專(zhuān)利名稱(chēng)：一種燒骨dna的檢測(cè)方法
一種燒骨DNA的檢測(cè)方法技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于法醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種燒骨DNA的檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
骨骼屬于硬組織，對(duì)各種因素有較高的抵抗性，骨細(xì)胞的破壞相對(duì)緩慢其自身組織結(jié)構(gòu)具有良好的抗腐敗作用，能夠保護(hù)內(nèi)部DNA結(jié)構(gòu)，減緩DNA降解和污染，因而成為與焚燒有關(guān)的案件和事故中物證缺乏情況下的首選檢材。骨骼中DNA含量很低，且溫度升高， 加速了遺傳物質(zhì)水解反應(yīng)、氧化反應(yīng)的速率，DNA解鏈、斷裂直至完全被破壞。升至一定溫度，致使模板量嚴(yán)重不足，無(wú)法提取出DNA而導(dǎo)致檢材無(wú)法判定。尋找行之有效的提取燒骨DNA的方法是法醫(yī)學(xué)工作者亟待解決一個(gè)難題。目前，苯酚-氯仿法、硅珠法、硅化濾膜、 Chelex-IOO法、NaI法都是提取人體組織DNA有效的方法，十六烷基三甲基溴化胺(CTAB) 法以及利用熱離析作用協(xié)同PCR技術(shù)可以對(duì)新鮮骨骼DNA進(jìn)行提取，但對(duì)燒骨微量DNA進(jìn)行提取，尚處于實(shí)驗(yàn)階段。發(fā)明內(nèi)容
為解決現(xiàn)有技術(shù)存在的上述缺陷，本發(fā)明的目的在于提供一種對(duì)燒骨DNA進(jìn)行有效提取和檢測(cè)的方法，用于涉骨案件或事故中燒骨的個(gè)人識(shí)別、親權(quán)鑒定和同一認(rèn)定。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案該燒骨DNA的檢測(cè)方法，其特征在于按下述步驟操作I.燒骨DNA的提取和純化(O樣本機(jī)械粉碎后置于生物冷凍研磨機(jī)研磨，預(yù)冷15min，研磨2次，每次研磨 IOmin ；(2)取骨粉2.Og,由8-10ml的乙二胺四乙酸二鈉對(duì)骨粉脫鈣，50°C水浴脫鈣2 3d， 脫鈣2 3次；(3)加入裂解液,所述裂解液由20mg/ml的蛋白酶K20 μ I, I mmol/1的二硫蘇糖醇 20 μ I和4%的十二烷基硫酸酯鈉250 μ I混勻配制而成，置于50°C水浴8 12h，追加裂解液2 3次，靜置10h，冷凍離心，取上液；(4)加入飽和酚450μ I和體積比24 1的三氯甲烷、異戊醇混合液100 μ 1，混勻，離心后取上液，再加入體積比24 1的三氯甲烷、異戊醇混合液600μ 1，混勻，離心后取上液；(5)加入正丁醇600μ 1，混勻，離心后棄上液，乙醚600 μ 1，混勻，離心后棄上液，置于 50°C，數(shù)分鐘，揮發(fā)完全；(6)加入BufferPB 5ml、RNA I μ 1，冷凍離心后取上液，通過(guò)硅膜管，每次約700 μ 1， 離心數(shù)次，棄下液，用磷酸鹽緩沖液700 μ I洗一次；(7)加入BufferPE洗液Iml,混勻，離心重復(fù)2 3次,離心轉(zhuǎn)速8000r/min,離心時(shí)間 8min ；(8)將步驟7的離心后底物，加入已有30μI溴化乙錠EB試管中，置于52°C水浴5min，再冷凍離心，轉(zhuǎn)速13000r/min，離心時(shí)間8min ；2.吸取DNA樣品，ND-1000光度計(jì)檢測(cè)DNA含量，分別測(cè)定在260nm和280nm處的吸光度，讀取DNA樣品濃度和純度；3.PCR復(fù)合擴(kuò)增配制PCR反應(yīng)體系，反應(yīng)體系經(jīng)預(yù)變性、變性、退火、延伸30個(gè)循環(huán)反應(yīng)，25°C保存；4.自動(dòng)基因分析儀進(jìn)行擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)PCR產(chǎn)物經(jīng)變性、冰浴后，加入遺傳分析儀96孔反應(yīng)板的反應(yīng)孔內(nèi)，啟動(dòng)基因分析儀， 進(jìn)行毛細(xì)管電泳，電泳信息由數(shù)據(jù)收集軟件自動(dòng)收集，電泳結(jié)束后，GeneMapper分析軟件把收集的電泳圖譜信息經(jīng)計(jì)算機(jī)處理成數(shù)據(jù)信息，與等位基因分子內(nèi)標(biāo)比對(duì)。
該方法能對(duì)燒骨DNA進(jìn)行有效提取和檢測(cè)，用于涉骨案件或事故中燒骨的個(gè)人識(shí)別、親權(quán)鑒定和同一認(rèn)定。
具體實(shí)施方式
該燒骨DNA檢測(cè)方法，其特征在于按下述步驟操作1.燒骨DNA的提取和純化(1)樣本機(jī)械粉碎后置于生物冷凍研磨機(jī)研磨，設(shè)置預(yù)冷15min,研磨2次，每次 IOmin ；(2)取骨粉2.Og,由8-10ml的乙二胺四乙酸二鈉對(duì)骨粉脫鈣，50°C水浴脫鈣2 3d， 中間更換2 3次，每次更換時(shí)均要離心；(3)加入裂解液，所述裂解液由20mg/ml的蛋白酶K(PK )20μ I, lmmol/1的二硫蘇糖醇(DTT) 20 μ I和4%的十二烷基硫酸酯鈉(SDS) 250 μ I混勻，置于50°C水浴8 12h， 追加裂解液2 3次，靜置10h，冷凍離心，取上液；(4)加入飽和酚450μ I和體積比24 1的三氯甲烷、異戊醇混合液100 μ 1，混勻，離心后取上液，再加入體積比24 1的三氯甲烷、異戊醇混合液600μ 1，混勻，離心后取上液；(5)加入正丁醇600μ 1，混勻，離心后棄上液，乙醚600 μ 1，混勻，離心后棄上液，置于 50°C，數(shù)分鐘，揮發(fā)完全；(6)加入BufferPB 5ml、RNA I μ 1，冷凍離心后取上液，通過(guò)硅膜管，每次約700 μ 1， 離心數(shù)次，棄下液，用磷酸鹽緩沖液(PB) 700 μ I洗一次；(7)加入BufferPE洗液,混勻，離心重復(fù)2 3次，8000r,8min ；(8)將步驟7的離心后底物，加入已有30μ I溴化乙錠EB試管中，置于52°C水浴5min， 再冷凍離心，轉(zhuǎn)速13000r/min，離心時(shí)間8min ；2.DNA濃度和純度測(cè)定吸取I μ IDNA樣品，ND-1000光度計(jì)檢測(cè)DNA含量，分別測(cè)定在260nm和280nm處的吸光度，讀取DNA樣品濃度和純度，DNA純度以0D260/0D280值示；3.PCR復(fù)合擴(kuò)增(1)合適濃度為(O.01 O. 125) ng/ μ 1，每次使用4 μ 1DNA, Id 熒光定量qPCR預(yù)混液(ID混液)6 μ I，PCR總體積是10 μ I ;(2)PCR反應(yīng)體系由PCR反應(yīng)緩沖液、三磷酸堿基脫氧核苷酸(dNTPs )、模板DNA、引物、 DNA聚合酶及Mg2 +組成；(3)反應(yīng)體系10μ 1，反應(yīng)參數(shù):預(yù)變性，95 °C，Ilmin ;變性，94°C Imin ;退火，59°C， Imin ;延伸，72°C Imin ;最后延伸，60°C，60min ;變性、退火、延伸共30個(gè)循環(huán)，25°C保存；4.自動(dòng)基因分析儀進(jìn)行擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)(1)在200μ I的離心管中加入14. 5μ I甲酰胺，O. 5μ I分子量?jī)?nèi)標(biāo)，和1μ I PCR產(chǎn)物， 95°C 變性 4min ；(2)冰浴4min后，將樣品加入遺傳分析儀96孔反應(yīng)板的反應(yīng)孔內(nèi)，啟動(dòng)基因分析儀， 編寫(xiě)相應(yīng)的程序開(kāi)始進(jìn)行毛細(xì)管電泳，電泳信息由數(shù)據(jù)收集軟件自動(dòng)收集，電泳條件為電壓15kV，電流140 μ Α,時(shí)間2h，溫度為60°C ；(3)電泳結(jié)束后，GeneMapper分析軟件把收集的電泳圖譜信息經(jīng)計(jì)算機(jī)處理成數(shù)據(jù)信息，與等位基因分子內(nèi)標(biāo)比對(duì)。
該方法能對(duì)燒骨DNA進(jìn)行有效提取和檢測(cè)，用于涉骨案件或事故中燒骨的個(gè)人識(shí)別、親權(quán)鑒定和同一認(rèn)定。
權(quán)利要求
1.一種燒骨DNA的檢測(cè)方法，其特征在于按下述步驟操作 a.燒骨DNA的提取和純化 (O樣本機(jī)械粉碎后置于生物冷凍研磨機(jī)研磨，預(yù)冷15min，研磨2次，毎次研磨IOmin ； (2)取骨粉2.Og,由8-10ml的こニ胺四こ酸ニ鈉對(duì)骨粉脫鈣，50°C水浴脫鈣2 3d，脫鈣2 3次； (3)加入裂解液,所述裂解液由20mg/ml的蛋白酶K20 μ I, I mmol/1的ニ硫蘇糖醇。20 μ I和4%的十二烷基硫酸酯鈉250 μ I混勻配制而成，置于50°C水浴8 12h，追加裂解液2 3次，靜置10h，冷凍離心，取上液； (4)加入飽和酚450μI和體積比24 1的三氯甲烷、異戊醇混合液100μ 1，混勻，離心后取上液，再加入體積比24 1的三氯甲烷、異戊醇混合液600 μ 1，混勻，離心后取上液； (5)加入正丁醇600μ 1，混勻，離心后棄上液，こ醚600 μ 1，混勻，離心后棄上液，置于。50°C，數(shù)分鐘，揮發(fā)完全； (6)加入BufferPB 5ml、RNA I μ 1，冷凍離心后取上液，通過(guò)硅膜管，每次約700 μ 1，離心數(shù)次，棄下液，用磷酸鹽緩沖液700 μ I洗一次； (7)加入BufferPE洗液Iml,混勻，離心重復(fù)2 3次,離心轉(zhuǎn)速8000r/min,離心時(shí)間8min ； (8)將步驟7的離心后底物，加入已有30μI溴化こ錠EB試管中，置于52°C水浴5min，再冷凍離心，轉(zhuǎn)速13000r/min，離心時(shí)間8min ； b.吸取DNA樣品，ND-1000光度計(jì)檢測(cè)DNA含量，分別測(cè)定在260nm和280nm處的吸光度，讀取DNA樣品濃度和純度； c.PCR復(fù)合擴(kuò)增 配制PCR反應(yīng)體系，反應(yīng)體系經(jīng)預(yù)變性、變性、退火、延伸30個(gè)循環(huán)反應(yīng)，25°C保存； d.自動(dòng)基因分析儀進(jìn)行擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè) PCR產(chǎn)物經(jīng)變性、冰浴后，加入遺傳分析儀96孔反應(yīng)板的反應(yīng)孔內(nèi)，啟動(dòng)基因分析儀，進(jìn)行毛細(xì)管電泳，電泳信息由數(shù)據(jù)收集軟件自動(dòng)收集，電泳結(jié)束后，GeneMapper分析軟件把收集的電泳圖譜信息經(jīng)計(jì)算機(jī)處理成數(shù)據(jù)信息，與等位基因分子內(nèi)標(biāo)比對(duì)。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了法醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域一種燒骨DNA檢測(cè)方法，具體操作步驟包括取燒骨檢材，生物冷凍研磨，EDTA脫鈣，改良酚－氯仿提取DNA，ND-1000光度計(jì)檢測(cè)DNA濃度和純度；5色熒光標(biāo)記，PCR復(fù)合擴(kuò)增，基因分析儀毛細(xì)管電泳，GeneMapper軟件對(duì)DNA基因位點(diǎn)收集數(shù)據(jù)和分析。該方法能對(duì)燒骨DNA進(jìn)行有效提取和檢測(cè)，用于涉骨案件或事故中燒骨的個(gè)人識(shí)別、親權(quán)鑒定和同一認(rèn)定。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102978281SQ201210432389
公開(kāi)日2013年3月20日 申請(qǐng)日期2012年11月2日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月2日
發(fā)明者徐國(guó)昌, 楊雷, 范迎, 陳志國(guó), 侯俊然, 趙旭林, 卞華 申請(qǐng)人:南陽(yáng)理工學(xué)院