一種以十二烷基硫酸鈉輔助植物甾醇組合物制備雄甾4-烯-3,17-雙酮的方法
【專(zhuān)利摘要】一種以十二烷基硫酸鈉輔助植物甾醇組合物制備雄甾4-烯-3,17-雙酮的方法，在具有諾卡氏菌屬或分支桿菌屬微生物的反應(yīng)器中加入用含有十二烷基硫酸鈉的增溶劑或乳化劑和植物甾醇組合物，進(jìn)行發(fā)酵，使植物甾醇組合物轉(zhuǎn)變?yōu)樾坨?4烯-3,17二酮和/或雄甾-1,4-二烯-3,17二酮。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種以十二烷基硫酸鈉輔助植物留醇組合物制備雄甾4-烯-3, 17-雙酮的方法
發(fā)明領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及一種雄甾化合物的生物發(fā)酵制備方法，尤其涉及一種制備雄甾-4-烯-3，17-雙酮的方法。
【背景技術(shù)】:
[0002]雄留4-烯-3,17-雙酮(androst-4-ene_3,17-dione,簡(jiǎn)稱(chēng):雄烯二酮或 AD)是留體激素類(lèi)藥物不可替代的中間體，對(duì)機(jī)體起著非常重要的調(diào)節(jié)作用?？梢哉f(shuō)幾乎所有甾體激素藥物都是以AD作為起始原料進(jìn)行生產(chǎn)的。如用于生產(chǎn)性激素、孕激素、蛋白同化激素及皮質(zhì)激素，又可用于合成氫化可的松，氧化潑尼松，黃體酮、雌烯醇、地塞米松等100余種藥物，也是直接用于生產(chǎn)抗早孕藥米非司酮和各類(lèi)計(jì)劃生育用藥的必不可少的基本原料。如今AD不斷被一些發(fā)達(dá)國(guó)家用于開(kāi)發(fā)和生產(chǎn)新的醫(yī)藥主品，如福美司坦(Formestane或Lentaron)，等及類(lèi)固醇類(lèi)激素免疫抗原等，目前全世界范圍內(nèi)，AD的應(yīng)用領(lǐng)域日益拓寬，用AD做原材料生產(chǎn)的醫(yī)藥品種不斷增加。
[0003]由于化學(xué)全合成雄烯二酮成本較高，國(guó)內(nèi)外很多科學(xué)家一直研究如何通過(guò)生物發(fā)酵方法得到雄烯二酮。50年代，美國(guó)Upjohn公司首先利用側(cè)鏈上有雙鏈的大豆留醇和麥角甾醇為原料生產(chǎn)出雄留-4-烯-3，17 二酮(AD)及雄留-1,4- 二烯-3，17- 二酮(ADD)并以此作為合成留體藥物的原料。近年來(lái)，由于留體藥物應(yīng)用量逐年增加，人們的目光又轉(zhuǎn)到在動(dòng)植物界中含量較多的膽留醇，谷留醇，菜油留醇等，并被認(rèn)為是具有巨大潛能的留體激素類(lèi)藥物的起始原料。20世紀(jì)60年代中期，由Sih等首先發(fā)現(xiàn)有些微生物可以選擇性降解切除留醇的飽和側(cè)鏈而得到A D和ADD，70年代初，日本的有馬啟利用微生物降解膽甾醇生產(chǎn)ADD獲得成功，受到許多制藥公司的高度重視。為了大量生產(chǎn)類(lèi)固醇激素，研究者試圖使用留醇為唯一碳源分離微生物和改變留醇結(jié)構(gòu)用作發(fā)酵的底物，并用能防止留醇核降解的化學(xué)添加劑來(lái)提高類(lèi)固醇的收得率，這一努力已獲得很大進(jìn)展(Marsheck等，ApliedMicroobiology, 23 (I):72~77，1972)。此外，埃及國(guó)家研究中心生物與天然產(chǎn)品化學(xué)系的和Sallam等研究發(fā)現(xiàn)，利用磷酸鹽緩沖液調(diào)節(jié)底物培養(yǎng)基pH值5.5~7.38可提高生物降解AD、ADD的轉(zhuǎn)化率。Upjohn公司在美國(guó)專(zhuān)利N0.4，293，644中描述了一種通過(guò)分枝桿菌(ATCC29472)的突變株從多種類(lèi)固醇中得到以高產(chǎn)量的雄_4_烯-3，17-二酮(AD)為主，并有少量雄-1，4-二烯-3，17-二酮(ADD)的產(chǎn)物的方法。以后的研究發(fā)現(xiàn)節(jié)桿菌，諾卡氏菌和分枝桿菌等微生物均可用于直接切除留醇的飽和側(cè)鏈，在一定條件下得到AD和ADD，這使得微生物轉(zhuǎn)化工業(yè)化生產(chǎn)成為可能。
[0004]由于生物發(fā)酵方法研究較多的是菌種，但發(fā)酵效果除了與菌種本身密切相關(guān)外，菌種在發(fā)酵過(guò)程中所使用的方法也十分重要。楊英在文章中指出(微生物降解留醇側(cè)鏈轉(zhuǎn)化雄留-4-烯-3 □ 17- 二酮的研究進(jìn)展，微生物學(xué)通報(bào)，2006年33 (6)，142-145)留醇底物在水溶液培養(yǎng)基中溶解度差和存在嚴(yán)重的產(chǎn)物(底物)抑制的問(wèn)題一直困擾了整個(gè)留類(lèi)工業(yè)，甾醇是一種疏水性化合物，在水中溶解度極低，這就導(dǎo)致底物與微生物細(xì)胞不能很好的接觸，使轉(zhuǎn)化率偏低及轉(zhuǎn)化時(shí)間延長(zhǎng)。采用超聲破碎、表面活性劑及有機(jī)溶劑來(lái)溶解底物雖然取得了一定成果，但表面活性劑和有機(jī)溶劑對(duì)細(xì)胞的活性有一定的抑制從而制約了它的應(yīng)用。
[0005]分支桿菌(Mycobacterium sp.)是一種可以使植物甾醇發(fā)酵而得到雄甾-4-烯-3，17 二酮(AD)及雄甾-1，4- 二烯-3，17- 二酮(ADD)的重要菌種，其發(fā)酵過(guò)程也存在上述問(wèn)題。
[0006]同時(shí)利用分支桿菌進(jìn)行發(fā)酵，時(shí)間較長(zhǎng)，往往長(zhǎng)達(dá)72小時(shí)，多篇文獻(xiàn)對(duì)此均進(jìn)行了可介紹，例如CN03804973，而長(zhǎng)時(shí)間發(fā)酵的問(wèn)題在于首先是容易造成微生物過(guò)分發(fā)酵，將得到的AD/ADD轉(zhuǎn)化為9d-羥基睪酮甚至將留環(huán)降解，其次是反應(yīng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)使雜菌增加，而培養(yǎng)菌的轉(zhuǎn)化專(zhuān)一性下降，從而增加雜質(zhì)，第三長(zhǎng)時(shí)間反應(yīng)還會(huì)造成生產(chǎn)周期、制造成本、人工成本等上升，不利于工業(yè)化。

【發(fā)明內(nèi)容】
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[0007]一種由植物留醇組合物為底物制備雄留-4烯-3，17 二酮和/或雄留-1，4-二烯-3，17-二酮的方法，其特征在于在具有諾卡氏菌屬或分支桿菌屬微生物的反應(yīng)器中加入用含有十二烷基硫酸鈉的增溶劑或乳化劑和植物留醇組合物，調(diào)節(jié)PH值大于7，在20-37°C之間進(jìn)行發(fā)酵，使植物留醇組合物轉(zhuǎn)變?yōu)樾哿?4烯-3，17 二酮和/或雄留_1，4_二烯-3，17 二酮。
[0008]所述制備方法，雄甾-4烯-3，17 二酮與雄甾-1，4-二烯-3，17 二酮的重量比為I: 0.01-0.1，優(yōu)選為 I: 0.01-0.05。
·[0009]所述制備方法，發(fā)酵溫度為20_30°C。
[0010]所述制備方法，反應(yīng)時(shí)間為20-60小時(shí)，優(yōu)選為25-50小時(shí)。
[0011]所述制備方法，反應(yīng)中pH在7-9之間，pH在7.5-8之間。
[0012]所述制備方法，分支桿菌屬微生物需要培養(yǎng)基培養(yǎng)。
[0013]所述制備方法，培養(yǎng)基含有瓊脂、碳源、氮源、PH調(diào)節(jié)劑、酶誘導(dǎo)劑、酶促進(jìn)劑、水中的一種或幾種。
[0014]所述氮源為大豆粉、棉籽粉、酪蛋白的胰酶消化物、魚(yú)粉、玉米漿、肉膏、蛋白質(zhì)、帶有奶固形物的自溶啤酒酵母、蛋白胨、酵母膏、水解酪蛋白、硝酸鹽和/或銨類(lèi)、乳清中的一種或幾種。
[0015]所述碳源為碳水化合物，優(yōu)選甘油、葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖、麥芽糖、肌醇、糊精、蜜糖、淀粉、乳清中的一種或幾種。
[0016]所述pH調(diào)節(jié)劑為碳酸鈣、碳酸氫鈉、磷酸鹽中的一種或幾種。
[0017]所述酶誘導(dǎo)劑為植物留醇組合物。
[0018]所述于酶促進(jìn)劑為含有Mn2+、Fe2+、Co2+、Mg2+、PO4'Ni2+、2，2’ -聯(lián)吡啶，8_羥基喹啉中的一種或幾種，優(yōu)選為硫酸錳、硫酸鎂、硫酸銅、氯化鈣、氯化鈷、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀中的一種或幾種。
[0019]所述制備方法，分支桿菌屬微生物為Mycobacterium NRRL B-3805、Mycobacterium NRRLB—3683、Mycobacterium VKMA C—1815D、Mycobacterium fortuitum.NRRL B-81530[0020]所述植物留醇組合物來(lái)自加工植物油的副產(chǎn)物。所述植物油來(lái)自大豆、菜籽、玉米、棉籽、葵花籽、橄欖、亞麻籽、米糠中的一種或多種。
[0021]所述制備方法，諾卡氏菌屬微生物是Nocardia.aliena MC1-0710。
[0022]所述制備方法，增溶劑為來(lái)自大豆、菜籽、玉米、棉籽、葵花籽、橄欖、亞麻籽、米糠中的一種或多種植物油。
[0023]所述制備方法，增溶劑為來(lái)自大豆的植物油。
[0024]所述制備方法，乳化劑為聚二醇的脂肪酸酯或乙烯氧基加成化合物。
[0025]所述乳化劑為名為T(mén)egin, Tween和Span的乳化劑。
[0026]所述制備方法，十二烷基硫酸鈉/植物留醇組合物的重量比為0.01-0.001。
[0027]通過(guò)研究我們發(fā)現(xiàn)，加入在分散植物留醇組合物的植物油中加入十二烷基硫酸鈉后，微生物將植物留醇組合物轉(zhuǎn)化為AD的速度、純度、收率都有了明顯的提高，尤其是在分支桿菌的發(fā)酵中體現(xiàn)的尤為明顯，同時(shí)發(fā)酵所需要的植物油，也有了明顯的減少。
[0028]一般地，用于轉(zhuǎn)化植物留醇為雄烯二酮的發(fā)酵過(guò)程中不使用十二烷基硫酸鈉，其原因是十二烷基硫酸鈉是一種陰離子表面活性劑，具有優(yōu)異的發(fā)泡力，而通常認(rèn)為發(fā)酵中泡沫較少更有利于發(fā)酵，這就是在發(fā)酵過(guò)程中使用消泡劑的原因。
[0029]上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果出現(xiàn)可能是由于以下兩個(gè)原因:首先是0.05-0.8%十二烷基硫酸鈉溶液浸泡培養(yǎng)菌后將培養(yǎng)菌的細(xì)胞壁進(jìn)行了分解，降低了植物留醇進(jìn)入菌體內(nèi)的難度，其次是十二烷基硫酸鈉對(duì)于植物留醇具有增溶作用有關(guān)。雖然在發(fā)酵過(guò)程中存在一定的泡沫，但是十二烷基硫酸鈉溶 液對(duì)于發(fā)酵結(jié)果起到了更好的作用。
[0030]以下的詳細(xì)說(shuō)明幫助本領(lǐng)域技術(shù)人員實(shí)施本發(fā)明。然而，此詳細(xì)說(shuō)明并不解釋為對(duì)本發(fā)明范圍的過(guò)度限制。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以對(duì)在此討論的實(shí)施例進(jìn)行修飾和變化而不背離本發(fā)明范圍的精神。在本發(fā)明中，該營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基適用于植物甾醇生物轉(zhuǎn)化為AD和ADD所涉及各種微生物，包括分枝桿菌和諾卡氏菌。本領(lǐng)域中還有許多已知和可用微生物，本發(fā)明并不限制于其中的任何一個(gè)。
[0031]細(xì)菌發(fā)酵培養(yǎng)按其用途可分為孢子培養(yǎng)、種子培養(yǎng)、發(fā)酵培養(yǎng)三個(gè)過(guò)程，但這三個(gè)過(guò)程可以再同一個(gè)反應(yīng)器中完成，也可以在不同的反應(yīng)器中完成，甚至三個(gè)過(guò)程可以合并。
[0032]孢子培養(yǎng)是供菌種繁殖孢子的過(guò)程，是能使菌體迅速生長(zhǎng)，產(chǎn)生較多優(yōu)質(zhì)的孢子，并要求不易引起菌種發(fā)生變異。所以對(duì)孢子培養(yǎng)基的基本配制要求是:第一，營(yíng)養(yǎng)不要太豐富(特別是有機(jī)氮源)，否則不易產(chǎn)孢子。如灰色鏈霉在葡萄糖-硝酸鹽-其它鹽類(lèi)的培養(yǎng)基上都能很好地生長(zhǎng)和產(chǎn)孢子，但若加入0.5%酵母膏或酪蛋白后，就只長(zhǎng)菌絲而不長(zhǎng)孢子。第二，所用無(wú)機(jī)鹽的濃度要適量，不然也會(huì)影響孢子量和孢子顏色。第三，要注意孢子培養(yǎng)基的PH和濕度。生產(chǎn)上常用的孢子培養(yǎng)基有:麩皮培養(yǎng)基、小米培養(yǎng)基、大米培養(yǎng)基、玉米碎屑培養(yǎng)基和用葡萄糖、蛋白胨、牛肉膏和食鹽等配制成的瓊脂斜面培養(yǎng)基。大米和小米常用作霉菌孢子培養(yǎng)基，因?yàn)樗鼈兒可?，疏松、表面積大，所以是較好孢子培養(yǎng)基。大米培養(yǎng)基的水分需控制在21% -50%，而曲房空氣濕度需控制在90% -100%。一般該類(lèi)培養(yǎng)基主要是在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行菌種傳代使用，不參與工業(yè)化發(fā)酵過(guò)程。
[0033]種子培養(yǎng)是供孢子發(fā)芽、生長(zhǎng)和大量繁殖菌絲體，并使菌體長(zhǎng)得粗壯，成為活力強(qiáng)的“種子”為目的。所以種子培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)成分要求比較豐富和完全，氮源和維生素的含量也要高些，但總濃度以略稀薄為好，這樣可達(dá)到較高的溶解氧，供大量菌體生長(zhǎng)繁殖。種子培養(yǎng)基的成分要考慮在微生物代謝過(guò)程中能維持穩(wěn)定的pH，其組成還要根據(jù)不同菌種的生理特征而定。一般種子培養(yǎng)基都用營(yíng)養(yǎng)豐富而完全的天然有機(jī)氮源，因?yàn)橛行┌被崮艽碳ゆ咦影l(fā)芽。但無(wú)機(jī)氮源容易利用，有利于菌體迅速生長(zhǎng)，所以在種子培養(yǎng)基中常包括有機(jī)及無(wú)機(jī)氮源。種子培養(yǎng)基的成分最好能較接近發(fā)酵培養(yǎng)基，這樣可使種子進(jìn)入發(fā)酵培養(yǎng)基后能迅速適應(yīng)，快速生長(zhǎng)。
[0034]發(fā)酵培養(yǎng)是供菌種生長(zhǎng)、繁殖和合成產(chǎn)物的過(guò)程。它既要使種子接種后能迅速生長(zhǎng)，達(dá)到一定的菌絲濃度，又要使長(zhǎng)好的菌體能迅速合成需產(chǎn)物。因此，發(fā)酵培養(yǎng)基的組成除有菌體生長(zhǎng)所必需的元素和化合物外，還要有產(chǎn)物所需的特定元素、前體和促進(jìn)劑等。但若因生長(zhǎng)和生物合成產(chǎn)物需要的總的碳源、氮源、磷源等的濃度太高，或生長(zhǎng)和合成兩階段各需的最佳條件要求不同時(shí)，則可考慮培養(yǎng)基用分批補(bǔ)料來(lái)加以滿(mǎn)足。發(fā)酵培養(yǎng)基也可以叫做生物轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基或發(fā)酵轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基。
[0035]如果需要，可以加入磷酸鹽，鎂和/或亞鐵離子作為促生長(zhǎng)因子；還可加入緩沖液以確保生長(zhǎng)在基本中性的pH。開(kāi)始時(shí)，消泡劑可能是有益的。當(dāng)用于誘導(dǎo)發(fā)酵的是分離的細(xì)胞或酶而不是完整和生長(zhǎng)的微生物時(shí)，不需要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的存在；但是無(wú)論是何種情形，培養(yǎng)基通常主要為含水的。
[0036]在此使用的術(shù)語(yǔ)“植物留醇”包括所有的留醇并且沒(méi)有限制，例如:谷留醇，萊油甾醇，豆留醇，菜籽留醇(包括二氫菜籽留醇)，鏈留醇，chalinosterol,多孔留醇，穿貝海綿甾醇，麥角甾醇，糞甾醇，科迪甾醇(codisterol),異巖藻甾醇(isorucosterol),巖藻留醇，桐留醇，神經(jīng)留醇(nervisterol)，7_烯膽留烷醇，星魚(yú)留醇，菠菜甾醇，chondriIlasterol, peposterol，燕麥留醇，異燕麥留醇，fecosterol, Pollinastasterol,膽甾醇以及它們的所有天然或合成形式和衍生物，包括異構(gòu)體.并且包括它們所有的氫化對(duì)應(yīng)物(“植物留烷醇(Phytostanols) ”)。植物留烷醇包括所有飽和或氫化的植物留醇以及它們的所有天然或合成形式和衍生物，包括異構(gòu)體。當(dāng)在說(shuō)明書(shū)全文中存在疑問(wèn)時(shí)，需要了解的是術(shù)語(yǔ)“植物留醇”可包含植物留醇和植物留烷醇兩者。
[0037]用于本發(fā)明生物轉(zhuǎn)化的甾醇和甾烷醇(stanols)可以通過(guò)許多種天然來(lái)源獲得。例如，它們可以從植物油(包括水生植物)的加工中獲得，所述植物油如玉米油和其它植物油，麥胚芽油，大豆提取物，大米提取物，米糠，菜籽油，向日葵油，芝麻油。它們也可以衍生自真菌，例如麥角甾醇。因此，本發(fā)明并不限于甾醇的任何一個(gè)來(lái)源.美國(guó)專(zhuān)利4，420，427中公開(kāi)了使用溶劑如甲醇從植物油渣中制備留醇?；蛘撸参锪舸己椭参锪敉榇伎梢詠?lái)自林業(yè)加工副產(chǎn)品妥爾油樹(shù)脂(tall oil pitch)或制楽；阜(pulping soap),如美國(guó)專(zhuān)利5，770, 749中所述，在此引入作為參考。
[0038]本專(zhuān)利中AD⑶的意思是AD和/或ADD。
[0039]在本發(fā)明中的發(fā)酵過(guò)程，可以將溶解于適宜溶劑中的或乳化形式的底物(植物甾醇組合物)和微生物培養(yǎng)物一起加入生物反應(yīng)器中。進(jìn)行發(fā)酵直到達(dá)到最大底物轉(zhuǎn)化，即植物甾醇轉(zhuǎn)化為AD(D)。
[0040]上述發(fā)酵方法尤其適用于分枝桿菌屬(Mycobacterium)的微生物。
[0041]只要能促進(jìn)植物留醇底物在溶劑中混合，從而最優(yōu)化微生物培養(yǎng)物對(duì)底物的利用率，可以使用任何乳化劑。例如包括但并不局限于聚二醇的脂肪酸酯或乙烯氧基加成化合物和商品名為T(mén)egin, Tween和Span的乳化劑。[0042]或者，可以使用增溶劑溶解植物留醇組合物以形成澄清溶液，從而提供與在生物轉(zhuǎn)化中所用微生物良好的接觸。所選的適宜的增溶劑包括二醇(glycol)類(lèi)和硅氧烷類(lèi)增溶劑，它們能使高濃度的植物留醇被溶解于營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中。這將使其與微生物良好接觸，減少發(fā)酵時(shí)間，并得到最終產(chǎn)物的相對(duì)高收率。優(yōu)選先前已知的增溶劑例如向日葵油、大豆油。
[0043]這種適用于植物留醇生物轉(zhuǎn)化為AD和ADD所涉及細(xì)菌的培養(yǎng)基，其包含玉米漿和無(wú)機(jī)鹽。而無(wú)機(jī)鹽為優(yōu)選硝酸鈉和磷酸銨，更優(yōu)選磷酸銨:硝酸鈉為10: 40-99。
[0044]上述培養(yǎng)基優(yōu)選含有葡萄糖的種子培養(yǎng)基。
[0045]上述所有培養(yǎng)基可以加入磷酸鹽、鎂和/或亞鐵離子、緩沖液，其中的一種或多種。
[0046]上述所有培養(yǎng)基，其每升培養(yǎng)基含有玉米漿5_50ml。
[0047]上述培養(yǎng)基，其每升培養(yǎng)基含有無(wú)機(jī)鹽4-10g。
[0048]上述所有培養(yǎng)基，其每升發(fā)酵培養(yǎng)基含有葡萄糖5_15g。
[0049]上述所有培養(yǎng)基，其每升培養(yǎng)基含有玉米漿5_50ml，無(wú)機(jī)鹽4_10g，葡萄糖5_15g。
[0050]上述培養(yǎng)基如是種子培養(yǎng)基，則含有葡萄糖；上述培養(yǎng)基如是發(fā)酵培養(yǎng)基,則可以不含葡萄糖。
[0051]在發(fā)酵方法中，優(yōu)選溫度維持在大約20_37°C的范圍內(nèi)，更優(yōu)選25_35°C。發(fā)酵或轉(zhuǎn)化過(guò)程一旦完成，即用本領(lǐng)域已知和常規(guī)的方法回收AD(D)。
【具體實(shí)施方式】
[0052]以下的實(shí)施例代表實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn).然而，每個(gè)都能使用已知的工業(yè)技術(shù)擴(kuò)展用于工業(yè)規(guī)模的應(yīng)用以實(shí)施本發(fā)明。
[0053]以下的實(shí)施例中菌種中提到的NRRL是美國(guó)農(nóng)業(yè)研究菌種保藏中心(Agricultural Research Service Culture Collection)的縮寫(xiě)，該中心是國(guó)際菌種保藏機(jī)構(gòu)之一。
[0054]下述實(shí)施例中的植物甾醇是從市場(chǎng)上購(gòu)買(mǎi)的含量大于95%的產(chǎn)品。
[0055]實(shí)施例1
[0056]實(shí)施例l-1-a
[0057]菌種:分枝桿菌:Mycobacteriumfortuitum.NRRL B-8153。
[0058]取10個(gè)不同批號(hào)的玉米漿按照本實(shí)施例中的數(shù)量和工藝分別進(jìn)行發(fā)酵。除玉米漿外其他的物料均為同一批物料。
[0059]種子培養(yǎng)階段:
[0060]種子培養(yǎng)基(每升):
[0061]40ml 玉米漿
[0062]5.2g NaNO3,
[0063]0.8g NH4H2PO4
[0064]5.3g 葡萄糖
[0065]其余為無(wú)菌水
[0066]培養(yǎng)基量:200ml/燒瓶[0067]接種物量--每200ml新培養(yǎng)基接種來(lái)自瓊脂斜面的3ml細(xì)胞懸液
[0068]容器:1000ml錐形瓶
[0069]攬拌:振蕩器(I” throw) 2OOrpm
[0070]溫度:30°C
[0071]生長(zhǎng)時(shí)間-J2小時(shí)培養(yǎng)
[0072]注解:如果在底部有黃色細(xì)胞沉淀形成則表示為良好的培養(yǎng)物生物 [0073]方法:
[0074]在培養(yǎng)基中制備用于生物轉(zhuǎn)化的接種物。從瓊脂料面(在玻璃試管中培養(yǎng))接種錐形瓶，在無(wú)菌條件下進(jìn)行接種，移取無(wú)菌水(5mL)到瓊脂抖面上.用移液管末端輕輕刮下細(xì)菌培養(yǎng)物.然后移取該混懸培養(yǎng)物并放入錐形瓶中.在旋轉(zhuǎn)振蕩器上進(jìn)行細(xì)菌增殖(200rpm，I" throw，30度)。在培養(yǎng)72小時(shí)后，此種子培養(yǎng)物即可轉(zhuǎn)移至生物反應(yīng)器中。在接種前對(duì)種子培養(yǎng)物長(zhǎng)期儲(chǔ)存是不可取的。在操作中，還可以針對(duì)種子進(jìn)行二級(jí)乃至三級(jí)培養(yǎng)，將種子培養(yǎng)好，當(dāng)進(jìn)入發(fā)酵培養(yǎng)基后發(fā)酵的時(shí)間可以適當(dāng)延長(zhǎng)，以獲得更好的生物轉(zhuǎn)化率。留體發(fā)酵培養(yǎng)基(每升):
[0075]40ml 玉米衆(zhòng)
[0076]5.2g NaNO3,
[0077]0.8g NH4H2PO4
[0078]其余為無(wú)菌水
[0079]底物:30.0g植物甾醇(3.0% )
[0080]乳化劑:向日葵油用量分別為50ml、150ml、250ml
[0081]在使用前一天，必需量的玉米漿與水(100ml)混合并在錐形瓶中滅菌(121°C持續(xù)20分鐘)。
[0082]在燒瓶或燒杯中混合水(500ml)和培養(yǎng)基組分(除植物留醇和向日葵油以外)。用IM NaOH溶液(40g/L NaOH)調(diào)培養(yǎng)基的pH值至8.0，將培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至生物反應(yīng)器中，隨后加熱至60-70°C。
[0083]在燒杯中稱(chēng)重植物留醇(30g)，加入向日葵油，加熱邊攪拌混合物，將上述向日葵油倒入生物反應(yīng)器中已加熱的液體培養(yǎng)基中^0-70°C )，補(bǔ)無(wú)菌水至1L，無(wú)需攪拌。
[0084]將發(fā)酵罐滅菌(121°C持續(xù)30分鐘)，然后冷卻至30°C。使用上述培養(yǎng)基3L。
[0085]在發(fā)酵罐中使用分枝桿菌進(jìn)行的生物轉(zhuǎn)化:
[0086]在帶有有效底部攪拌的不銹鋼發(fā)酵罐中進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)。所用發(fā)酵罐的主要參數(shù)為:發(fā)酵罐總體積10升，工作體積3升，接種物量以0.4L，通氣量0.3L/L/min,攪拌300rpmo
[0087]將發(fā)酵罐中培養(yǎng)基的溫度調(diào)至30°C，在無(wú)菌條件下加入接種物。整個(gè)過(guò)程在30°C進(jìn)行。從此階段開(kāi)始到最后都監(jiān)測(cè)該過(guò)程的PH值和無(wú)菌度。10小時(shí)以后開(kāi)始監(jiān)測(cè)底物(植物甾醇)和產(chǎn)物AD(D)。此過(guò)程中生物轉(zhuǎn)化混合物的pH值通常在IpH單位內(nèi)變化并未校正。通過(guò)分析(HPLC)2小時(shí)內(nèi)當(dāng)泡沫層中的產(chǎn)物AD和ADD的總含量達(dá)到不變時(shí)，被認(rèn)為已經(jīng)完成生物轉(zhuǎn)化，此是AD和ADD的總含量，具體發(fā)酵時(shí)間見(jiàn)下表。
[0088]HPLC測(cè)定AD⑶與植物甾醇的比例:
[0089]發(fā)酵液用1，2_ 二氯乙烷抽提，減壓濃縮后稀釋適當(dāng)倍數(shù)，10000r/min離心除去可能的不溶物，然后高壓液相層析色譜柱:Alltima(4.6mm(內(nèi)徑)X250mm)5iim。流動(dòng)相:石油醚:乙酸乙酯=6: 4,流速:1.0mL/min,溫度:室溫,檢測(cè)波長(zhǎng):240nm。
[0090]結(jié)果見(jiàn)下表
[0091]
【權(quán)利要求】
1.一種由植物留醇組合物為底物制備雄留-4烯-3，17 二酮和/或雄留-1,4- 二烯-3，17-二酮的方法，其特征在于在具有諾卡氏菌屬或分支桿菌屬微生物的反應(yīng)器中加入用含有十二烷基硫酸鈉的增溶劑或乳化劑和植物留醇組合物，調(diào)節(jié)PH值大于7，在20-37°C之間進(jìn)行發(fā)酵，使植物留醇組合物轉(zhuǎn)變?yōu)樾哿?4烯-3，17 二酮和/或雄留-1,4- 二烯-3，17 二酮。
2.如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于雄留-4烯-3，17二酮與雄留-1，4- 二烯-3，17 二酮的重量比為I: 0.01-0.1。
3.如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于發(fā)酵溫度為20-30°C。
4.如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于反應(yīng)時(shí)間為20-60小時(shí)。
5.如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于反應(yīng)中pH在7-9之間。
6.如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于分支桿菌屬微生物需要培養(yǎng)基培養(yǎng)。
7.如權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征在于培養(yǎng)基含有瓊脂、碳源、氮源、PH調(diào)節(jié)劑、酶誘導(dǎo)劑、酶促進(jìn)劑、水中的一種或幾種。
8.如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于分支桿菌屬微生物為MycobacteriumNRRLB-3805、Mycobacterium NRRL B-3683、Mycobacterium VKMA C-1815D、Mycobacteriumfortuitum.NRRL B-8153。
9.如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于諾卡氏菌屬微生物是Nocardia.alienaMC1-0710。
10.如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于十二烷基硫酸鈉/植物留醇組合物的重量比為 0.01-0.001。
【文檔編號(hào)】C12P33/02GK103789385SQ201210424685
【公開(kāi)日】2014年5月14日 申請(qǐng)日期:2012年10月31日 優(yōu)先權(quán)日:2012年10月31日
【發(fā)明者】盧彥昌, 李靜, 張輝, 趙春霞 申請(qǐng)人:天津金耀集團(tuán)有限公司