專利名稱：利用轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)蝦青素的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物基因工程領(lǐng)域，涉及利用轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)目的物的方法。特別涉及構(gòu)建植物載體，通過其獲得重組宿主細(xì)胞，并獲得產(chǎn)蝦青素的轉(zhuǎn)基因植物的方法。
背景技術(shù)：
蝦青素(3，3’_ 二羥基4，4’_ 二酮基β_胡蘿卜素)是酮式類胡蘿卜素，是自然界中最強(qiáng)的抗氧化劑，其抗氧化活性是維生素E的5 O O倍，也遠(yuǎn)高于其他常用的抗氧化劑。醫(yī)學(xué)研究證明蝦青素具有保護(hù)皮膚和眼睛，提高免疫力，抗心血管疾病，抗炎，抗腫瘤，抗衰老等生物學(xué)功能。蝦青素廣泛存在于水生生物，如微藻和水生動(dòng)物(動(dòng)物本身不能合成，必須通過食物鏈獲得)。人類主要通過食用水產(chǎn)品來獲得蝦青素。人工養(yǎng)殖的水產(chǎn)品其蝦青
素來源于添加于其喂養(yǎng)飼料的化學(xué)合成蝦青素。人工蝦青素含有多種對(duì)人體有害的物質(zhì)，它的使用無疑造成食物鏈的污染。隨著各國對(duì)化工產(chǎn)品用于養(yǎng)殖業(yè)的嚴(yán)格限制，人工蝦青素遲早要退出市場。蝦青素的生物合成只發(fā)生于少數(shù)生物且其產(chǎn)量通常很低。雨生紅球藻是自然界中蝦青素含量最高的生物，是目前唯一用于商業(yè)化生產(chǎn)天然蝦青素的單細(xì)胞真核綠藻(植物的祖先)。然而雨生紅球藻生長慢，對(duì)生長環(huán)境敏感，不能象螺旋藻那樣進(jìn)行大規(guī)模低成本養(yǎng)殖。利用雨生紅球藻商業(yè)化生產(chǎn)天然蝦青素是近十年的事情。因投入大，技術(shù)要求高，同時(shí)受制于雨生紅球藻自身的遺傳特性，目前雨生紅球藻養(yǎng)殖企業(yè)只能以小的生產(chǎn)規(guī)模和較高的生產(chǎn)成本來生產(chǎn)蝦青素。這是造成天然蝦青素價(jià)格高昂和供不應(yīng)求的主要原因。一直以來，人們?cè)噲D通過優(yōu)化雨生紅球藻培養(yǎng)條件或篩選突變體來解決蝦青素的生產(chǎn)問題，但迄今未獲得突破性進(jìn)展。近十年來不斷有嘗試將雨生紅球藻等微生物蝦青素合成途徑關(guān)鍵酶基因表達(dá)于模式生物，如大腸桿菌，酵母以及模式植物并取得一定的成功。其中以葉綠體基因組轉(zhuǎn)化表達(dá)細(xì)菌來源的加氧酶基因的煙草蝦青素含量最高(HasunumaΤ, et al. Plant Journal 2008, 55:857-868)，但其含量只及雨生紅球藻的十分之一以下，遠(yuǎn)未達(dá)低成本產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)水平。限制植物高效合成和積累蝦青素的主要原因是植物內(nèi)源高活性的胡蘿卜素羥化酶(BHY)使羥化β-胡蘿卜素占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)而典型的β-胡蘿
卜素加氧酶(BKT)難以催化羥化胡蘿卜素成蝦青素。分離和功能分析新型BKT并將其高效表達(dá)于含有大量類胡蘿卜素的植物特異組織和器官，如番茄的果實(shí)，胡蘿卜的塊根等是解決這一難題的關(guān)鍵所在。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的上述問題，提供一種利用基因工程技術(shù)使植物高效合成和積累蝦青素的方法。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取了以下技術(shù)方案植物表達(dá)載體pBI121-LTPCRBKT和ρΒΙ121-ΒΗΥΒΚΤ，通過來自衣藻的β-胡蘿卜素加氧酶BKT和來自雨生紅球藻的β-胡蘿卜素羥化酶BHY基因連接到有引導(dǎo)基因產(chǎn)物定位的植物葉綠體信號(hào)肽序列，與信號(hào)肽序列讀碼框正確接合后插入到植物表達(dá)載體PBI121上所獲得。本發(fā)明的植物表達(dá)載體pBI121-LTPCRBKT和pBI121_BHYBKT，是通過如下方法構(gòu)
建而得將番茄核酮糖羧化酶小亞基葉綠體導(dǎo)肽序列LTP插入到含有CRBKT的細(xì)菌表達(dá)載體pCRBKT得到載體pLTPCRKBT，再將LTP+CRBKT核苷酸片段酶切下來插入到植物表達(dá)載體PBI121 上得到表達(dá)載體 pBI121-LTPCRBKT ；將pBI121-LTPCRBKT 用 HPBHY 替代 CRBKT 片段得到 pBI121_LTPHPBHY，再將該載體上的CaMV35S: :SlTpHpBHY: :nos序列通過PCR擴(kuò)增和酶切后插入載體pBI121_LTPCRBKT上的ClaI位點(diǎn)上得到載體pBI121-BHYBKT。應(yīng)用本發(fā)明的植物表達(dá)載體PBI121-LTPCRBKT和pBI121_BHYBKT建立產(chǎn)蝦青素轉(zhuǎn)·基因植物的方法，包括構(gòu)建含有β-胡蘿卜素加氧酶B K T和β-胡蘿卜素羥化酶B H Y的植物表達(dá)載體PBI121-LTPCRBKT和ρΒΙ121_ΒΗΥΒΚΤ，然后用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法得到B KT和B HY在轉(zhuǎn)基因植株中表達(dá)并催化植物本身的類胡蘿卜素生成蝦青素的轉(zhuǎn)基因植株步驟。本發(fā)明上述的基因β-胡蘿卜素加氧酶B K T和β-胡蘿卜素羥化酶B H Y和重組載體PBI121-LTPCRBKT和ρΒΙ121_ΒΗΥΒΚΤ在制備重組宿主細(xì)胞中的應(yīng)用，所述的重組宿主細(xì)胞是由農(nóng)桿菌經(jīng)熱激法獲得所述重組載體所制得。本發(fā)明上述的基因β-胡蘿卜素加氧酶B K T和β-胡蘿卜素羥化酶B H Y和重組載體PB 1121-LTPCRBKT和ρΒ 1121-BHYBKT在制備轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞和轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用，所述的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞和轉(zhuǎn)基因植物是由農(nóng)桿菌介導(dǎo)的將權(quán)利要求4所述的重組宿主細(xì)胞中的重組載體PBI121-LTPCRBKT和ρΒΙ121_ΒΗΥΒΚΤ中的CRBKT或BHYBKT導(dǎo)入到植物細(xì)胞，再通過植物組織和器官發(fā)生途徑在抗生素卡那霉素選擇壓力下獲得高產(chǎn)蝦青素轉(zhuǎn)基因植株。本發(fā)明上述的基因β-胡蘿卜素加氧酶B K T和β-胡蘿卜素羥化酶B H Y以及重組載體PBI121-LTPCRBKT和ρΒΙ121_ΒΗΥΒΚΤ在利用轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)蝦青素中的應(yīng)用，包括構(gòu)建含有β-胡蘿卜素加氧酶BKT和β-胡蘿卜素羥化酶BHY的植物表達(dá)載體PBI121-LTPCRBKT和ρΒΙ121_ΒΗΥΒΚΤ，然后用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法得到轉(zhuǎn)基因植株，使B K T和B H Y在轉(zhuǎn)基因植株中表達(dá)并催化植物本身的類胡蘿卜素生成蝦青素步驟。用本發(fā)明上述的植物表達(dá)載體pBI121-LTPCRBKT和ρΒΙ121-ΒΗΥΒΚΤ轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞的方法所制備得到的重組宿主細(xì)胞。用本發(fā)明上述的植物表達(dá)載體ρΒ 1121-LTPCRBKT和ρΒ 1121-BHYBKT轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，培養(yǎng)轉(zhuǎn)基因植物的方法所制備獲得的產(chǎn)蝦青素的轉(zhuǎn)基因植物。本發(fā)明的重組宿主細(xì)胞在制備轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞和轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供了應(yīng)用本發(fā)明的植物表達(dá)載體pBI121-LTPCRBKT和ρΒΙ121_ΒΗΥΒΚΤ建立產(chǎn)蝦青素轉(zhuǎn)基因植物的方法獲取的轉(zhuǎn)基因植物作為提取蝦青素的原材料，及其在制備保健食品中、制備化妝品中、制備動(dòng)物養(yǎng)殖品中的應(yīng)用。


圖I細(xì)菌表達(dá)載體pCRBKT物理圖譜；圖2植物表達(dá)載體pBI121-LTPCRBKT的物理圖譜；圖3植物表達(dá)載體pBI121-BHYBKT的物理圖譜；圖4對(duì)照和產(chǎn)蝦青素番茄植株，花和果實(shí)；圖5產(chǎn)蝦青素番茄CRBKT和HPBHY表達(dá)的分子檢測。
具體實(shí)施例方式下文結(jié)合附圖，用本發(fā)明的下列實(shí)施例以更詳細(xì)的方式介紹本發(fā)明，但并不以此來限定本發(fā)明的技術(shù)方案。
實(shí)施例I :衣藻β-胡蘿卜素加氧酶的克隆，改造及在細(xì)菌表達(dá)體系分析(I)衣藻胡蘿卜素加氧酶的克隆衣藻 Chlamydomonas reinhardtii cc-124 由 Chamydomonas Center (DukeUniversity, USA)提供。衣藻用TAP培養(yǎng)液/基培養(yǎng)?？俁NA提取用TRI提取液(Molecularresearch center, Cincinnati, OH, USA),用大約IO8的衣藻細(xì)胞提取總RNA,方法參照說明書的步驟。cDNA 的合成米用 SuperScript III One-Step RT-PCR 系統(tǒng)(Invitrogen,Carlsbad, CA, USA)，在50°C下15分鐘合成cDNA。以衣藻cDNA為模板，用以下一對(duì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到胡蘿卜素加氧酶基因，經(jīng)測序確定無突變后，用HindIII和XbaI酶切得到片段連接到pBluescript II KS相應(yīng)酶切位點(diǎn)得到的載體產(chǎn)物為pCRBKTL。PCR引物如下(分別在上，下游引物設(shè)計(jì)HindIII和XbaI位點(diǎn))正向引物5’-GAGAAGCTTCATGGGCCCTGGGGATACA-3’反向引物5’ -GCGTCTAGATCAAGCCATCACGCCAAC-3’(2)衣藻β -胡蘿卜素加氧酶的改造(a)首先將克隆到的衣藻β_胡蘿卜素加氧酶去除C-末端即相對(duì)其他同源的加氧酶多余部分(編碼115氨基酸)，同樣用衣藻cDNA為模板，用以下引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到截短的β胡蘿卜素加氧酶基因，經(jīng)測序確定無突變，用HindIII和XbaI酶切得到片段連接到pBluescript II KS相應(yīng)酶切位點(diǎn)得到的載體產(chǎn)物為pCRBKTS。PCR引物如下(分別在上，下游引物設(shè)計(jì)HindIII和XbaI位點(diǎn))正向引物5’-GAGAAGCTTCATGGGCCCTGGGGATACA-3’反向引物5’-GCGTCTAGATCAGGCCAGGGCTGCGCCGCG-3’(b)以載體 pCRBKTS 為模板，用 GeneMorph II Random Mutagenesis kit(Stratagene, La Jolla, CA)進(jìn)行易錯(cuò)PCR (error prone PCR),方法步驟參照說明書，弓丨物用(a)中所述。反應(yīng)的條件能在每kb的DNA上產(chǎn)生0-4個(gè)堿基突變。產(chǎn)物用HindIII和XbaI酶切得到片段連接到pBluescript II KS相應(yīng)酶切位點(diǎn)。(3)衣藻胡蘿卜素加酮酶在細(xì)菌表達(dá)體系分析將(I)和(2 )得到的載體pCRBKTL，pCRBKTS和隨機(jī)突變得到的載體分別通過電擊轉(zhuǎn)化含有PACCAR25 Λ crtX載體的E. coli DH5a感受態(tài)細(xì)胞。含有pACCAR25 Δ crtX載體的細(xì)菌能積累玉米黃素(Misawa et al. , Journal ofBacteriology, 1990，177:6575-6584)作為加氧酶的底物。細(xì)菌培養(yǎng)條件參照Misawa等的方法(1990)。色素成分分析采用高效液相色譜(HPLC)，儀器設(shè)備采用Waters HPLC系統(tǒng)(Waters, Milford, MA, USA)裝備一根Waters Spherisorb 5 im 0DS2 4. 6 250 mm分析柱。方法采用Baroli (Plant Cell 15: 992-1008，2003)所述方法，改進(jìn)后如下從100%溶液 A[acetonitrile/methanol/0· I M Tris-HCl (pH 8. O), 84:2:14，v/v/v]遵循線形梯度到 100% 溶液 B (methanol/ethyl acetate, 68:32，v/v),流速為 I. 2mL min_l,維持 15分鐘，接著10分鐘溶液B。色素用標(biāo)準(zhǔn)色素樣品通過光吸收峰和出現(xiàn)時(shí)間確定，色素定量也采用標(biāo)準(zhǔn)色素樣品定量，所有標(biāo)準(zhǔn)色素樣品購于Sigma和Wako。實(shí)施例2 含衣藻胡蘿卜素加氧酶的植物表達(dá)載體構(gòu)建(I)載體之一 pBI121-LTPCRBKT 構(gòu)建來源于 pBI121-CRBKT (zhong et al,Journal of Experimental Botany 62:3659-69，2011 )。用番茄的 RBCS信號(hào)肽(NCBI 注冊(cè)號(hào)M15236)代替pBI121-CRBKT中的來源于Arabidopsis的RBCSl信號(hào)肽。以番茄總DNA 為模板擴(kuò)增番茄RBCS信號(hào)肽，用以下一對(duì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到番茄RBCS信號(hào)肽(LTP)，經(jīng)測序確定無突變，用SmaI和HindIII酶切得到片段連接到pBI121_CRBKT相應(yīng)酶切位點(diǎn)得到的載體產(chǎn)物為PBI121- LTPCRBKT。PCR引物如下(分別在上，下游引物設(shè)計(jì)SalI-SmaI和HindIII位點(diǎn))正向引物5’-GCGTCGACCCGGGGAACCAAAAAAAGAGAGAAG-3，反向引物5’-CCCAAGCTTGGCATGCAGCTAACTCTTCCAC-3’(2)載體之二 pBI121-BHYBKT 構(gòu)建來源于 pBI121- LTPCRBKT。首先將 pBI121-LTPCRBKT的CRBKT用HPBHY代替。以雨生紅球藻的cDNA為模板擴(kuò)增其BHY編碼序列，用以下一對(duì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到BHY經(jīng)測序確定無突變，用HindIII和XbaI酶切得到片段連接到PBI121-LTPCRBKT相應(yīng)酶切位點(diǎn)得到的載體產(chǎn)物為pBI121- LTPHPBHY。PCR引物如下(分別在上，下游引物設(shè)計(jì)HindIII和XbaI位點(diǎn))正向引物5’-GAGAAGCTTAATTACCACGATGCTG-3’反向引物5’-GCGTCTAGACATCTAGTAACATAGA-3’其次，以pBI121- LTPHPBHY 為模板擴(kuò)增 CaMV35S: : SlTpHpBHY: :nos 片段，用以下一對(duì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到CaMV35S: :SlTpHpBHY: :nos片段經(jīng)測序確定無突變，用ClaI酶切得到片段連接到PBI121-LTPCRBKT相應(yīng)酶切位點(diǎn)得到的載體產(chǎn)物為pBI 121- BHYBKT。PCR引物如下(分別在上，下游引物設(shè)計(jì)ClaI -HindIII和ClaI -EcoRI位點(diǎn))正向引物5’-CCATCGATAAGCTTGCATGCCTGC-3’反向引物5’-CCATCGATGAATTCCATCTAGTAACATAGA-3’實(shí)施例3 轉(zhuǎn)基因植物的構(gòu)建( I)制備含有植物表達(dá)載體的農(nóng)桿菌分別將2微升的實(shí)施例2制得的pBI121- CRBKT和pBI121_ BHYBKT質(zhì)粒添加到200微升實(shí)施例I獲得的感受態(tài)細(xì)胞，輕輕混勻，在冰上放置30分鐘。然后將細(xì)菌懸浮液在42°C水浴中熱激60秒，迅速移至冰上放置5分鐘冷卻。分別在細(xì)菌懸浮液中加入800微升LB液體培養(yǎng)基，于28V復(fù)蘇3小時(shí)。取適量細(xì)菌懸浮液涂布于含有50 mg/L鏈霉素和50mg/L卡那霉素的LB板上，將板置于28°C溫浴2天。從平板上挑取單菌落，經(jīng)PCR鑒定和擴(kuò)大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒酶切鑒定。將含有相應(yīng)的質(zhì)粒的農(nóng)桿菌進(jìn)行植物轉(zhuǎn)化。首先將100微升農(nóng)桿菌培養(yǎng)液接入3 ml LB液體培養(yǎng)液含有50mg/L鏈霉素和50mg/L卡那霉素，培養(yǎng)48小時(shí)。將培養(yǎng)物離心回收，丟棄上清液，將菌體沉淀物重懸于3 ml MS培養(yǎng)基(MS培養(yǎng)基補(bǔ)加1% 蔗糖，0.2 mg/L 2，4-D, O. I mg/L IAA, 100 mg/L AS，pH 5. 8)得到農(nóng)桿菌懸浮液。(2)番茄子葉外植體制備番爺(SolanumIycopersicum)種子(B-type LA0316)由 Tomato GeneticsResource Center (TGRC)提供。經(jīng)表面消毒后在MS固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)14天，待子葉長出。將子葉剪下在MS預(yù)培養(yǎng)基板(MS培養(yǎng)基補(bǔ)加O. 8%瓊脂，1%蔗糖，2 mg/L玉米素，0.1mg/ L IAA, 100 mg/L AS, pH 5. 8)培養(yǎng)I天。將預(yù)培養(yǎng)后的子葉外植體浸泡于第(I)步驟得到的農(nóng)桿菌懸浮液中10分鐘,將浸泡后的外植體放于MS共培養(yǎng)板(MS培養(yǎng)基補(bǔ)加O. 8%瓊脂，1% 鹿糖，2 mg/L 玉米素，O. I mg/L IAA, 100 mg/L AS, 300mg/L 羧節(jié)青霉素，100 mg/L鏈霉素和50mg/L卡那霉素pH 5. 8)于28°C無光照培養(yǎng)一天后移至光下于24°C培養(yǎng)一天。共培養(yǎng)后的外植體經(jīng)水清洗后，轉(zhuǎn)移至愈傷組織形成培養(yǎng)基(MS培養(yǎng)基補(bǔ)加O. 8%瓊脂，1%鹿糖，2 mg/L玉米素，O. 05mg/L IAA, 300mg/L羧節(jié)青霉素和100mg/L卡那霉素，pH 5.8)于241培養(yǎng)。一個(gè)月后將愈傷組織轉(zhuǎn)移到出芽培養(yǎng)基(MS培養(yǎng)基補(bǔ)加0.8%瓊月旨，1%鹿糖，I mg/L玉米素，0. 03mg/L IAA, 200mg/L羧節(jié)青霉素和100mg/L卡那霉素，pH 5. 8)至長出棕紅色的芽。待芽長出兩片葉子，將芽剪下轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基(MS培養(yǎng)基補(bǔ)加0. 8%瓊脂，1%蔗糖，0. I mg/LIBA,和100mg/L卡那霉素，pH 5. 8)，約1-2周后長出不定根。待根系發(fā)達(dá)后將植株取出，移入栽培土中，在溫室中(24°C，16小時(shí)光照/8小時(shí)黑暗)培養(yǎng)。實(shí)施例4:轉(zhuǎn)基因植物的鑒定及蝦青素含量的測定(I)轉(zhuǎn)基因植物鑒定由于蝦青素是一種紅色的色素。它在植物器官中合成將改變?cè)瓉碇参锲鞴俚念伾?。因此轉(zhuǎn)基因植株的篩選開始于愈傷組織上生長的芽，選擇有顏色變化的芽進(jìn)行生根培養(yǎng)。大約每個(gè)載體轉(zhuǎn)化植物產(chǎn)生20株轉(zhuǎn)植物，其器官(包括芽，葉片，莖，花和果實(shí))顏色與未轉(zhuǎn)基因植物有差異。(2)轉(zhuǎn)基因植物的蝦青素含量測定植物通常不能合成蝦青素。HPLC測定轉(zhuǎn)基因植物的蝦青素含量以得到高效合成蝦青素的轉(zhuǎn)基因植物，方法同細(xì)菌色素測定。經(jīng)測定每個(gè)載體轉(zhuǎn)化植物體系得到一株蝦青素含量最高的轉(zhuǎn)基因植物，PBI121-LTPCRBKT的轉(zhuǎn)基因植物命名為TB-bl0，pBI 121-BHYBKT的轉(zhuǎn)基因植物命名為TB-bb8，植物性狀分析見圖4。成熟果實(shí)的色素成分分析見表I。表I 番茄類胡蘿卜素含量和百分比
權(quán)利要求
1.植物表達(dá)載體PBI121-LTPCRBKT和PBI121-BHYBKT，通過來自衣藻的β-胡蘿卜素加氧酶BKT和來自雨生紅球藻的β-胡蘿卜素羥化酶BHY基因連接到有引導(dǎo)基因產(chǎn)物定位的植物葉綠體信號(hào)肽序列，與信號(hào)肽序列讀碼框正確接合后插入到植物表達(dá)載體ΡΒΙ121上所獲得。
2.如權(quán)利要求I所述的植物表達(dá)載體pBI121-LTPCRBKT和pBI121-BHYBKT，其特征是通過如下方法構(gòu)建而得 將番茄核酮糖羧化酶小亞基葉綠體導(dǎo)肽序列LTP插入到含有CRBKT的細(xì)菌表達(dá)載體PCRBKT得到載體pLTPCRKBT，再將LTP+CRBKT核苷酸片段酶切下來插入到植物表達(dá)載體PBI121 上得到表達(dá)載體 pBI121-LTPCRBKT ； 將pBI121-LTPCRBKT用HPBHY替代CRBKT片段得到pBI121_LTPHPBHY，再將該載體上的CaMV35S: :SlTpHpBHY: :nos序列通過PCR擴(kuò)增和酶切后插入載體pBI121_LTPCRBKT上的ClaI位點(diǎn)上得到載體pBI 121-BHYBKT。
3.應(yīng)用權(quán)利要求I或2所述的植物表達(dá)載體pBI121-LTPCRBKT和pBI121-BHYBKT建立產(chǎn)蝦青素轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括構(gòu)建含有胡蘿卜素加氧酶B K T和β-胡蘿卜素羥化酶B H Y的植物表達(dá)載體pBI121-LTPCRBKT和ρΒΙ121_ΒΗΥΒΚΤ，然后用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法得到B K T和B HY在轉(zhuǎn)基因植株中表達(dá)并催化植物本身的類胡蘿卜素生成蝦青素的轉(zhuǎn)基因植株步驟。
4.權(quán)利要求I所述的基因胡蘿卜素加氧酶BK T和β-胡蘿卜素羥化酶B H Y和重組載體PBI121-LTPCRBKT和ρΒΙ121_ΒΗΥΒΚΤ在制備重組宿主細(xì)胞中的應(yīng)用，其特征在于所述的重組宿主細(xì)胞是由農(nóng)桿菌經(jīng)熱激法獲得所述重組載體所制得。
5.權(quán)利要求I所述的基因β-胡蘿卜素加氧酶BK T和β-胡蘿卜素羥化酶B H Y和重組載體PBI121-LTPCRBKT和ρΒΙ121_ΒΗΥΒΚΤ在制備轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞和轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用，其特征在于所述的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞和轉(zhuǎn)基因植物是由農(nóng)桿菌介導(dǎo)的將權(quán)利要求4所述的重組宿主細(xì)胞中的重組載體pBI 121-LTPCRBKT和pBI 121-BHYBKT中的CRBKT或BHYBKT導(dǎo)入到植物細(xì)胞，再通過植物組織和器官發(fā)生途徑在抗生素卡那霉素選擇壓力下獲得高產(chǎn)蝦青素轉(zhuǎn)基因植株。
6.權(quán)利要求I或2所述的基因β-胡蘿卜素加氧酶BK T和β-胡蘿卜素羥化酶B HY以及重組載體PBI121-LTPCRBKT和ρΒΙ121_ΒΗΥΒΚΤ在利用轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)蝦青素中的應(yīng)用，包括構(gòu)建含有β-胡蘿卜素加氧酶B K T和β-胡蘿卜素羥化酶BHY的植物表達(dá)載體PBI121-LTPCRBKT和ρΒΙ121_ΒΗΥΒΚΤ，然后用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法得到轉(zhuǎn)基因植株，使B KT和B H Y在轉(zhuǎn)基因植株中表達(dá)并催化植物本身的類胡蘿卜素生成蝦青素步驟。
7.用權(quán)利要求4所述的植物表達(dá)載體pBI121-LTPCRBKT和ρΒΙ121-ΒΗΥΒΚΤ轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞的方法所制備得到的重組宿主細(xì)胞。
8.用權(quán)利要求3所述的植物表達(dá)載體pBI121-LTPCRBKT和ρΒΙ121_ΒΗΥΒΚΤ轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，培養(yǎng)轉(zhuǎn)基因植物的方法所制備獲得的產(chǎn)蝦青素的轉(zhuǎn)基因植物。
9.權(quán)利要求5所述的重組宿主細(xì)胞在制備轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞和轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。
10.由權(quán)利要求3的方法獲取的轉(zhuǎn)基因植物作為提取蝦青素的原材料。
11.由權(quán)利要求3的方法獲取的轉(zhuǎn)基因植物在制備保健食品中的應(yīng)用。
12.由權(quán)利要求3的方法獲取的轉(zhuǎn)基因植物在制備化妝品中的應(yīng)用。
13.由權(quán)利要求3的方法獲取的轉(zhuǎn)基因植物在制備動(dòng)物養(yǎng)殖品中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了植物表達(dá)載體pBI121-LTPCRBKT和pBI121-BHYBKT，及用該載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，培養(yǎng)出轉(zhuǎn)基因植物高效生產(chǎn)蝦青素的方法。該方法以轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞、組織或器官作為反應(yīng)器，高效率、低成本生產(chǎn)蝦青素。用本發(fā)明方法得到的蝦青素轉(zhuǎn)基因植物可作為提取蝦青素的原材料或直接作為添加劑用于健康保健食品、化妝品和動(dòng)物養(yǎng)殖等行業(yè)。
文檔編號(hào)C12N15/66GK102888425SQ20121022329
公開日2013年1月23日 申請(qǐng)日期2012年7月2日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月2日
發(fā)明者黃俊潮, 鐘玉娟, 姜悅 申請(qǐng)人:中國科學(xué)院昆明植物研究所, 潤科生物工程(福建)有限公司