專利名稱：一種g蛋白偶聯(lián)受體對化合物特異性的檢測方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及一種G蛋白偶聯(lián)受體對化合物特異性的檢測方法。
背景技術(shù)：
G蛋白偶聯(lián)受體(G protein-coupled receptor,GPCR)是一類含有7個跨膜α螺旋的膜蛋白，是人類細胞膜表面最大的受體家族。在人類的基因組中約有800個基因編碼GPCR蛋白。當膜外的配體作用于GPCR受體時，該受體的膜內(nèi)部分與G蛋白結(jié)合，從而激活G蛋白。G蛋白通過多種信號傳導途徑將細胞外信號傳遞至細胞內(nèi)，對生長發(fā)育、生殖、免疫、神經(jīng)傳導、代謝以及行為都有重要的調(diào)控作用。GPCR配體種類非常廣泛，涵蓋了味覺、嗅覺、光、金屬離子、生物胺、脂肪酸、留體等 類別。約有80%的激素、神經(jīng)肽和神經(jīng)調(diào)節(jié)物質(zhì)的信號傳遞都是由GPCR蛋白介導。GPCR與人類的各類疾病(包括心血管疾病、胃腸道疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、免疫疾病以及腫瘤的誘發(fā)和擴散等)密切相關(guān)。世界各大制藥公司目前都在積極開發(fā)以GPCR為靶點的藥物。近20年來，被美國FDA批準上市的藥物中，40% 50%是針對GPCR作為靶標的藥物。GPCR介導的信號傳導主要有以下幾種途徑一、由第二信使cAMP介導的信號通路。激動型G蛋白(Stimulatory G protein,Gs)偶聯(lián)受體與其特異配體結(jié)合后，激活腺苷酸環(huán)化酶(AC)活性；而抑制型G蛋白(Inhibitory G protein,Gi)偶聯(lián)受體與配體結(jié)合后,抑制AC的活性。AC可催化腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)轉(zhuǎn)變成環(huán)腺嘌呤核苷三磷酸(cAMP)，從而引起一系列的細胞生物活動，如打開離子通道，激活蛋白激酶A (PKA)等(見圖I虛線左側(cè)示意圖)。目前，基于cAMP信號傳導的化合物特異性檢測方法主要是通過檢測cAMP濃度的變化來判斷化合物是否激活GPCR信號通路。cAMP濃度的變化一般通過熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)的方法來測定。該測定方法價錢昂貴，且抑制型GPCR信號通路試驗常常會伴隨太強的干擾信號。第二、由IP3介導的信號通路。Gqm蛋白(與磷酸脂酶C活化相關(guān)G蛋白)偶聯(lián)受體與配體結(jié)合后會激活β磷酸脂酶CXPLC-β )，ΡΙΧ-β裂解其底物ΡΙΡ2生成ΙΡ3和DAG。ΙΡ3濃度的增加刺激內(nèi)質(zhì)網(wǎng)釋放鈣離子，導致細胞質(zhì)內(nèi)鈣離子濃度迅速增加；同時非極性的1，2-DAG在質(zhì)膜上激活蛋白激酶C (PKC)，使細胞內(nèi)相關(guān)蛋白質(zhì)磷酸化，從而起到調(diào)節(jié)這些蛋白質(zhì)的活性的作用(見圖I虛線左側(cè)示意圖)?；贗P3信號傳導原理的化合物特異性檢測方法主要通過檢測鈣離子濃度的瞬時變化來檢測。鈣離子濃度的測定方法一般需要熒光標記的鈣離子濃度指示劑，主要包括化學合成的熒光指示劑和通過生物體表達的熒光指示劑。測定方法包括鈣敏發(fā)光蛋白水母素測定法、β -arrestin發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移測定法(FRET)、鈣離子染色法(FLIPR)等。除以上兩種GPCR信號傳導途徑外，還有少部分信號通路是通過G12/13蛋白偶聯(lián)受體傳導的。以上不同類型GPCR對化合物的檢測方法只能針對某一類型的GPCR信號通路，不能同時適用于其它的GPCR信號通路。并且，以上常規(guī)的GPCR化合物特異性檢測方法通常需要構(gòu)建穩(wěn)定的細胞株，而構(gòu)建穩(wěn)定的細胞株耗時耗力。少數(shù)公司和科研機構(gòu)利用形態(tài)學電阻抗原理對GPCR信號進行檢測，但這類技術(shù)成本極其昂貴，常規(guī)客戶難以承受。因此，在GPCR化合物特異性檢測服務市場上，對低成本、高效率的檢測方法有巨大的需求。

發(fā)明內(nèi)容
為了克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，本發(fā)明的首要目的在于提供一種重組的HEK-293細胞的制備方法，該制備方法是利用瞬時轉(zhuǎn)染技術(shù)將GPCR質(zhì)粒、G蛋白突變體質(zhì)粒和水母發(fā)光蛋白質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK-293細胞。本發(fā)明的第二目的在于提供由上述方法制備得到的重組的HEK-293細胞。本發(fā)明的第三目的在于提供上述重組的HEK-293細胞在GPCR化合物特異性檢測中的應用一是用一種GPCR檢測多種未知的化合物，以檢測出與該GPCR能特異性結(jié)合的 化合物；二為用一種化合物檢測多種GPCR，以檢測出能與該化合物特異性結(jié)合的GPCR。本發(fā)明的GPCR化合物特異性檢測方法不需要構(gòu)建穩(wěn)定的細胞株，且能將細胞內(nèi)復雜多變的GPCR信號通路統(tǒng)一為鈣離子傳導的GPCR信號通路，適用于所有GPCR信號通路的檢測，檢測的靈敏度高、周期短、成本低。本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實現(xiàn)一種重組的HEK-293細胞的制備方法，包括以下步驟(I)制備HEK-293細胞懸液將HEK-293細胞分散于無血清培養(yǎng)基中，懸浮培養(yǎng)后得到HEK-293細胞懸液；(2)制備質(zhì)?；旌衔飳PCR質(zhì)粒、G蛋白突變體質(zhì)粒與水母發(fā)光蛋白質(zhì)粒按質(zhì)量比3:1:1加入到無血清培養(yǎng)基中，得到GPCR質(zhì)?；旌衔铮?3)配制轉(zhuǎn)染復合物將聚乙烯亞胺(Polyethyleneimine, PEI)加入到無血清培養(yǎng)基中，得到PEI試劑；聚乙烯亞胺的質(zhì)量是水母發(fā)光蛋白質(zhì)粒質(zhì)量的2 10倍；(4)將GPCR質(zhì)?；旌衔锱cPEI試劑混合均勻，室溫靜置5 15分鐘，得到轉(zhuǎn)染復合物；(5 )轉(zhuǎn)染HEK-293細胞將轉(zhuǎn)染復合物加入到HEK-293細胞懸液中，懸浮培養(yǎng)48 72小時，得到轉(zhuǎn)染了三種質(zhì)粒的重組HEK-293細胞；步驟(I)所述的懸浮培養(yǎng)是懸浮培養(yǎng)24 48小時，所述的HEK-293細胞懸液中HEK-293細胞的濃度為IO4 IOfVmL ；步驟(2)所述的GPCR 質(zhì)粒為質(zhì)粒 GAL2、LTD4R2、LTD4R1、HRH2、GCGR、SST2、SST5、EP1、EP4、EP3、A1、GRPR、HTR4、HRH1、END0、MCHR2、M3、M1、PTH1R、D2、D1、HTR2A、FP、TP、 β2、NKl、NMBR、BI、ADRA1A、EDG3、OXTR、E2、NTSRl、UTR2、VIA、MTLR、FPRl、IP、LPAR3、LPAR2 或HTR2A中的一種；步驟(I)- (3)中所述的無血清培養(yǎng)基是在Free Style 293培養(yǎng)基中添加了
O.05% (質(zhì)量體積比)的F-68試劑；步驟(I)和(5)所述懸浮培養(yǎng)的條件是37°C、5% C02、10(T200rpm懸浮振蕩培養(yǎng)。由上述方法制備得到的重組的HEK-293細胞可以用于GPCR化合物特異性檢測。上述重組的HEK-293細胞在GPCR化合物特異性檢測中的應用，具體包括以下步驟(I)將重組的HEK-293細胞分散于無血清培養(yǎng)基中，懸浮培養(yǎng)后得到重組HEK-293細胞懸液；(2)往步驟(I)的重組HEK-293細胞懸液中加入腔腸素(Coelenterazine),腔腸素與重組HEK-293細胞懸液的體積比為I: (1000^2000)，懸浮培養(yǎng)30分鐘后得到重組細胞液；(3)用 Hank’s 平衡鹽溶液(Hank，s Balanced Salt Solution, HBSS)稀釋待測化合物，得到待測化合物溶液；
(4)將重組細胞液分為對照組和待測組，往待測組中加入待測化合物溶液，往對照組中加入Hank’s平衡鹽溶液；(5)GPCR激活實驗檢測對照組和待測組中重組的HEK-293細胞發(fā)出的熒光信號；若待測組發(fā)出的熒光信號強度高于對照組，則說明該待測化合物對所檢測的GPCR有激活作用，反之則無；(6) GPCR抑制實驗再往步驟(5)的待測組和對照組中加入GPCR相應的激動劑，檢測其熒光信號；則對照組有相應的信號激活，若檢測到的待測組熒光信號強度低于對照組的50%，則說明該待測化合物對重組的HEK-293細胞中的GPCR有抑制作用，反之則無；上述步驟中的重組的HEK-293細胞和待測化合物，是含有單一 GPCR質(zhì)粒的重組的HEK-293細胞與多種待測化合物，用于檢測出能與該GPCR特異性結(jié)合的特異性化合物；或者是含有不同GPCR質(zhì)粒的多種重組的HEK-293細胞與一種待測化合物，用于檢測出能與該化合物特異性結(jié)合的GPCR種類；步驟(I)所述的懸浮培養(yǎng)是懸浮培養(yǎng)24 48小時，所述的重組HEK-293細胞懸液中重組的HEK-293細胞的濃度為IO4 IOfVmL ；步驟(I)中所述的無血清培養(yǎng)基是在Free Style 293培養(yǎng)基中添加了 O. 05%(質(zhì)量體積比)的F-68試劑；步驟(I)和(2)所述懸浮培養(yǎng)的條件是37°C、5% C02、10(T200rpm懸浮振蕩培養(yǎng)；步驟(4)所述的重組細胞液與待測化合物溶液的體積比為2:1。本發(fā)明將重組的HEK-293細胞用于GPCR化合物特異性檢測的原理是重組的HEK-293細胞能表達GPCR蛋白于細胞膜上，表達的GPCR受體蛋白能特異性識別其相應的激動劑(或拮抗劑)而激活(或抑制)細胞內(nèi)G蛋白信號通路。G蛋白突變體質(zhì)粒也被轉(zhuǎn)染進293細胞中，細胞固有的G蛋白含量忽略不計，而G蛋白突變體只能介導鈣離子信號通路，故而能將多樣性的第二信使統(tǒng)一為鈣離子第二信使(見圖I虛線右側(cè)部分的BeaverBio Pathway)(附圖I中并沒有這個Pathway的說明)。轉(zhuǎn)染進細胞的水母發(fā)光蛋白質(zhì)粒表達水母發(fā)光蛋白前體蛋白，這種蛋白與之后添加的腔腸素結(jié)合成為激發(fā)態(tài)的水母發(fā)光蛋白，此蛋白能捕捉鈣離子，并釋放出466nm藍色熒光，通過檢測發(fā)光信號來檢測鈣離子的釋放量，從而檢測化合物對GPCR的激動或抑制作用。本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)具有以下的優(yōu)點及效果I、本發(fā)明通過構(gòu)建高效瞬時共轉(zhuǎn)染細胞體系(即重組的HEK-293細胞)，把細胞內(nèi)復雜多變的GPCR信號通路統(tǒng)一為鈣離子傳導的G蛋白信號通路，簡化工作流程，節(jié)約時間。2、本發(fā)明采用HEK-293細胞株作為質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的宿主細胞，成功避開傳統(tǒng)耗時費力的穩(wěn)定傳代細胞株的建立，降低產(chǎn)品周期和成本，提高生產(chǎn)效率。3、本發(fā)明采用一種獨特設計的水母自發(fā)光檢測體系，信噪比高，可重復行好，避開熒光檢測方法中需要激發(fā)光的弊端。4、本發(fā)明所提供的方法是一種靈活可變的檢測模式，不但可以通過已知GPCR來檢測未知化合物，而且可以通過已知化合物來反向檢測與其特異性結(jié)合的GPCR。5、本發(fā)明所提供的方法允許單個或多個劑量反應的研究，并且，該檢測方法有能力識別各類化合物，包括完全激動劑、部分激動劑、拮抗劑或異構(gòu)調(diào)節(jié)劑；總之，本發(fā)明提供的方法能將化合物的檢測時間從數(shù)月縮短至三到四天，且不需要昂貴的檢測儀器與試劑，成本低，效率高。



圖I是GPCR/[目號通路不意圖。虛線左側(cè)是兩種常見的GPCR/[目號通路不意圖，一種是cAMP介導的信號通路，另一種是IP3介導的鈣離子信號通路；虛線右側(cè)是本發(fā)明的信號通路示意圖(BeaverBio GPCR特異性檢測信號通路)，即利用高效瞬時共轉(zhuǎn)染細胞體系(重組的HEK-293細胞)將多樣性的第二信使統(tǒng)一為鈣離子傳導的信號通路。當激活劑與GPCR結(jié)合時時，細胞內(nèi)的IP3濃度增高，刺激細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)釋放鈣離子。水母發(fā)光蛋白能捕捉鈣離子而發(fā)出熒光信號；當抑制劑抑制GPCR信號通路時，鈣離子釋放減少，從而抑制水母發(fā)光蛋白發(fā)出熒光信號。圖中“一”表示促進作用，”表示抑制作用。圖2是多個濃度的P物質(zhì)激活NK1受體的熒光信號圖。圖3是P物質(zhì)激活NK1受體的劑量效應圖。圖4是利坦舍林抑制試驗的GPCR特異性檢測圖譜；其中，AEQ組為只轉(zhuǎn)染水母發(fā)光蛋白質(zhì)粒的實驗組，Ga 16和Gqs5組為只轉(zhuǎn)染G蛋白突變體質(zhì)粒和水母發(fā)光蛋白質(zhì)粒的實驗組；其他40組為轉(zhuǎn)染G蛋白突變體質(zhì)粒、水母發(fā)光蛋白質(zhì)粒、相應GPCR質(zhì)粒的實驗組；“ + ”表示待測組，表示陰性對照組。圖5是利坦舍林抑制HTR4和HTR2A受體的柱形信號圖。圖6是多個濃度的利坦舍林抑制HTR4和HTR2A受體的熒光信號圖；第一排圖片是不同濃度梯度利坦舍林的作用下HTR4信號通路的熒光信號圖；第二排圖片是不同濃度梯度利擔舍林的作用下HTR2A信號通路的熒光信號圖。圖7是多巴胺激活GPCR的柱形信號圖。具體實施案例下面結(jié)合實施例及附圖對本發(fā)明作進一步詳細的描述，但本發(fā)明的實施方式不限于此。實施例IP物質(zhì)(Substance P)激活速激肽受體(NK1)的劑量效應檢測P物質(zhì)是廣泛分布于神經(jīng)纖維細胞間的一種神經(jīng)肽，為NK1受體的天然激動劑，其主要作用是傳遞痛覺信息，參與感覺、運動、情緒等的調(diào)節(jié)，也與焦慮證、抑郁癥、精神分裂癥等發(fā)病機理相關(guān)。表達NK1的重組HEK-293細胞的制備方法，包括以下步驟(I)制備HEK-293細胞懸液將HEK-293細胞(購于ATCC ;下同)以6X105cells/mL的濃度懸浮培養(yǎng)于含O. 05% (質(zhì)量體積比；下同)F-68 (購于Sigma-Aldrich ;下同)的Free Style 293 培養(yǎng)基(購于 Life Technologies 公司；下同)中，于 37°C、5% CO2 環(huán)境下，160rpm懸浮振蕩培養(yǎng)24小時；(2)制備質(zhì)?；旌衔飳?NK1 質(zhì)粒(購于 Missouri S&T cDNA Resource Center ;下同)、G蛋白突變體質(zhì)粒(購于Missouri S&T cDNA Resource Center ;下同)、水母發(fā)光蛋白質(zhì)粒(購于PerkinElmer公司；下同)按質(zhì)量比3/1/1 (單位0. I μ g/mL細胞懸液)加入到50 μ L含0. 05% F-68的Free Style 293培養(yǎng)基中，得到NK1質(zhì)粒混合物；(3)配制轉(zhuǎn)染復合物將聚乙烯亞胺(Polyethyleneimine, PEI,購于PolyPlus-transfection公司；下同)以水母發(fā)光蛋白質(zhì)粒2倍質(zhì)量的量加入到50 μ L無血清培養(yǎng)基中，得到PEI試劑；(4)將NK1質(zhì)?；旌衔锱cPEI試劑混合均勻，室溫靜置10分鐘，得到轉(zhuǎn)染復合物；
(5)轉(zhuǎn)染ΗΕΚ-293細胞將100 μ L轉(zhuǎn)染復合物加入到步驟(I)的ΗΕΚ-293細胞懸液中，并將細胞液置于37°C、5% CO2中160rpm懸浮振蕩培養(yǎng)72小時，得到轉(zhuǎn)染了三種質(zhì)粒的重組HEK-293細胞。表達NK1的重組HEK-293細胞用于P物質(zhì)的劑量效應檢測，包括以下步驟(I)將重組的HEK-293細胞分散于無血清培養(yǎng)基中，懸浮培養(yǎng)后得到重組HEK-293細胞懸液；所述的無血清培養(yǎng)基是在Free Style 293培養(yǎng)基中添加了 0. 05%的F_68試劑；(2)在重組HEK-293細胞懸液中加入腔腸素(Coelenterazine,購于LifeTechnologies公司；下同)，重組HEK-293細胞懸液與腔腸素的體積比為1:2000，再置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30分鐘，得到重組細胞液；(3)用 HBSS (購于 Life Technologies 公司；下同)將 P 物質(zhì)(Substance P,購于 PHOENIX PHARMACEUTICALS, INC ;下同)分別稀釋成 1(Γ4 μ Μ、1(Γ5 μ Μ、1(Γ6 μ Μ、1(Γ7 μ M、
IO-8 μ Μ、10-9 μ Μ、10-1° μ M 的濃度梯度。(4)實驗時將50 μ L不同濃度的P物質(zhì)液分別加入到100 μ L重組細胞液中；另設一對照組，100 μ L的重組細胞液中加入50 μ L的Hank’s平衡鹽溶液。檢測細胞發(fā)出的熒光信號(應用Graphpad Prism軟件分析不同濃度的P物質(zhì)產(chǎn)生的突光信號)。(5) P物質(zhì)激活實驗結(jié)果分析熒光信號圖見圖2所示，隨P物質(zhì)濃度增加，細胞的信號峰漸強。其中對照組的圖譜為加入50 μ L的Hank’s平衡鹽溶液，也即P物質(zhì)的濃度為OuM時的熒光信號圖。將各濃度的熒光信號值繪制劑量效應曲線，如圖3所示。隨著P物質(zhì)濃度增加，各組細胞液發(fā)出的熒光信號逐漸增強，其中P物質(zhì)的EC5tl的值為0. 05965pM。實驗結(jié)果表明P物質(zhì)可特異性地激活NK1受體，且P物質(zhì)與NK1受體有良好的劑量效應關(guān)系在低濃度P物質(zhì)溶液的作用下，重組HEK-293細胞發(fā)出的熒光信號弱，隨著P物質(zhì)濃度增加，熒光信號也相應地增強。實施例2檢測與利坦舍林(Ritanserin)特異性結(jié)合的GPCR利坦舍林為5-羥色胺受體(5-HTR，一種G蛋白偶聯(lián)受體)的阻斷劑，對5-HTR有選擇性阻滯作用。在外周組織，5-THR介導血管收縮和平滑肌的收縮，是應對5-羥色胺(5-HT)引起的血管收縮和支氣管痙孿的有效拮抗劑，有降低高血壓的作用。表達不同種類GPCR的重組HEK-293細胞的制備方法，包括以下步驟(I)制備HEK-293細胞懸液將HEK-293細胞以6X 105cells/mL的濃度懸浮培養(yǎng)于含O. 05% F-68的Free Style 293培養(yǎng)基中，于37°C、5% CO2環(huán)境下，160rpm懸浮振蕩培養(yǎng)24小時； (2)制備質(zhì)?；旌衔锓謩e將不同的GPCR質(zhì)粒(總共40種，分別為GAL2、LTD4R2、LTD4R1、HRH2、GCGR、SST2、SST5、EPI、EP4、EP3、Al、GRPR、HTR4、HRHl、ENDO, MCHR2、M3、Ml、PTH1R、D2、D1、HTR2A、FP、TP、β 2、NK1、NMBR、B1、ADRA1A、EDG3、0XTR、E2、NTSR1、UTR2、V1A、MTLR、FPRl、IP、LPAR3、LPAR2，均購于 Missouri S&T cDNA Resource Center;下同)與 G蛋白突變體質(zhì)粒、水母發(fā)光蛋白質(zhì)粒按質(zhì)量比3/1/1 (單位0. I μ g/ml細胞懸液)加入到50 μ L含O. 05 % F-68的Free Style 293培養(yǎng)基中，得到40種GPCR質(zhì)?；旌衔?；將水母發(fā)光蛋白質(zhì)粒加入到含O. 05% F-68的Free Style 293培養(yǎng)基中，使培養(yǎng)基中水母發(fā)光蛋白質(zhì)粒的濃度為O. I μ g/mL，得到表達水母發(fā)光蛋白的質(zhì)?；旌衔?；將G蛋白突變體質(zhì)粒與水母發(fā)光蛋白質(zhì)粒按質(zhì)量比1/1 (單位0. I μ g/ml細胞懸液)加入到50μ L含O. 05% F-68的Free Style 293培養(yǎng)基中，得到表達G蛋白突變體和水母發(fā)光蛋白的質(zhì)粒混合物。(3)配制轉(zhuǎn)染復合物將聚乙烯亞胺以發(fā)光蛋白質(zhì)粒2倍質(zhì)量的量加入到50 μ L無血清培養(yǎng)基中，得到PEI試劑；將步驟(2)得到的40種質(zhì)?；旌衔锓謩e與PEI試劑混合均勻，室溫靜置10分鐘，得到轉(zhuǎn)染復合物；(4)轉(zhuǎn)染ΗΕΚ-293細胞將100 μ L轉(zhuǎn)染復合物滴入ΗΕΚ-293細胞懸液中，并將細胞液置于37°C、5% CO2,160rpm懸浮振蕩培養(yǎng)72小時，得到轉(zhuǎn)染了三種質(zhì)粒的重組HEK-293細胞、只轉(zhuǎn)染了水母發(fā)光蛋白質(zhì)粒(AEQ)的重組HEK-293細胞、同時轉(zhuǎn)染了 G蛋白突變體質(zhì)粒與水母發(fā)光蛋白質(zhì)粒的重組HEK-293細胞。利坦舍林GPCR特異性檢測方法，包括以下步驟(I)將40種重組的HEK-293細胞分別分散于無血清培養(yǎng)基中，懸浮培養(yǎng)后得到重組HEK-293細胞懸液；所述的無血清培養(yǎng)基是在Free Style 293培養(yǎng)基中添加了 O. 05%的F-68試劑；(2)在重組HEK-293細胞懸液中加入腔腸素，重組HEK-293細胞懸液與腔腸素的體積比為1:2000，再置于37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中160rpm懸浮振蕩培養(yǎng)30分鐘，得到重組細胞液；(3)用HBSS稀釋利坦舍林(Ritanserin,購于R&D Systems ;下同)的終濃度為IOnM,(4)實驗時將步驟(2)所得到的各種重組細胞液分成兩組，一組為陰性對照組，一組為待測組，每組100 μ Lo將利坦舍林溶液50 μ L加入到待測組中，檢測細胞發(fā)出的突光信號。將50 μ L HBSS加入到陰性對照組中，檢測細胞發(fā)出的熒光信號。(5 )在步驟(4 )的基礎上，往待測組和陰性對照組中分別加上相應的GPCR激動劑，檢測細胞發(fā)出的熒光信號。各個激動劑的終濃度分別是該激動剛好能激活80%信號時該激動劑的濃度(EC80)。各種GPCR對應的激動劑解釋如下GAL2的激動劑是促生長激素神經(jīng)肽(Galanin,購于 PHOENIX PHARMACEUTICALS INC. ) ；LTD4R2 和 LTD4R1 的激動劑是白細胞三烯(LTD4，購于CAYMAN CHEMICAL COMPANY) ；HRH2和HRHl的激動劑是組胺(Histamine,購于 Sigma-Aldrich) ；GCGR 的激動劑是高血糖素(Glucagon,購于 PHOENIXPHARMACEUTICALSINC. ) ；SST2 和 SST5 的激動劑是生長激素抑制素(Somatostatin，購于 PHOENIX PHARMACEUTICALSINC.) ;EP1、EP3 和 EP4 的激動劑是前列腺素 E2(Prostaglandin E2，購于 CAYMAN CHEMICAL COMPANY) ;A1 的激動劑是腺苷(Adenosine，購于 Sigma-Aldrich) ；GRPR 和 NMBR 的激動劑是鈴蟾肽(Bombesin，購于 PHOENIXPHARMACEUTICALSINC. ) ；HTR4 和 HTR2A 的激動劑是血清素(Serotonin，購于 TOCRISBIOSCIENCE) ；END0 的激動劑是內(nèi)皮素(ET-1，購于 PHOENIX PHARMACEUTICALSINC. ) ；MCHR2的激動劑是黑色素激素(MCH，購于PHOENIX PHARMACEUTICALSINC. ) ；M3和Ml的激動劑是卡巴膽堿(Carbamoylcholine,購于Sigma-Aldrich) ；PTH1R的激動劑是甲狀旁腺激素(PTH,購于 PHOENIX PHARMACEUTICALSINC. ) ；D2 和 Dl 的激動劑是多巴胺(Dopamine，購于Sigma-Aldrich) ；FP 和 TP 的激動劑是化合物 U46619 (購于 CAYMAN CHEMICAL COMPANY)；β 2的激動劑是異丙腎上腺素(Isoprenaline,購于Sigma-AldrichhNK1的激動劑是P物質(zhì)(Substance P，購于 PHOENIX PHARMACEUTICALSINC. ) ；B1 的激動劑是緩激肽(Bradykinin，購于TOCRIS BIOSCIENCE) ；ADRAlA的激動劑是去氧腎上腺素(Phenyl印hrine，購于 TOCRIS BIOSCIENCE) ；EDG3 的激動劑是鞘氨醇 _1_ 磷酸(S1P，購于 CAYMAN CHEMICALCOMPANY) ；0XTR 的激動劑是后葉催產(chǎn)素(Oxytocin，購于 Sigma-Aldrich) ;E2、LPAR3和LPAR2是脂蛋白(LPA，購于CAYMAN CHEMICAL COMPANY) ；NTSR1的激動劑是神經(jīng)降壓素(Neurotensin，購于 PHOENIX PHARMACEUTICALSINC. ) ；UTR2 的激動劑是烏洛滕生II (Urotensin II，購于 PHOENIX PHARMACEUTICALSINC. ) ；V1A 的激動劑是后葉加壓素(AVP,購于 PHOENIX PHARMACEUTICALSINC. ) ；MTLR 的激動劑是促胃動素(Moti I in，購于 PHOENIXPHARMACEUTICALSINC. ) ；FPR1 的激動劑是化合物 FPR A14 (購于 TOCRISBIOSCIENCE) ；IP 的激動劑是伊洛前列素(Iloprost，購于 TOCRIS BIOSCIENCE)。(6)分析結(jié)果利坦舍林激活實驗在加入50 μ I利坦舍林之后，各GPCR待測組均無典型的熒光信號峰，與陰性對照組無顯著區(qū)別。表明化合物利坦舍林對GPCR并沒有特異性激活作用。利坦舍林抑制實驗在加入相應的激動劑后，各GPCR待測組的熒光信號見圖4。其中不表達GPCR的各實驗組(AEQ組、G a 16、Gqs5組)為實驗中的本底對照，無典型的熒光信號峰，表明實驗運行正常。表達GPCR的各陰性對照組的圖譜中倶有典型的熒光信號峰。待測組各組除了 HTR2A和HTR4兩個實驗組的信號比相應的陰性對照組低外，其他各GPCR組與其相應的陰性對照組的信號峰無顯著差別。各GPCR的待測組熒光信號強度除以陰性對照組的熒光信號強度，得到一系列數(shù)值，結(jié)果制作成柱形圖，即圖5。圖5中紅色橢圓圈標記的兩個GPCR (HTR2A和HTR4)反應的相對信號值顯著低于對照組，其中HTR4的信號僅為對照組的40. 79%,HTR2A的信號僅為對照組的20. 61 %。即只有HTR4和HTR2A待測組信號顯著低于陰性對照組，其余各GPCR的檢測組與對照組無顯著差別。以上結(jié)果表明利坦舍林(Ritanserin)對HTR4和HTR2A的信號通路有選擇性抑制作用。注HTR4和HTR2A為5-HTR的兩個亞型。
實施例3利坦舍林(Ritanserin)抑制5HTR受體的劑量效應檢測表達HTR4和HTR2A的重組HEK-293HEK-293細胞的制備步驟，如下(I)制備ΗΕΚ-293細胞懸液將ΗΕΚ-293細胞以6X 105cells/ml的濃度懸浮分散培養(yǎng)于含O. 05% F-68的Free Style 293培養(yǎng)基中，37°C、5% C02、160rpm懸浮振蕩培養(yǎng)24小時。(2)制備質(zhì)?；旌衔飳TR4質(zhì)粒、G蛋白突變體質(zhì)粒、水母發(fā)光蛋白質(zhì)粒按質(zhì)量比3/1/1 (單位0. I μ g/mL細胞懸液)加入到含O. 05% F-68的Free Style293培養(yǎng)基中，得到HTR4組的質(zhì)?；旌衔铮籋TR2A組的質(zhì)?；旌衔锏闹苽浞椒ㄍ琀TR4組；
(3)配制轉(zhuǎn)染復合物將聚乙烯亞胺以發(fā)光蛋白質(zhì)粒的2倍質(zhì)量的量加入到50 μ L無血清培養(yǎng)基中，得到PEI試劑；將步驟(2)的2種質(zhì)?；旌衔锱cPEI試劑混合均勻，室溫靜置10分鐘，得到2種轉(zhuǎn)染復合物；(4)轉(zhuǎn)染ΗΕΚ-293細胞將步驟(3)的2種轉(zhuǎn)染復合物各IOOyL分別加入到ΗΕΚ-293細胞懸液中，并將細胞液置于37°C、5% CO2中160rpm懸浮振蕩培養(yǎng)72小時，分別得到2種轉(zhuǎn)染了三種質(zhì)粒的重組HEK-293細胞。利坦舍林GPCR特異性檢測方法，包括以下步驟(I)將2種重組的HEK-293細胞分別分散于無血清培養(yǎng)基中，懸浮培養(yǎng)后得到2種重組HEK-293細胞懸液；所述的無血清培養(yǎng)基是在Free Style 293培養(yǎng)基中添加了 O. 05%的F-68試劑；(2)往重組HEK-293細胞懸液中加入腔腸素，重組HEK-293細胞懸液與腔腸素的體積比為1:2000，再置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30分鐘，得到2種重組細胞液；(3 )用 HBSS 將利坦舍林稀釋成 I μ Μ, 300nM, IOOnM, 30nM, IOnM, 3nM, InM 的濃度梯度。(4)將各濃度的利坦舍林液50 μ L分別加入到100 μ L的重組細胞液中。(5)將IOnM血清素(Serotonin)加入到步驟(4)的重組細胞液中，檢測細胞發(fā)出的突光信號。(6)利坦舍林抑制實驗分析結(jié)果加入IOnM血清素后各濃度組細胞的熒光信號圖見圖6，第一排圖片是各個濃度利坦舍林的作用下HTR4信號通路的熒光信號圖；第二排圖片是在各個濃度利擔舍林的作用下HTR2A信號通路的熒光信號圖。在低濃度利坦舍林溶液的作用下，重組HEK-293細胞的熒光信號無顯著影響；隨著利坦舍林溶液濃度增加，細胞發(fā)出的熒光信號也相應降低，其抑制強度也逐漸加強。以上結(jié)果表明利坦舍林對HTR4和HTR2A信號通路的抑制作用具有劑量效應關(guān)系，進一步證明了利坦舍林液可以特異性抑制由HTR4或HTR2A通路的信號傳導。實施例4多巴胺(Dopamine)的 GPCR 檢測化合物多巴胺為GPCR中的多巴胺受體(Dopamine receptor)激動劑。多巴胺是一種神經(jīng)傳導物質(zhì)，用來幫助細胞傳送脈沖的化學物質(zhì)。這種腦內(nèi)分泌物主要負責大腦的情欲，感覺，將興奮及開心的信息傳遞，一些疾病如帕金森病(H))、精神分裂癥、Tourette綜合征(TS)、注意缺陷多動障礙(ADHD)等均與多巴胺神經(jīng)遞質(zhì)傳遞障礙有關(guān)。表達各GPCR的重組HEK-293細胞，其制備方法同實施例2重組HEK-293細胞的制備方法。多巴胺GPCR特異性檢測方法，包括以下步驟(I)將40種重組的HEK-293細胞分別分散于無血清培養(yǎng)基中，懸浮培養(yǎng)后得到重組HEK-293細胞懸液；所述的無血清培養(yǎng)基是在Free Style 293培養(yǎng)基中添加了 O. 05%的F-68試劑；(2)往重組HEK-293細胞懸液中加入腔腸素，重組HEK-293細胞懸液與腔腸素的體積比為1:2000，再置于37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中160rpm懸浮振蕩培養(yǎng)30分鐘，得到重組細胞液；(3)用HBSS將多巴胺稀釋成10 μ M。 (4)將步驟(2)所得到的各種重組細胞液分成兩組，一組為陰性對照組，一組為待測組，每組100 μ Lo將多巴胺(購于Sigma-Aldrich)溶液50 μ L加入到待測組中，檢測細胞發(fā)出的熒光信號。將50yL HBSS加入到陰性組中，檢測細胞發(fā)出的熒光信號。(5)多巴胺激活實驗分析結(jié)果各陰性對照組均無典型的熒光信號峰。除Dl和D2 (多巴胺受體的兩個亞型)待測組有典型的信號峰，其余各待測組與其相應的陰性對照組一樣，無典型的熒光信號峰。將各GPCR的待測組熒光信號強度除以陰性對照組的熒光信號強度，得到的一系列的數(shù)值制作成柱形圖，即圖7。結(jié)果顯示只有轉(zhuǎn)染了 Dl和D2的重組HEK-293細胞能有典型的熒光信號峰，而轉(zhuǎn)染其它GPCR的重組HEK-293細胞在多巴胺的作用下無典型的熒光信號峰，由此可結(jié)論多巴胺只能特異性激活自身對應受體Dl和D2，而不能激活40個待測GPCR中其他GPCR的信號傳導。本發(fā)明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種重組的HEK-293細胞的制備方法，其特征在于包括以下步驟 (1)將HEK-293細胞分散于無血清培養(yǎng)基中，懸浮培養(yǎng)后得到HEK-293細胞懸液； (2)將GPCR質(zhì)粒、G蛋白突變體質(zhì)粒與水母發(fā)光蛋白質(zhì)粒按質(zhì)量比3:1:1加入到無血清培養(yǎng)基中，得到GPCR質(zhì)?；旌衔?； (3)將聚乙烯亞胺加入到無血清培養(yǎng)基中，得到PEI試劑；聚乙烯亞胺的質(zhì)量是水母發(fā)光蛋白質(zhì)粒質(zhì)量的疒10倍； (4)將GPCR質(zhì)?；旌衔锱cPEI試劑混合均勻，室溫靜置5 15分鐘，得到轉(zhuǎn)染復合物； (5)將轉(zhuǎn)染復合物加入到HEK-293細胞懸液中，懸浮培養(yǎng)48 72小時，得到轉(zhuǎn)染了三種質(zhì)粒的重組HEK-293細胞。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的重組的HEK-293細胞的制備方法，其特征在于步驟(I)所述的懸浮培養(yǎng)是懸浮培養(yǎng)24 48小時，所述的HEK-293細胞懸液中HEK-293細胞的濃度為IO4 106/mL。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的重組的HEK-293細胞的制備方法，其特征在于步驟(2)所述的 GPCR 質(zhì)粒為質(zhì)粒 GAL2、LTD4R2、LTD4R1、HRH2、GCGR、SST2、SST5、EPI、EP4、EP3、Al、GRPR、HTR4、HRH1、END0、MCHR2、M3、M1、PTH1R、D2、D1、HTR2A、FP、TP、β 2、ΝΚ1、NMBR、BI、ADRA1A、EDG3、OXTR、E2、NTSRl、UTR2、VIA、MTLR、FPRl、IP、LPAR3、LPAR2 或 HTR2A 中的一種。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的重組的HEK-293細胞的制備方法，其特征在于步驟(1)-(3)中所述的無血清培養(yǎng)基是在Free Style 293培養(yǎng)基中添加質(zhì)量體積比為O. 05%的F-68試劑。
5.—種重組的HEK-293細胞，其特征在于是由權(quán)利要求1-4任一項所述的方法制備得到。
6.權(quán)利要求5所述的重組的HEK-293細胞在GPCR化合物特異性檢測中的應用。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的重組的HEK-293細胞在GPCR化合物特異性檢測中的應用，其特征在于包括以下步驟 (1)將權(quán)利要求5所述的重組的HEK-293細胞分散于無血清培養(yǎng)基中，懸浮培養(yǎng)后得到重組HEK-293細胞懸液； (2)往步驟(I)的重組HEK-293細胞懸液中加入腔腸素，腔腸素與重組HEK-293細胞懸液的體積比為I: (100(Γ2000)，懸浮培養(yǎng)30分鐘后得到重組細胞液； (3)用Hank’s平衡鹽溶液稀釋待測化合物，得到待測化合物溶液； (4)將重組細胞液分為對照組和待測組，往待測組中加入待測化合物溶液，往對照組中加入Hank’s平衡鹽溶液； (5)檢測對照組和待測組中重組的HEK-293細胞發(fā)出的熒光信號；若待測組發(fā)出的熒光信號強度高于對照組，則說明該待測化合物對所檢測的GPCR有激活作用，反之則無； (6)再往步驟(5)的待測組和對照組中加入GPCR相應的激動劑，檢測其熒光信號；則對照組有相應的信號激活，若檢測到的待測組熒光信號強度低于對照組的50%，則說明該待測化合物對重組的HEK-293細胞中的GPCR有抑制作用，反之則無； 上述步驟中的重組的HEK-293細胞和待測化合物，是含有單一 GPCR質(zhì)粒的重組的HEK-293細胞與多種待測化合物；或者是含有不同GPCR質(zhì)粒的多種重組的HEK-293細胞與一種待測化合物。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的重組的HEK-293細胞在GPCR化合物特異性檢測中的應用，其特征在于步驟(I)中所述的無血清培養(yǎng)基是在Free Style 293培養(yǎng)基中添加質(zhì)量體積比為O. 05%的F-68試劑。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的重組的HEK-293細胞在GPCR化合物特異性檢測中的應用，其特征在于步驟(I)所述的懸浮培養(yǎng)是懸浮培養(yǎng)24 48小時，所述的重組HEK-293細胞懸液中重組的HEK-293細胞的濃度為IO4 106/mL。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種G蛋白偶聯(lián)受體對化合物特異性的檢測方法，該方法包括以下步驟制備重組HEK-293細胞懸液；在細胞懸液中加入腔腸素，得到重組細胞液；將重組細胞液分為對照組和待測組，在待測組中加入待測化合物溶液，在對照組中加入Hank's平衡鹽溶液；若待測組發(fā)出的熒光信號強度高于對照組，具有顯著差異，則說明該待測化合物對重組的HEK-293細胞中的GPCR有激活作用，反之則無；繼續(xù)在待測組中加入GPCR相應的激動劑，檢測其熒光信號；若檢測到的熒光信號強度顯著低于對照組，則說明該待測化合物對重組的HEK-293細胞中的GPCR有抑制作用，反之則無。本發(fā)明所提供的方法是一種靈活可變的檢測模式，不但可以通過已知GPCR來檢測未知化合物，而且可以通過已知化合物來反向檢測與其特異性結(jié)合的GPCR。
文檔編號C12Q1/02GK102839193SQ20121030105
公開日2012年12月26日 申請日期2012年8月22日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月22日
發(fā)明者任輝, 黃斌, 辛曉燕, 韓藍青, 張曙光 申請人:海貍(廣州)生物科技有限公司