)含量，同時(shí)避免季節(jié)性對(duì)生產(chǎn)帶來(lái)的影響，這將對(duì)水曲柳中香豆素的生產(chǎn)與利用具有重要的意義。以單細(xì)胞或小細(xì)胞團(tuán)作為對(duì)象進(jìn)行水曲柳細(xì)胞、基因工程等研究具有很大優(yōu)勢(shì)，因?yàn)閱渭?xì)胞或小細(xì)胞團(tuán)受周圍細(xì)胞和微環(huán)境影響較小，而且遺傳上比較穩(wěn)定；生長(zhǎng)速度快，通過(guò)生物技術(shù)手段對(duì)再生植株進(jìn)行選擇，可大大縮短育種年限。目前，對(duì)水曲柳組織培養(yǎng)研究主要通過(guò)嫩莖尖直接再生苗、休眠冬芽萌動(dòng)、種子直接發(fā)芽。而利用愈傷組織再生及懸浮細(xì)胞培養(yǎng)還未見(jiàn)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是在于提供一種水曲柳懸浮體系建立的方法，方法易行，操作方便，增殖速度塊，可加快水曲柳的快速繁殖。為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)措施I.以水曲柳葉柄作為外植體，用75%酒精浸泡10-30s，用O. 1%的Ca(ClO)2處理2-5min，用無(wú)菌水沖洗3_6次；2.將消毒好的葉柄在培養(yǎng)皿中用無(wú)菌刀切割成O. 5_2cm左右的小段，接種于固體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基的有效成分為=WPM培養(yǎng)基和附加成份，附加成份為TDZ O. 1-1. Omg/L+NAA O. 5-2. Omg/L+ 瓊脂 5000_8000mg/L+ 蔗糖 2%_3% ；3.光照培養(yǎng)，溫度25_28°C，每天光照10_16h，培養(yǎng)10_30d ；4.將誘導(dǎo)出的愈傷組織用無(wú)菌刀切成O. 4-0. 8cm,接種到含有30_50mL液體培養(yǎng)基的100-150mL的三角瓶中，每瓶接種愈傷組織30-50塊，置于轉(zhuǎn)速為100_130r/min的搖床上，溫度25-28°C，每天光照10-16h，培養(yǎng)10_15d繼代一次。培養(yǎng)及成份為WPM培養(yǎng)基和附加成份，附加成份為BA O. 05-0. 5mg/L+2, 4-D O. 1-1. Omg/L+蔗糖2%-3%。WPM培養(yǎng)基的成份(單位mg/L)
大量元素①NH4NO3400②KH2PO4170③MgS04.7H20370④K2SO4990
鈣鹽①Ca (NO3) 2 · 4H20556②CaCl2 · 2H2096微量元素①Na2MoO4 · 2H20O. 25②MnSO4 · H2O22. 5③ZnSO4 · 7H208. 6④CuSO4 · 5H20O. 25⑤H3BO36. 2鐵鹽①FeSO4 · 7H2027. 8②Na2-EDTA37. 3有機(jī)物①肌醇100②維生素BII. O③煙酸O. 5④維生素B6O. 5⑤甘氨酸2. O⑥肌醇100本發(fā)明水曲柳懸浮培養(yǎng)體系的建立方法主要具有以下幾方面的優(yōu)點(diǎn)I.生產(chǎn)成本低，可實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)本發(fā)明以液體作為培養(yǎng)基，去除瓊脂，本發(fā)明方法的成本相比于傳統(tǒng)的固體培養(yǎng)技術(shù)有顯著降低，可實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。2.細(xì)胞繁殖速度快采用本發(fā)明細(xì)胞細(xì)胞懸浮培養(yǎng)方法，水曲柳可在15-20d獲得大量單細(xì)胞和細(xì)胞團(tuán)，可用于生物反應(yīng)器培養(yǎng)，可大大提高繁殖率，繁殖率可達(dá)10倍以上。


圖I水曲柳懸浮細(xì)胞系側(cè)面觀察2水曲柳懸浮細(xì)胞系底部觀察圖
具體實(shí)施例方式本發(fā)明的目的在于提供了一種水曲柳懸浮培養(yǎng)體系的建立方法，方法易行，操作方便，增殖速度快，可加快水曲柳的快速繁殖。為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)措施I.以水曲柳莖段作為外植體，用75%酒精浸泡IOs或20s或25s或28s或30s，用O.1%的Ca (ClO) 2處理2min或3min或5min，用無(wú)菌水沖洗3次或4次或5次或6次；2.將消毒好的莖段在培養(yǎng)皿中用無(wú)菌刀切割成O. 5-2cm左右的小段，接種于固體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基的有效成分為=WPM培養(yǎng)基和附加成份，附加成份為TDZ O. 1-1. Omg/L+NAA O. 5-2. Omg/L+ 瓊脂 5000_8000mg/L+ 蔗糖 2%_3% ；3.光照培養(yǎng)，溫度25_28°C，每天光照10_16h，培養(yǎng)10_30d ；4.將誘導(dǎo)出的愈傷組織用無(wú)菌刀切成O. 4-0. 8cm,接種到含有30_50mL液體培養(yǎng)基的100-150mL的三角瓶中，每瓶接種愈傷組織30-50塊，置于轉(zhuǎn)速為100_130r/min的搖床上，溫度25-28°C，每天光照10-16h，培養(yǎng)10_15d繼代一次。培養(yǎng)及成份為WPM培養(yǎng)基和附加成份，附加成份為BA O. 05-0. 5mg/L+2, 4-D O. 1-1. Omg/L+蔗糖 2%-3% ；5.連續(xù)繼代培養(yǎng)3-5次，獲得生長(zhǎng)均勻穩(wěn)定的細(xì)胞系。
權(quán)利要求
1.一種水曲柳(Fraxinusm andshu rica.)愈傷組織細(xì)胞懸浮體系的培養(yǎng)方法,包括以下步驟(I)水曲柳的外植體消毒后接種在啟動(dòng)培養(yǎng)基上，得到愈傷組織；(2)將步驟(I)所得島的無(wú)菌愈傷組織，切成小塊，接種到液體培養(yǎng)基中；(3)置于搖床上振蕩、光照培養(yǎng)；(4)繼代培養(yǎng)后可得到懸浮細(xì)胞系。
2.按照專利要求I所述的方法，其特征在于，步驟(I)中所述的水曲柳外植體為水曲柳的莖段。
3.按照專利要求I所述的方法，其特征在于，步驟(I)中所述的消毒方式是用75%酒精浸泡10-30s，用O. 1%的Ca(ClO)2處理2_5min，用無(wú)菌水沖洗3-6次。
4.按照專利要求I所述的方法，其特征在于，步驟(I)中所述的啟動(dòng)培養(yǎng)基的組成為WPM+TDZ O. 1-1. Omg/L+NAA O. 5-2. Omg/L+ 瓊脂 5000-8000mg/L+ 蔗糖 2%_3%。
5.按照專利要求I所述的方法，其特征在于，步驟(I)中所述的液體培養(yǎng)基的組成為WPM+BA O. 05-0. 5mg/L+2, 4-D O. 1-1. Omg/L+ 蔗糖 2%_3%。
6.按照專利要求I所述的方法，其特征在于，步驟(I)中所述的振蕩、光照培養(yǎng)條件為搖床轉(zhuǎn)速為100-130r/min，溫度25_28°C，每天光照10_16h。
7.按照專利要求I所述的方法，其特征在于，步驟(I)中所述的繼代培養(yǎng)時(shí)間為10-20d繼代一次，連續(xù)繼代培養(yǎng)3-5次。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種水曲柳懸浮細(xì)胞體系的建立方法，1)以水曲柳莖段作為外植體，誘導(dǎo)愈傷組織，在添加激素TDZ和BA、蔗糖、瓊脂的WPM固體培養(yǎng)基上獲得愈傷組織；2)將步驟1)中得到的愈傷組織接種到添加激素BA和2,4-D、蔗糖的WPM液體培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)。3)培養(yǎng)10-15d繼帶一次，連續(xù)繼帶培養(yǎng)3-5個(gè)繼帶，獲得生長(zhǎng)均勻、快速增殖的懸浮細(xì)胞系。本發(fā)明具有繁殖速度快、培養(yǎng)規(guī)模大和提供大量均勻植物細(xì)胞培養(yǎng)物的特點(diǎn)。
文檔編號(hào)C12N5/02GK102888379SQ20121043719
公開日2013年1月23日 申請(qǐng)日期2012年11月6日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月6日
發(fā)明者齊鳳慧, 詹亞光, 曾凡鎖 申請(qǐng)人:東北林業(yè)大學(xué), 齊鳳慧, 詹亞光