專利名稱：稻瘟病菌無毒基因Avr-Pit分子標記的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種檢測稻瘟病菌無毒基因Avr-Pit的分子標記引物，以及利用所述引物檢測稻瘟病菌無毒基因Avr-Pit的分子標記方法。
背景技術：
水稻是重要的糧食作物之一，而稻瘟病是世界分布最廣、為害最嚴重的水稻病害之一，己成為水稻高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)的主要障礙因素(0u S H. 1980, Pathogen variability andhost resistance in rice blast disease. Ann Rev Phyt opathol. 18:167-187.),它造成的危害正嚴重威脅著人類的糧食安全。防治稻瘟病也同其他水稻病害一樣，是通過利用殺菌劑，栽培措施與種植抗病品種相結合的方式進行的，而種植抗病品種是防治稻瘟病最經(jīng)濟有效的辦法之一。然而要卓有成效地開展抗病育種工作，除了必須尋找優(yōu)良的抗源外，還必須深入研究稻瘟病菌的致病機制以及水稻與稻瘟病菌之間的互作機理等，而且在病原菌與寄主協(xié)同進化過程中，病原菌毒力基因組成會隨著寄主抗病基因組成的變化而改變，最終導致抗病品種抗性的喪失(Zeigler R S. 1998, Recombination in Magnaporthegrisea. Annu Rev Phytopathol, 36:249-275.)。在分子水平上研究這種互作關系，不僅要不斷發(fā)現(xiàn)和利用新的抗病基因，進行水稻品種抗病基因分析，將多個抗病基因混合使用外，同時也必須對稻瘟病菌群體中的無毒基因進行分析。對無毒基因產(chǎn)物的研究是進一步了解特異性的分子遺傳機制的重要手段，無毒基因可以作為一種分子探針用于研究稻瘟病菌的毒性群體結構特征，揭示其變異規(guī)律及動態(tài)，也可為抗病品種的合理布局和培育抗病品種及病害防治提供理論依據(jù)，從而達到長期、有效地控制該病害的目的(石軍等，稻瘟病菌無毒基因研究進展.中國生物工程雜志，2006，26 (12) :112 116)。按照傳統(tǒng)稻瘟病菌毒性組成(生理小種)鑒定的方法是通過鑒別品種的致病型鑒定劃分生理小種來研究稻瘟病菌的群體結構，通過這種方法可了解稻瘟病菌群體中的生理小種組成和優(yōu)勢種群的變化，從而掌握稻瘟病菌的群體結構和遺傳變異動態(tài)，但劃分的生理小種常因鑒別品種而異，且工作量大，結果易受季節(jié)限制，環(huán)境條件人為因素的影響，難以準確反映稻瘟病菌的群體結構(陳慶河，稻瘟病菌群體遺傳多樣性及其無毒基因的遺傳分析與分子標記定位.2005.南京農(nóng)業(yè)大學博士學位論文)。隨著分子遺傳學和分子生物學的發(fā)展，DNA水平上的指紋分析技術(如，SSR,RAPD, CAPS)為研究稻瘟病菌群體無毒基因的組成提供了高效、快速的方法，避免了通過鑒別品種的致病型鑒定的大量工作，因此國內(nèi)外都非常重視稻瘟病菌無毒基因的分子標記篩選工作。目前利用DNA分子標記已鑒定了 40多個稻瘟病菌的無毒基因(Ma，J.
H.，Wang, L，F(xiàn)eng, S. J.，Linj F.，Xiaoj Y.，and Pan, Q. Η. 2006. Identification and finemapping of AvrPi15, a novel avirulence gene of Magnaporthe grisea. Theor ApplGenetll3:875-883.)，并已經(jīng)克隆到了 9 個無毒基因(Pwll、Pwl2、Avr_C039、Avr-pita、ACEI λ Avr-PiaΛ Avr-Pi i Λ AvrPiz-1和Avr-Pik)，這就為通過分子標記來鑒定毒性組成創(chuàng)造了便捷條件。一些無毒基因連鎖的分子標記(尤其是早期定位所用的分子標記)大多是RFLP標記，但由于這類標記需要復雜的操作程序、昂貴的生化試劑和大量樣本的DNA，不便于無毒基因的毒性組成分析。近年來，越來越多種類的生物基因組序列公布出來，使得分子標記的發(fā)展迅速。本研究采用的CAPS標記(酶切擴增多態(tài)性序列，Cleaved AmplifiedPolymorphism Sequences)是基于RFLP標記發(fā)展而來，由特異引物PCR與限制性酶切相結合而產(chǎn)生。當SCAR或STS的特異擴增產(chǎn)物的電泳譜帶不表現(xiàn)多態(tài)性時，可以用限制性內(nèi)切酶對擴增產(chǎn)物進行酶切，然后再通過瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測其多態(tài)性。它揭示的是特異PCR產(chǎn)物DNA序列內(nèi)限制性酶切位點變異的信息，目前已經(jīng)在分子生物學、遺傳學、育種學等研究領域得到廣泛應用。CAPS是一種基于PCR技術的分子標記，具有共顯性、位點特異性、重復性好、操作簡單和成本低等特點，是一種 值得推廣的標記手段，有助于揭示大田中無毒基因的變異規(guī)律及動態(tài)，能大大增加目標染色體區(qū)段的PCR標記飽和度，力口快無毒基因的克隆工作。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術問題是提供一種利用分子標記快速、準確檢測稻瘟病菌無毒基因Avr-Pit的方法，篩選獲得與無毒基因Avr-Pit緊密連鎖且不受環(huán)境影響的分子標記并進行染色體定位，將分子標記與病菌的毒性組成緊密地聯(lián)系起來。本發(fā)明提供的技術方案是一種檢測稻瘟病菌無毒基因Avr-Pit的分子標記引物，其上游引物序列如SEQ ID No. I所述，下游引物序列如SEQ ID No. 2所述。一種稻瘟病菌無毒基因Avr-Pit的分子標記檢測方法利用上述的引物擴增待測稻瘟病菌基因組DNA，取擴增產(chǎn)物用酶EarI進行酶切，然后對酶切片段進行凝膠電泳，若出現(xiàn)兩條長度分別為268bp和IOlbp的片段，則待測稻瘟病菌基因組含有無毒基因Avr-Pit。上述的檢測方法，其中EarI酶切體系為10X4buffer2. O μ 1，DNA0. 5 μ g，EarI酶O. 5 μ I,加無菌超純水至20 μ I。本發(fā)明提供另一種檢測稻瘟病菌無毒基因Avr-Pit的分子標記引物，其上游引物序列如SEQ ID No. 3所述，下游引物序列如SEQ ID No. 4所述。本發(fā)明提供另一種稻瘟病菌無毒基因Avr-Pit的分子標記檢測方法利用上述的引物擴增待測稻瘟病菌基因組DNA，取擴增產(chǎn)物用酶PciI進行酶切，然后對酶切片段進行凝膠電泳，若出現(xiàn)兩條長度分別為472bp和382bp的片段，則待測稻瘟病菌基因組含有無毒基因 Avr-Pit。上述的檢測方法，其PciI酶切體系為10X3buffer 2. O μ I, DNA O. 5 μ g,100 X BSA O. 2 μ I，PciI 酶 O. 5 μ I，加無菌超純水至 20 μ L·上述的檢測方法，擴增待測稻瘟病菌基因組DNA的PCR反應體系為10ΧΕχTaqbuffer 5. O μ I, MgCl2 2mM, dNTPs O. 2mM, Ex Taq DNA 聚合酶 I. 25U，上、下引物各為O. 5 μ M，模板DNA2. 5ng，加無菌超純水至50 μ I ;PCR反應參數(shù)為94°C預變性5min ;94°C變性 30S, 57°C退火 30S, 72°C延伸 Imin, 31 個循環(huán)；72°C延伸 8min。本發(fā)明具有以下有益效果與現(xiàn)有的分子標記技術相比，其優(yōu)點和積極效果表現(xiàn)在(I)標記穩(wěn)定本發(fā)明獲得的無毒基因分子標記為CAPS標記，兩個連鎖的分子標記穩(wěn)定，不易受反應體系、條件、DNA濃度的影響，而且操作簡單，結果明確。(2)節(jié)約時間和成本稻瘟病菌群體毒性組成監(jiān)測的傳統(tǒng)方法是通過鑒別品種的致病型鑒定劃分生理小種來研究稻瘟病菌的群體結構，通過這種方法可了解稻瘟病菌群體中的生理小種組成和優(yōu)勢種群的變化，從而掌握稻瘟病菌的群體結構和遺傳變異動態(tài)，但鑒定受季節(jié)的限制、劃分的生理小種常因鑒別品種而異，且結果易受環(huán)境條件人為因素的影響，準確性低，難以準確反映稻瘟病菌的群體結構。通過本發(fā)明篩選出的與無毒基因緊密連鎖的分子標記不受環(huán)境影響，可以準確地靶定無毒基因，節(jié)約大量時間和成本，快速分析田間稻瘟病菌無毒基因的組成、分布及演變規(guī)律。

本發(fā)明通過對稻瘟菌株交配產(chǎn)生的子囊孢子后代群體進行遺傳分析，運用CAPS標記技術，可以構建并定位稻瘟菌無毒基因Avr-pit的遺傳圖譜，獲得了與無毒基因緊密連鎖的分子標記。通過獲得與稻瘟病菌無毒基因緊密連鎖的分子標記，不僅可利用該無毒基因的標記作探針，研究該無毒基因在自然群體中的分布情況，揭示病菌群體毒性組成和變異特點，且為進一步物理作圖法克隆該無毒基因奠定基礎。本發(fā)明用分子標記技術，定位了稻痕病菌的無毒基因Avr-pit。


圖Ia為電泳檢測由CAPS標記引物CAPS77擴增稻瘟病菌親本菌株基因組DNA產(chǎn)物的酶切結果；圖Ib為電泳檢測由CAPS標記引物CAPS77擴增稻瘟病菌部分雜交后代基因組DNA產(chǎn)物的酶切結果；A :無毒菌株，V :毒性菌株；M 2kb plus marker。圖2為電泳檢測由CAPS標記引物CAPS88擴增稻瘟病菌親本菌株及部分雜交后代基因組DNA產(chǎn)物的酶切結果；A :無毒菌株，V :毒性菌株；M 2kb plus marker。圖3為無毒基因Avr-Pit的部分連鎖遺傳圖。
具體實施例方式下面通過具體實施方式
的詳細描述來進一步闡明本發(fā)明，但并不是對本發(fā)明的限制，僅僅作示例說明。實施例I :稻瘟病菌無毒基因Avr-Pit連鎖的分子標記、定位，是通過以下方法獲得的I)利用親本GuylI與JS153 (親本菌株為南京農(nóng)業(yè)大學植病系保存菌株)以及雜交獲得的有性后代(陳慶河等鑒定)，在初步得到的與無毒基因Avr-Pit連鎖遺傳的SSR標記m355_356基礎上(Chen QH, Wang YC, Li AN, Zhang ZG, Zheng XB. 2007. Molecular mappingof two cultivar-specific avirulence genes in the rice blast fungus Magnaporthegrisea. Mol Genet Genomics. 277 (2) : 139-48.)，設計 CAPS 標記引物，引物序列如表 I :表I
權利要求
1.一種檢測稻瘟病菌無毒基因的分子標記引物，其特征在于其上游引物序列如SEQ ID No. 3所述，下游引物序列如SEQ ID No. 4所述。
2 一種稻瘟病菌無毒基因的分子標記檢測方法，其特征在于利用權利要求2所述的引物擴增待測稻瘟病菌基因組DNA，取擴增產(chǎn)物用酶PciI進行酶切，然后對酶切片段進行凝膠電泳，若出現(xiàn)兩條長度分別為472bp和382bp的片段，則待測稻瘟病菌基因組含有無毒基因d vr-Pi t。
3 根據(jù)權利要求2所述的檢測方法，其特征在于fcil酶切體系為10X3buffer 2.0μ I, DNA O. 5 μ g, 100XBSA O. 2 μ UciI 酶 O. 5 μ 1，加無菌超純水至 20 μ I。
4.根據(jù)權利要求2或3任一項所述的檢測方法，其特征在于擴增待測稻瘟病菌基因組 DNA 的 PCR 反應體系為10Χ位 Taq buffer 5. O μ I, MgCl2 2 mM, dNTPs O. 2 mM, ExTaq DNA聚合酶I. 25 U，上、下引物各為O. 5 μΜ，模板DNA 2.5 ng，加無菌超純水至50 μ I ；PCR反應參數(shù)為94°C預變性5 min ； 94 °C變性30 S，57°C退火30 S，72 °C延伸I min，31個循環(huán)；72 °C延伸8 min。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種利用分子標記快速、準確檢測稻瘟病菌無毒基因Avr-Pit的方法，其利用兩對特異性引物，其中一對引物的上游引物為ACCGCGATCAGTGGAAAACT，下游引物為ATTGGCAGAGCCAGCTACTC；另一對引物的上游引物為TTGTGTTCCTGTCAATCGCG，下游引物為CGCAGCTTATATCTCGGATAG。本發(fā)明方法操作簡單，結果明確，節(jié)約時間和成本。
文檔編號C12Q1/68GK102766691SQ20121024254
公開日2012年11月7日 申請日期2010年10月14日 優(yōu)先權日2010年10月14日
發(fā)明者張正光, 王源超, 董妍涵, 董莎萌, 鄭小波 申請人:南京農(nóng)業(yè)大學