專利名稱：一種區(qū)分長心卡帕藻與細齒麒麟菜的微衛(wèi)星標記及其特異性引物和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于海洋生物技術(shù)領(lǐng)域，具體的說是ー種區(qū)分長心卡帕藻與細齒麒麟菜的微衛(wèi)星標記及其特異性引物和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
長心卡帕藻(Kappaphycusalvarezii)和細齒麟麟菜(Eucheuma denticulatum)分別是國際上生產(chǎn)K _和t -卡拉膠的重要原料。其主產(chǎn)區(qū)主要有印度尼西亞、菲律賓、馬來西亞、越南等東南亞國家，坦桑尼亞、肯尼亞等部分非洲國家，巴西、墨西哥等中南美洲國家以及我國海南省。上述國家地區(qū)人工規(guī)模化栽培長心卡帕藻和細齒麒麟菜是維持國際卡拉膠相關(guān)產(chǎn)業(yè)發(fā)展的基礎(chǔ)。
卡拉膠由D-半乳糖和3，6-內(nèi)醚半乳糖殘基組成的海藻細胞粘性多糖。依據(jù)其殘基中酯式硫酸基鹽的含量和分子鏈接位置的差異，卡拉膠可以被分為K型、X型、t型、il型和V型等多種類型的卡拉膠。目前生產(chǎn)應(yīng)用最為廣泛的是K型卡拉膠，其次為t型卡拉膠。其主要原料分別是長心卡帕藻與細齒麒麟菜。目前在市場流通過程中，存在著某些長心卡帕藻中摻雜有細齒麒麟菜的現(xiàn)象，尤其在長心卡帕藻半精品顆粒中摻雜細齒麒麟菜顆粒比較嚴重。這是由于長心卡帕藻與細齒麒麟菜在形態(tài)上比較接近，其干品在外觀上難以區(qū)分，特別是經(jīng)過初加工處理的半精品如何檢測尚沒有具體辦法。由于兩種藻含有的卡拉膠的類型不同，提取エ藝也不盡相同，兩種海藻的摻雜不僅大大降低原材料的利用率，而且直接影響產(chǎn)品質(zhì)量，導(dǎo)致產(chǎn)品不穩(wěn)定。而憑借長心卡帕藻和細齒麒麟菜的藻株外形等形態(tài)學(xué)物種鑒定方法存在著易受生理狀態(tài)和人為因素影響等弊端，以及長心卡帕藻半精品顆粒中摻雜細齒麒麟菜顆粒難以檢測等問題，不僅會擾亂了正常市場交易，而且不利于后續(xù)產(chǎn)品的進ー步開發(fā)和應(yīng)用，易造成不必要的商品經(jīng)濟損失，并且也會影響栽培、加工和供應(yīng)商之間的商業(yè)信譽。為此，有必要開發(fā)ー種客觀、高效、穩(wěn)定的方法鑒別兩種海藻以及其半精品的技術(shù)方法。微衛(wèi)星標記是以DNA為基礎(chǔ)的分子標記，由于具有易擴增、重復(fù)性高、檢測位點多、中性標記等特點，不受生理、生活環(huán)境變化以及人為因素影響的優(yōu)點，被廣泛應(yīng)用到動植物的物種鑒別和種質(zhì)鑒定。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的提供ー種區(qū)分長心卡帕藻與細齒麒麟菜的微衛(wèi)星標記的特異性引物及其應(yīng)用。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用技術(shù)方案為ー種區(qū)分長心卡帕藻與細齒麒麟菜的微衛(wèi)星標記，長心卡帕藻微衛(wèi)星標記為SEQ.ID. NO I-5堿基序列所示；細齒麒麟菜的微衛(wèi)星標記為SEQ. ID. N06-10堿基序列所示。
ー種區(qū)分長心卡帕藻與細齒麒麟菜的微衛(wèi)星標記的特異性引物所述SEQ. ID. NOl堿基序列所示的長心卡帕藻微衛(wèi)星標記的特異性引物為F:TTCCTCAAGACGCTCCACCAAAC, R:GCGAGGTGTGAGATGCCGAGT ；SEQ. ID. N02堿基序列所示的長心卡帕藻微衛(wèi)星標記的特異性引物為F: GCCAACTCTGGTTACACATATT, R: GAGGTTTGGTTGATGAATTGA ；SEQ. ID. N03堿基序列所示的長心卡帕藻微衛(wèi)星標記的特異性引物為
F:ACAATCATATACGTCGCAAACG,R:ACAGGTAGTTGAGTGGTTGGAAAC ；SEQ. ID. N04堿基序列所示的長心卡帕藻微衛(wèi)星標記的特異性引物為F: TGTGACGACGGCGGAGAATG, R: TCTCACCAGGCGACTGCTCATC ；SEQ. ID. N05堿基序列所示的長心卡帕藻微衛(wèi)星標記的特異性引物為F: GATGGCGTGAAGATAAAAGAGA, R: ATCACTTCCACTGTCCCTATGT ；SEQ. ID. N06堿基序列所示的細齒麒麟菜微衛(wèi)星標記的特異性引物為F:CCCGCGACTAATGCAAAAGGT，R:CGTGGCTCACTATGATGAATCTAAC ；SEQ. ID. N07堿基序列所示的細齒麒麟菜微衛(wèi)星標記的特異性引物為F:TGAATGTTAGCTCGCATACCG, R:TCACAGGGCAACTTCAACAA ；SEQ. ID. N08堿基序列所示的細齒麒麟菜微衛(wèi)星標記的特異性引物為F:GATGTTGAGCAGCCTTGGGG，R: GGGTGTTTACCGCTTCTTCTTTT ；SEQ. ID. N09堿基序列所示的細齒麒麟菜微衛(wèi)星標記的特異性引物為F:CCCGTCTATTCTCGACCAGGCA，R:TTTGTGAATGTTAGCTCGCATACCG ；SEQ. ID. NOlO堿基序列所示的細齒麒麟菜微衛(wèi)星標記的特異性引物為F:ACGCCCTTGTATTGCTTGTACGG，R:GACATCAAGAAGGCTCCGAGCTAC。利用SEQ. ID. N01-10堿基序列所示微衛(wèi)星標記的特異性引物擴增，樣品中擴增出約150bp的特異性DNA片段，進而區(qū)分長心卡帕藻與細齒麒麟菜以及檢測這兩種海藻半精品是否互相摻雜。本發(fā)明所具有的優(yōu)點本發(fā)明利用特定微衛(wèi)星標記客觀、穩(wěn)定、高效的鑒別長心卡帕藻和細齒麒麟菜，根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳相應(yīng)帶型的有無可以直觀判斷待測藻株屬于哪種藻株，以及分析一種藻的半精品顆粒是否摻雜著另ー種藻的顆粒。


圖I為本發(fā)明實施例提供的利用細齒麒麟菜微衛(wèi)星標記Ed002、Ed003和Ed005對8個藻株樣品的基因組DNA進行擴增效果圖(其中，8個藻株樣品為細齒麒麟菜的新鮮樣品5F、干燥樣品以及半精品5S，長心卡帕藻的新鮮樣品7F、8F、12F、半精品12S以及干燥樣品 13D ;M 為 DL500 (Takara)，從下往上 7 條帶分別代表 50bp、lOObp、150bp、200bp、300bp、400bp 和 500bp。)。圖2為本發(fā)明實施例提供的利用細齒麒麟菜微衛(wèi)星標記Ed006和Ed007對8個藻株樣品的基因組DNA進行擴增效果圖(其中，8個藻株樣品為細齒麒麟菜的新鮮樣品5F、干燥樣品以及半精品5S，長心卡帕藻的新鮮樣品7F、8F、12F、半精品12S以及干燥樣品 13D ；M 為 DL500 (Takara)，從下往上 7 條帶分別代表 50bp、lOObp、150bp、200bp、300bp、400bp 和 500bp。)。圖3為本發(fā)明實施例提供的利用長心卡帕藻微衛(wèi)星標記Kall39、Kal272和Kal340對8個藻株樣品的基因組DNA進行擴增效果圖(其中，細齒麒麟菜的新鮮樣品5F、干燥樣品以及半精品5S，長心卡帕藻的新鮮樣品7F、8F、12F、半精品12S以及干燥樣品13D ；M 為 DL500 (Takara)，從下往上 I 條帶分別代表 50bp、lOObp、150bp、200bp、300bp、400bp 和500bp。)。圖4為本發(fā)明實施例提供的利用長心卡帕藻微衛(wèi)星標記Ka1450和Ka1476對8個藻株樣品的基因組DNA進行擴增效果圖(其中，細齒麒麟菜的新鮮樣品5F、干燥樣品5D以及半精品5S，長心卡帕藻的新鮮樣品7F、8F、12F、半精品12S以及干燥樣品13D ；M 為 DL500 (Takara)，從下往上 7 條帶分別代表 50bp、lOObp、150bp、200bp、300bp、400bp 和500bp。)。圖5-9為本發(fā)明實施例3提供的是利用10個微衛(wèi)星標記對長心卡帕藻半精品和細齒麒麟菜半精品的相互摻雜樣品的檢測示意圖(其中，長心卡帕藻半精品中摻雜質(zhì)量比例為3%、5%和10%的細齒麒麟菜半精品，它們分別用3E、5E和10E來表示；細齒麒麟菜半精品中摻雜質(zhì)量比例為3%、5%和10%的長心卡帕藻半精品，它們分別用3K、5K和10K來表示)。
具體實施例方式實施例I從NCBI (http://www. ncbi. nlm. nih. rov/)下載長心卡帕藻和細齒麒麟菜的EST序列；利用軟件MISA篩選含有微衛(wèi)星核心序列的片段,然后利用Primer Primer5. 0根據(jù)核心序列兩側(cè)的保守序列設(shè)計引物；對各個引物進行反應(yīng)條件優(yōu)化，各選取5個反應(yīng)穩(wěn)定、帶型清晰的長心卡帕藻和細齒麒麟菜的微衛(wèi)星標記(參見表I)。分別提取細齒麒麟菜和長心卡帕藻不同狀態(tài)樣品的DNA，以此DNA為模板，利用上述特異性引物，PCR擴增反應(yīng)，其產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，利用微衛(wèi)星標記的種特異性，區(qū)分這兩種海藻。。分別提取不同比例摻雜的兩種海藻(細齒麒麟菜和長心卡帕藻)半精品的DNA，以此DNA為模板，利用上述特異性引物，PCR擴增反應(yīng)，當一種藻株半精品中含有微量的另ー種藻株半精品時，提取的DNA即是兩個物種DNA的混合物，因此利用兩個物種的微衛(wèi)星標記進行擴增，其產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，均有得到相應(yīng)的條帶，用于判斷這兩種海藻半精品是否互相摻雜。實施例2從海南陵水養(yǎng)殖基地收集細齒麒麟菜的新鮮樣品(5F)、干燥樣品(5D)以及半精品(5S)(Hayashi et al. 2007),Hayashi L. , de Paula E. J. & Chow F. (2007)Growth rateand carrageenan analyses in four strains of Kappaphycus alvarezii(Rhodophyta, bigartinales)farmed in the subtropical waters of Sao Paulo State, Brazil. Journa丄of Applied Phycologyl9, 393-9.長心卡帕藻的新鮮樣品(7F、8F、12F)、干燥樣品(13D)、半精品(12S)。上述海藻的原材料均為從印度尼西亞引進的優(yōu)良種質(zhì)。每株藻株提取DNA各ー份，調(diào)整DNA濃度至20ng/ul。以每份DNA為模板，SEQ. ID. NOl-IO序列所示的微衛(wèi)星標記特異性引物為引物，各個PCR擴增的PCR反應(yīng)體系為20ul，每個反應(yīng)體系中加入模板DNAlul, 2 X PCR Mix Buffer (含有Mg2+，dNTPs)(購自廣州東盛生物科技有限公司)10ul，正向引物(10禮)0.5111，反向引物(101111)0.5111，HS Taq酶(購自廣州東盛生物科技有限公司)0. 2ul (0. 5U)，雙蒸水補齊體系至20ul。各個PCR擴增反應(yīng)程序如下94° C預(yù)變性5min后進入循環(huán)反應(yīng)，94° C變性30s，58。C退火30s，72。C延伸30s，共35個循環(huán)，最后72。C延伸5min，4。C冰箱保存。PCR反應(yīng)產(chǎn)物在2. 5%的瓊脂糖凝膠電泳(電壓120V，25min)，膠成像系統(tǒng)拍照，分析膠圖，查看各個PCR反應(yīng)產(chǎn)物中的特異性條帶。SEQ. ID. NO I-5 所示的微衛(wèi)星標記 Ed002、Ed003、Ed005、Ed006 和 Ed007 只有以細齒麒麟菜基因組DNA為模板，才能穩(wěn)定擴增出細齒麒麟菜特有的約為150bp的條帶(參見圖I和圖2);結(jié)果顯示細齒麒麟菜3個藻株樣品在約150bp處有特異性條帶產(chǎn)出，而長心卡帕 藻5個藻株樣品均無擴增產(chǎn)物。SEQ. ID. N06-10 所示的微衛(wèi)星標記 Kal 139、Kal272、Kal340、Kal450 和 Kal476 只有以長心卡帕藻基因組DNA為模板，才能穩(wěn)定擴增出長心卡帕藻特有的約150bp的條帶(參見圖3和圖4)。結(jié)果顯示長心卡帕藻5個藻株樣品在約150bp處有特異性條帶產(chǎn)出，而細齒麒麟菜3個藻株樣品均無擴增產(chǎn)物。利用這10個微衛(wèi)星標記可以清晰、客觀、準確地鑒別細齒麒麟菜和長心卡帕藻。實施例3從海南養(yǎng)殖基地采集兩種海藻樣品制作半精品(半精品制備為IOg海藻干燥樣品與250ml含10%Na0H和5%KC1的堿混合液混合，混合液于60° C水浴處理2h，去除堿液后，加水浸洗四次至中性，65° C烘干至恒重，干燥破碎)。然后將細齒麒麟菜半精品按照質(zhì)量比3%、5%和10%的比例混入到長心卡帕藻半精品中，得到3份混合樣品；同理，得到3份細齒麒麟菜半精品混合樣品，它們分別混有3%、5%和10%長心卡帕藻半精品。。按照康為世紀植物基因組試劑盒說明書，提取所述6份混合樣品的DNA各ー份，調(diào)整DNA濃度至20ng/ul。以每份DNA為模板，SEQ. ID. N01-10序列所示的微衛(wèi)星標記特異性引物為引物。各個PCR擴增的PCR反應(yīng)體系為20ul，每個反應(yīng)體系中加入模板DNAlul，2XPCRMix Buffer (含有Mg2+，dNTPs)(購自廣州東盛生物科技有限公司)10ul，正向引物(IOmM)0. 5ul，反向引物(IOmM)O. 5ul，HS Taq酶(購自廣州東盛生物科技有限公司)0. 2ul (0. 5U)，雙蒸水補齊體系至20ul。各個PCR擴增反應(yīng)程序如下94° C預(yù)變性5min后進入循環(huán)反應(yīng)，94° C變性30s，58。C退火30s，72。C延伸30s，共35個循環(huán)，最后72。C延伸5min，4。C冰箱保存。PCR反應(yīng)產(chǎn)物在2. 5%的瓊脂糖凝膠電泳(電壓120V，25min)，膠成像系統(tǒng)拍照，分析膠圖，查看各個PCR反應(yīng)產(chǎn)物中的特異性條帶。10個微衛(wèi)星標記以6種半精品DNA為模板，微衛(wèi)星標記PCR產(chǎn)物的帶型亮度與檢測樣品中其對應(yīng)物種樣品的濃度呈正比，但均可以擴增出特異性的條帶(附圖5至圖9)，結(jié)果顯示這些微衛(wèi)星標記均能將樣品檢測成功，說明當長心卡帕藻半精品中僅含有3%的細齒麒麟菜時，細齒麒麟菜的微衛(wèi)星標記便可將摻入的細齒麒麟菜檢出；同樣，當細齒麒麟菜半精品中僅含有3%的長心卡帕藻時，長心卡帕藻的微衛(wèi)星標記也可將摻入的長心卡帕藻檢出。表I
權(quán)利要求
1.一種區(qū)分長心卡帕藻與細齒麒麟菜的微衛(wèi)星標記，其特征在于長心卡帕藻微衛(wèi)星標記為SEQ. ID. N01-5堿基序列所示；細齒麒麟菜的微衛(wèi)星標記為SEQ. ID. N06-10堿基序列所示。
2.一種區(qū)分長心卡帕藻與細齒麒麟菜的微衛(wèi)星標記的特異性引物，其特征在于 所述SEQ. ID. NOl堿基序列所示的長心卡帕藻微衛(wèi)星標記的特異性引物為F:TTCCTCAAGACGCTCCACCAAAC, R:GCGAGGTGTGAGATGCCGAGT ； SEQ. ID. N02堿基序列所示的長心卡帕藻微衛(wèi)星標記的特異性引物為F:GCCAACTCTGGTTACACATATT, R:GAGGTTTGGTTGATGAATTGA ； SEQ. ID. N03堿基序列所示的長心卡帕藻微衛(wèi)星標記的特異性引物為F:ACAATCATATACGTCGCAAACG,R:ACAGGTAGTTGAGTGGTTGGAAAC ； SEQ. ID. N04堿基序列所示的長心卡帕藻微衛(wèi)星標記的特異性引物為F:TGTGACGACGGCGGAGAATG, R: TCTCACCAGGCGACTGCTCATC ； SEQ. ID. N05堿基序列所示的長心卡帕藻微衛(wèi)星標記的特異性引物為F: GATGGCGTGAAGATAAAAGAGA, R: ATCACTTCCACTGTCCCTATGT ； SEQ. ID. N06堿基序列所示的細齒麒麟菜微衛(wèi)星標記的特異性引物為F:CCCGCGACTAATGCAAAAGGT,R:CGTGGCTCACTATGATGAATCTAAC ； SEQ. ID. N07堿基序列所示的細齒麒麟菜微衛(wèi)星標記的特異性引物為F: TGAATGTTAGCTCGCATACCG, R: TCACAGGGCAACTTCAACAA ； SEQ. ID. N08堿基序列所示的細齒麒麟菜微衛(wèi)星標記的特異性引物為F:GATGTTGAGCAGCCTTGGGG, R: GGGTGTTTACCGCTTCTTCTTTT ； SEQ. ID. N09堿基序列所示的細齒麒麟菜微衛(wèi)星標記的特異性引物為F:CCCGTCTATTCTCGACCAGGCA,R:TTTGTGAATGTTAGCTCGCATACCG ； SEQ. ID. NOlO堿基序列所示的細齒麒麟菜微衛(wèi)星標記的特異性引物為F:ACGCCCTTGTATTGCTTGTACGG,R:GACATCAAGAAGGCTCCGAGCTAC。
3.按權(quán)利要求2所述的區(qū)分長心卡帕藻與細齒麒麟菜的微衛(wèi)星標記的特異性引物的應(yīng)用，其特征在于利用SEQ. ID. N01-10堿基序列所示微衛(wèi)星標記的特異性引物擴增，樣品中擴增出約150bp的特異性DNA片段，進而區(qū)分長心卡帕藻與細齒麒麟菜以及檢測這兩種海藻半精品是否互相摻雜。
全文摘要
本發(fā)明屬于海洋生物技術(shù)領(lǐng)域，具體的說是一種區(qū)分長心卡帕藻與細齒麒麟菜的微衛(wèi)星標記及其特異性引物和應(yīng)用。長心卡帕藻微衛(wèi)星標記為SEQ.ID.NO1-5堿基序列所示；細齒麒麟菜的微衛(wèi)星標記為SEQ.ID.NO6-10堿基序列所示。利用SEQ.ID.NO1-10堿基序列所示微衛(wèi)星標記的特異性引物擴增，樣品中擴增出約150bp的特異性DNA片段，進而區(qū)分長心卡帕藻與細齒麒麟菜以及檢測這兩種海藻半精品是否互相摻雜。采用本發(fā)明微衛(wèi)星標記進行區(qū)分長心卡帕藻與細齒麒麟菜的方法高效、穩(wěn)定性高、操作簡單，能在約4小時內(nèi)完成鑒別、檢測工作。
文檔編號C12N15/11GK102757957SQ20121024915
公開日2012年10月31日 申請日期2012年7月18日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月18日
發(fā)明者劉建國, 龐通, 張振, 李凌, 林偉 申請人:中國科學(xué)院海洋研究所