專利名稱：一種讓慢性粒細胞白血病細胞凋亡的系統(tǒng)及其方法
技術領域：
本發(fā)明屬于醫(yī)學基礎研究領域，具體的說，涉及一種導致白血病細胞凋亡的系統(tǒng)及其方法。
背景技術：
慢性粒細胞白血病(CML)是ー種發(fā)生在早期多能造血干細胞上的惡性骨髓增生性疾病。主要涉及髓系，臨床表現(xiàn)為脾腫大、外周血中粒細胞顯著增多并出現(xiàn)幼稚粒細胞。在受累的細胞系中，可找到Ph染色體和(或)bcr-abl融合基因。bcr-abl融合基因編碼的Bcr-Abl融合蛋白具有組成性激活的酪氨酸激酶活性，通過激活PI3K、STAT5等抗凋亡信號顯著地抑制細胞凋亡，誘導細胞的轉(zhuǎn)化，從而引起CML的發(fā)生發(fā)展。目前臨床應用于CML治療的ー線藥物是imatinib，它通過競爭性結合Bcr-Abl蛋白中的ATP結合位點，使Bcr-Abl 不能磷酸化底物從而阻斷CML進展。但是，目前臨床上仍有1/3的患者對imatinib不耐受或者耐藥，對于這些患者需要尋求另外的替代療法。

發(fā)明內(nèi)容
為解決以上技術問題，本發(fā)明的目的在于提供ー種讓慢性粒細胞白血病細胞凋亡的系統(tǒng)及其方法。本發(fā)明目的是這樣實現(xiàn)的RATS靶向Bcr-Abl入核借酪氨酸激酶活性誘導CML細胞凋亡的立項依據(jù)如下I. Bcr-AbI與c_AbI之間顯示出明顯的細胞內(nèi)定位和效應的差異，在CML發(fā)病中起
著重要作用Bcr-Abl和c_Abl都含有相同的與蛋白定位相關的核定位信號(nuclearlocalization signal, NLS)和核輸出信號(nuclear export signal, NES),但 c_Abl 在細胞漿和細胞核都可定位，而Bcr-Abl則只定位于細胞漿。位于核內(nèi)的c-Abl是ー個重要的凋亡誘導蛋白，它活化后通過磷酸化轉(zhuǎn)錄因子P73使其轉(zhuǎn)錄活性增強，激活caspase凋亡信號途徑，誘導細胞的凋亡；位于胞漿的Bcr-Abl則通過激活抗凋亡信號顯著地抑制細胞凋亡，誘導細胞的轉(zhuǎn)化。2.將Bcr-Abl轉(zhuǎn)運到核內(nèi)，并利用Bcr-Abl的激酶活性，磷酸化p73，激活凋亡信號，從而誘導CML細胞凋亡思路的依據(jù)在DNA損傷吋，c-Abl入核并被激活，是DNA損傷應激誘導細胞凋亡所必需的，當缺失c-Abl或c-Abl的激酶活性時細胞就對凋亡誘導不敏感。因此，c-Abl入核和激酶活性被激活是DNA損傷時c-Abl激活凋亡信號的前提。Bcr-Abl在結構上具有和c-Abl —樣的效應結構域,更重要的是Bcr-Abl的激酶活性在細胞內(nèi)是組成性激活的，因此，Bcr-Abl進入核內(nèi)就可以通過其激酶活性磷酸化P73，誘導細胞凋亡。3.將CML細胞的Bcr-Abl轉(zhuǎn)運到核內(nèi)的策略①核定位信號(NLS)在蛋白由胞漿向胞核內(nèi)轉(zhuǎn)運中的作用真核細胞內(nèi)的蛋白由胞漿向胞核內(nèi)轉(zhuǎn)運需要通過細胞核和細胞漿間屏障核膜的核孔復合物，這個過程是由核定 位信號(NLS)的引導發(fā)生的。②雷帕霉素類似物轉(zhuǎn)運系統(tǒng)(rapamycinanalog transport system, RATS):雷帕 霉素(Rapamycin)是一種天然的小分子化合物,它在細胞內(nèi)和FKBP蛋白(FK506_binding protein, FKBP)結合形成雷帕霉素-FKBP 二元復合物后,對雷帕霉素祀(mammalian traget of rapamycin,mTOR)的FRB結構域(FKBP-rapamycin binding domain,FRB)具有很高的親 和性和特異性，形成FRB-雷帕霉素-FKBP三元復合物，從而選擇性誘導了 FRB和FKBP的相 互作用。因此，如果將核定位信號與FRB融合，在雷帕霉素誘導的蛋白相互作用下，定位信 號被傳遞給FKBP，或是與FKBP融合的目標蛋白，通過這種方式，就可以實現(xiàn)蛋白的轉(zhuǎn)運。為 了避免雷帕霉素對正常細胞的影響，可用雷帕霉素類似物(rapamycin analog)即AP21967 來代替雷帕霉素，同時對FRB進行突變修飾，這樣AP21967就只結合突變修飾的FRB，而不結 合細胞內(nèi)的雷帕霉素靶的FRB。綜上所述，雷帕霉素類似物AP21967和FKBP、FRB以及與之 融合的核定位信號也就組成了雷帕霉素類似物核轉(zhuǎn)運系統(tǒng)(rapamycin analog transport system, RATS),通過RATS實現(xiàn)的蛋白核轉(zhuǎn)運也在越來越多的研究中得到了應用。③RATS 如何實現(xiàn)對 Bcr-Abl 的靶向轉(zhuǎn)運Grb2 的 SH2 (Src homology 2，SH2)結 構域和Bcr-Abl的Y177特異性結合，在AP21967誘導FRB和FKBP相互作用時，就可以將與 FRB融合的核定位信號傳遞給與FKBP融合的SH2，進一步傳遞給Bcr-Abl，從而將Bcr-Abl 轉(zhuǎn)運入核。④外源性FKBP-SH2和NLS-FRB融合肽如何進入靶細胞轉(zhuǎn)運Bcr-Abl入核從而 激活P73 :選用Ad5腺病毒載體作為表達載體，分別構建表達FKBP-SH2和帶有核定位信號 的NLS-FRB融合肽，將腺病毒同時感染CML細胞，加入AP21967后，RATS靶向轉(zhuǎn)運Bcr-Abl 入核，既可以減少胞漿中的Bcr-Abl蛋白水平及其介導的致白血病信號，又可以使入核的 Bcr-Abl發(fā)揮其激酶活性，磷酸化p73，激活凋亡信號，達到誘導CML細胞凋亡的目的。根據(jù)以上依據(jù)進行了實際的操作，發(fā)現(xiàn)效果明顯。實驗驗證發(fā)明效果中，為了檢測的方便，在N3R前端加上一段氨基酸序列FLAG標 簽構成FN3R，F(xiàn)LAG標簽具體為DYKDDDDK ;在F2S前端加上一段氨基酸序列HA標簽構成 HF2S, HA 標簽具體為YPYDVPDYAVD。I.重組腺病毒Ad5-FN3R、Ad5_HF2S的構建與鑒定FN3R片段通過重疊PCR擴增獲得，通過分子克隆方法將FN3R片段插入腺 病毒穿梭質(zhì)粒pAdTrack-CMV，經(jīng)菌落PCR篩選、雙酶切及測序鑒定，證實構建的質(zhì)粒 pAdTrack-CMV-FN3R與預期的序列相符。采用分步克隆的方法，將HA，兩段FKBP及SH2依次 插入pAdTrack-CMV中，構建含HF2S片段的質(zhì)粒。經(jīng)菌落PCR篩選、雙酶切及測序鑒定，證 實構建的質(zhì)粒pAdTrack-CMV-HF2S與預期的序列相符。同樣的方法構建含突變片段HF2Sm 的質(zhì)粒。將穿梭質(zhì)粒與腺病毒的骨架質(zhì)粒pAdEasy-1在BJ5183細菌中重組，經(jīng)瓊脂糖凝膠 電泳、Pac I酶切鑒定，篩選出正確重組的腺病毒載體Ad5-FN3R、Ad5-HF2S、Ad5-HF2Sm。將 腺病毒載體Ad5-FN3R、Ad5-HF2S、Ad5-HF2Sm線性化后轉(zhuǎn)染AD-293細胞，在AD-293細胞中 進行腺病毒的包裝、擴增，獲得高滴度的腺病毒Ad5-FN3R、Ad5-HF2S、Ad5_HF2Sm。2. PCR 及 western blot 鑒定 FN3R、HF2S 及 HF2Sm 在細胞中的表達腺病毒溶液經(jīng)蛋白酶K處理后，作為模板進行PCR擴增，各病毒均擴增得目的條帶(圖I中A，B)。而以Ad5空載為模板的陰性對照沒有條帶。重組腺病毒感染AD-293細胞和K562細胞后，提取總蛋白，Western blot檢測到目的蛋白在兩種細胞中的表達，而Ad5空載對照組未檢測到表達(圖I中C，D)。圖I 中 A. PCR 鑒定 FN3R mRNA 的表達.M DL2000 標準，1,2 FN3R 病毒液，3 陽性對照，4 陰性對照.圖I中B. PCR鑒定HF2S mRNA的表達.M DL2000標準，1,6 :陰性對照，2 :正確重組的Ad5-HF2S腺病毒，3 :陽性對照，4 :正確重組的Ad5_HF2Sm腺病毒，5 :陽性對照 圖I中C. Western blot鑒定FN3R、HF2S及HF2Sm在AD-293細胞中的表達 圖I中D. Western blot鑒定FN3R、HF2S及HF2Sm在K562細胞中的表達 3.免疫熒光檢測FN3R、HF2S及HF2Sm在K562細胞中的定位(參看圖2)用Ad5-FN3R、Ad5_HF2S 或 Ad5_HF2Sm 腺病毒感染 K562 細胞，MOI 為 105，48h 收集細胞進行免疫熒光實驗，檢測FN3R、HF2S及HF2Sm蛋白在K562細胞中的定位。結果如圖2·所示FN3R主要定位于細胞核，HF2S、HF2Sm主要定位于細胞漿，與預期相符。4.免疫熒光檢測RATS轉(zhuǎn)運Bcr-Abl入核前后Bcr-Abl及目的蛋白在K562細胞中的定位接種合適密度的K562細胞于細胞培養(yǎng)板中，以腺病毒Ad5_FN3R和Ad5_HF2S或(Ad5-HF2Sm)共感染K562細胞，MOI為105。12h后加入AP21967，48h后，收集細胞涂片，進行免疫熒光實驗。腺病毒Ad5-FN3R和Ad5-HF2S共感染K562細胞后，在不加入AP21967時，F(xiàn)KBP不能結合FRB，與FRB融合的NLS不能傳遞給FKBP及與之融合的蛋白，用HA抗體檢測到的是位于細胞漿的HF2S，此時，Bcr-Abl仍定位于細胞漿(圖3中A)，在加入AP21967后，F(xiàn)KBP與FRB相互作用，與FRB融合的NLS傳遞給FKBP及與之融合的蛋白，最終傳遞給Bcr-Abl，用HA抗體檢測到的蛋白包括HF2S和FN3R，主要位于細胞核，Bcr-Abl部分轉(zhuǎn)運至細胞核(圖3中B)。在Ad5-FN3R和Ad5_HF2Sm共感染對照組，NLS能夠傳遞給FKBP以及與之融合的Sm,但由于Sm不能結合Bcr-Abl,故用HA抗體檢測到的蛋白包括FN3R和HF2Sm,主要位于細胞核，Bcr-Abl仍位于細胞漿(圖3中C)。以上結果證實RATS能夠轉(zhuǎn)運Bcr-Abl入核。由于RATS轉(zhuǎn)運K562細胞中Bcr-Abl入核的效應不夠強，而據(jù)文獻報道，來普霉素B (LMB)能夠抑制NLS出核，增強入核效應。因此，我們通過加入LMB來增強RATS轉(zhuǎn)運Bcr-Abl入核的效應。免疫熒光證實單獨0. 2nM LMB不能誘導Bcr-Abl入核(圖3中E)，但是能夠顯著增強RATS轉(zhuǎn)運Bcr-Abl入核(圖3中D)，以上結果證實LMB增強了 RATS轉(zhuǎn)運K562細胞中Bcr-Abl入核。5. RATS抑制K562細胞增殖為了使我們所用濃度的LMB不對K562細胞的生長產(chǎn)生明顯的影響，以確保LMB只對RATS起輔助作用，我們用不同濃度(0. 2nM，0. 5nM，InM，2nM和5nM)的LMB處理K562細胞，24和48h的MTS結果證實，LMB濃度為0. 2nM時對K562細胞的生長幾乎無影響(圖4)。進ー步用0. 2nM和0. 5nM兩個濃度的LMB處理K562細胞，第2，4，6天的MTS結果也證實0. 2nM的LMB對K562細胞的生長無影響(圖5)。因此我們選定0. 2nM的LMB為后續(xù)試驗濃度。如圖6所示，與正常對照組(曲線a)相比，RATS在一定程度上抑制了 K562細胞的生長(曲線C)，而在LMB輔助下，K562細胞生長明顯受到抑制(曲線d)，而突變對照組(曲線e)和空載對照組(曲線b)對K562細胞的生長沒有顯著的影響。以上結果說明，RATS能抑制K562細胞的生長，0. 2nM LMB顯著增強了 RATS對K562細胞的增殖抑制效應。
6. RATS誘導K562細胞凋亡以MOI 為 105，Ad5-FN3R和 Ad5-HF2S 腺病毒共感染 K562 細胞，12h 后加入 AP21967， 24h后加入0. 2nM LMB，72h后收集細胞，瑞氏染色檢測K562細胞的形態(tài)、DAPI染色檢測細 胞核的變化情況。同時實驗設立正常對照組(control);未加AP21967組(RATS—) :Ad5_FN3R 和Ad5-HF2S共感染后，不加AP21967，其余處理同實驗組；突變對照組(RATSm) :Ad5_FN3R 和Ad5-HF2Sm共感染K562細胞，其余處理與實驗組相同。瑞氏染色(圖7)發(fā)現(xiàn)RATS處 理組細胞大小不一，胞漿紫紅色顆粒增多，部分細胞空泡化，部分細胞出現(xiàn)明顯的細胞核固 縮、碎裂，說明凋亡細胞增多。而正常對照組、RATS-組和RATS 組，細胞完整，大小均一，凋 亡細胞少見。這說明RATS誘導了 K562細胞凋亡。DAPI染色(圖8)發(fā)現(xiàn)RATS處理組細胞 核出現(xiàn)固縮、碎裂、溶解等凋亡改變，計數(shù)1000個細胞核，凋亡率為22%。而正常對照組、 RATS_組和RATSm組，細胞核均一，圓形或類圓形，偶見固縮或碎裂的細胞核。這進一步證實 RATS誘導了 K562細胞凋亡。我們進一步用western blot檢測caspase 3的活化情況。RATS組caspase 3 被活化，切割出17kDa的活化片段；而正常對照組，未加Ap21967組和突變對照組，都未見 caspase活化(圖9)。結果說明RATS通過caspase 3誘導了 K562細胞凋亡。有益效果通過實驗驗證本發(fā)明的系統(tǒng)和方法，可以達到和實現(xiàn)誘導CML細胞凋亡，并且效 果非常好，對于治療白血病的研究及藥物的開發(fā)具有很大的研究價值。


圖I為FN3R、HF2S及HF2Sm的表達鑒定圖；圖2為免疫熒光檢測FN3R、HF2S及HF2Sm蛋白在K562細胞中的定位圖；圖3為免疫熒光檢測RATS轉(zhuǎn)運Bcr-Abl入核前后Bcr-Abl及目的蛋白在K562細 胞中的定位圖；圖4為不同濃度的LMB對K562細胞生長影響的曲線圖；圖5為0. 2、0. 5nM LMB在不同時間對K562細胞生長影響的曲線圖；圖6為RATS抑制K562細胞增殖；圖7為瑞氏染色證實RATS誘導K562細胞凋亡圖；圖8為DAPI染色證實RATS誘導K562細胞凋亡圖；圖9為RATS激活caspase 3的鑒定圖；圖10為讓慢性粒細胞白血病(CML)細胞凋亡的系統(tǒng)示意圖。
具體實施例方式實施例如圖10所示，一種讓慢性粒細胞白血病(CML)細胞凋亡的系統(tǒng)，由載入腺病毒的 兩個融合肽N3R、兩個化合物AP21967和載入腺病毒的融合肽F2S連接在一起構成；所述融合肽N3R為3段NLS和FRB連接組成，所述融合肽F2S為2段FKBP和SH2 連接組成，一段FKBP通過一個化合物AP21967與一段FRB結合；一個融合肽F2S通過化合物AP21967同時結合兩個融合肽N3R ；所述融合肽N3R的氨基酸序列為PKKKRKVPKKKRKVPKKKRKVELIRVAILWHEMWHEGLEEASRLYFGERNVKGMFEVLEPLHAMMERGPQTLKETSFNQAYGRDLMEAQEffCRKYMKSGNVKDLLQAffDLYYHVFRRISKQ ；所述融合肽N3R的核苷酸序列如SEQ ID No. I所示；所述融合肽F2S的氨基酸序列為MGVQVETISP ⑶ GRTFPKRGQTCWHYTGMLEDGKKFDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGATGHPGIIPPHATLVFDVELLKLEAAAMGVQVETISPGDGRTFPKRGQTCVVHYTGMLEDGKKFDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGATGHPGIIPPHATLVFDVELLKLEGTLEWFFGKIPRAKAEEMLSKQRHDGAFLIRESESAPGDFSLSVKFGNDVQHFKVLRDGAGKYFLWVVKFNSLNE LVDYHRSTSVSRNQQIFLRDIE ；所述融合肽F2S的核苷酸序列如SEQIDNo. 2所示。具體讓慢性粒細胞白血病細胞凋亡的方法將載入腺病毒的融合肽N3R、化合物AP21967和載入腺病毒的融合肽F2S導入慢性粒細胞白血病細胞中，F(xiàn)RB與化合物AP21967結合，該化合物AP21967又與FKBP結合，形成FRB-AP21967-FKBP三元復合物，將N3R和F2S連接在一起構成了讓慢性粒細胞白血病細胞凋亡的系統(tǒng)，同時SH2會結合Bcr-Abl癌蛋白，F(xiàn)RB將定位信號傳遞給Bcr-Abl癌蛋白，將Bcr-Abl癌蛋白轉(zhuǎn)運入核，通過Bcr-Abl癌蛋白的酪氨酸激酶活性磷酸化激活p73，誘導CML細胞凋亡。
權利要求
1.一種讓慢性粒細胞白血病細胞凋亡的系統(tǒng)，其特征在于由載入腺病毒的兩個融合肽N3R、兩個化合物AP21967和載入腺病毒的融合肽F2S連接在一起構成； 所述融合肽N3R為3段NLS和FRB連接組成，所述融合肽F2S為2段FKBP和SH2連接組成， 一段FKBP通過一個化合物AP21967與一段FRB結合；一個融合肽F2S通過化合物AP21967同時結合兩個融合肽N3R ； 所述融合肽N3R的氨基酸序列為PKKKRKVPKKKRKVPKKKRKVELIRVAILWHEMWHEGLEEASRLYFGERNVKGMFEVLEPLHAMMERGPQTLKETSFNQAYGRDLMEAQEffCRKYMKSGNVKDLLQAffDLYYHVFRRISKQ ； 所述融合肽N3R的核苷酸序列如SEQ ID No. I所示； 所述融合肽F2S的氨基酸序列為MGVQVETISP⑶GRTFPKRGQTCVVHYTGMLEDGKKFDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGATGHPGIIPPHATLVFDVELLKLEAAAMGVQVETISPOTGRTFPKRGQTCVVHYTGMLEDGKKFDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGATGHPGIIPPHATLVFDVELLKLEGTLEWFFGKIPRAKAEEMLSKQRHDGAFLIRESESAPGDFSLSVKFGNDVQHFKVLRDGAGKYFLWVVKFNSLNELVDYHRSTSVSRNQQIFLRDIE ； 所述融合肽F2S的核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示。
2.根據(jù)權利要求I所述一種讓慢性粒細胞白血病細胞凋亡的系統(tǒng)，其特征在于所述融合肽N3R和F2S載入的腺病毒為Ad5腺病毒。
3.一種讓慢性粒細胞白血病細胞凋亡的方法，其特征在于將載入腺病毒的融合肽N3R、化合物AP21967和載入腺病毒的融合肽F2S導入慢性粒細胞白血病細胞中，F(xiàn)RB與化合物AP21967結合，該化合物AP21967又與FKBP結合，將N3R和F2S連接在一起，同時SH2會結合Bcr-Abl癌蛋白，F(xiàn)RB將核定位信號傳遞給Bcr-Abl癌蛋白，將Bcr-Abl癌蛋白轉(zhuǎn)運入核，通過Bcr-Abl癌蛋白的酪氨酸激酶活性磷酸化激活p73，誘導CML細胞凋亡。
全文摘要
本發(fā)明為一種讓慢性粒細胞白血病細胞凋亡的系統(tǒng)，由載入腺病毒的兩個融合肽N3R、兩個化合物AP21967和載入腺病毒的融合肽F2S連接在一起構成。本發(fā)明系統(tǒng)和方法通過實驗驗證，可以達到和實現(xiàn)誘導CML細胞凋亡，并且效果非常好，對于治療白血病的研究及藥物的開發(fā)具有很大的研究價值。
文檔編號C12N15/861GK102952825SQ20121030903
公開日2013年3月6日 申請日期2012年8月28日 優(yōu)先權日2012年8月28日
發(fā)明者馮文莉, 黃崢蘭, 高淼, 羅紅偉 申請人:重慶醫(yī)科大學