植物耐逆性相關(guān)蛋白TaBRI及其編碼基因和應(yīng)用的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種植物耐逆性相關(guān)蛋白TaBRI及其編碼基因和應(yīng)用。本發(fā)明提供的蛋白質(zhì)，是如下（a）或（b）：（a）由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；（b）將序列1的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物耐逆性相關(guān)的由序列1衍生的蛋白質(zhì)。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)的基因TaBRI在低溫、高鹽和高溫的誘導(dǎo)下表達(dá)，且將TaBRI基因?qū)霐M南芥中得到的轉(zhuǎn)基因擬南芥，其對(duì)以上三種逆境的抗性高于野生型擬南芥，本發(fā)明提供的蛋白和基因?yàn)槿藶榭刂瓶鼓婧湍湍嫦嚓P(guān)基因的表達(dá)提供了基礎(chǔ)，將在培育抗逆性和耐逆性增強(qiáng)的植物中發(fā)揮重要的作用。
【專(zhuān)利說(shuō)明】植物耐逆性相關(guān)蛋白TaBRI及其編碼基因和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及一種植物耐逆性相關(guān)蛋白TaBRI及其編碼基因和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]干旱、高鹽及低溫等逆境脅迫是影響小麥生長(zhǎng)、發(fā)育的障礙因子。因此，了解小麥對(duì)逆境條件的應(yīng)答與信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制，提高小麥品種的抗逆性，成為小麥遺傳研究及小麥品種改良的重要任務(wù)之一。
[0003]在逆境脅迫下植物體內(nèi)會(huì)產(chǎn)生一系列應(yīng)答反應(yīng)，伴隨著許多生理生化及發(fā)育上的變化。明確植物對(duì)逆境的反應(yīng)機(jī)制，將為抗逆基因工程研究和應(yīng)用提供科學(xué)論據(jù)。目前，植物抗逆性研究已逐漸深入到細(xì)胞、分子水平，并與遺傳學(xué)和遺傳工程研究相結(jié)合，探索用生物技術(shù)來(lái)改進(jìn)植物生長(zhǎng)特性，其目的是提高植物對(duì)逆境的適應(yīng)能力。
[0004]在干旱、高鹽和低溫等環(huán)境脅迫的逆境條件下，植物能夠在分子、細(xì)胞和整體水平上做出相應(yīng)的調(diào)整，以最大程度上減少環(huán)境所造成的傷害并得以生存。許多基因受脅迫誘導(dǎo)表達(dá)，這些基因的產(chǎn)物不僅能夠直接參與植物的脅迫應(yīng)答，而且能夠調(diào)節(jié)其它相關(guān)基因的表達(dá)或參與信號(hào)傳導(dǎo)途徑，從而使植物避免或減少傷害，增強(qiáng)對(duì)脅迫環(huán)境的抗性。與脅迫相關(guān)的基因產(chǎn)物可以分為兩大類(lèi):第一類(lèi)基因編碼的產(chǎn)物包括離子通道蛋白、水通道蛋白、滲透調(diào)節(jié)因子(蔗糖、脯氨酸和甜菜堿等)合成酶等直接參與植物脅迫應(yīng)答的基因產(chǎn)物;第二類(lèi)基因編碼的產(chǎn)物包括參與脅迫相關(guān)的信號(hào)傳遞和基因表達(dá)調(diào)節(jié)的蛋白因子，如蛋白激酶、轉(zhuǎn)錄因子等。其中，蛋白激酶在植物脅迫信號(hào)的感知、傳遞的調(diào)控中起著重要作用。
[0005]到目前為止，已發(fā)現(xiàn)的蛋白激酶約有300種左右，分子內(nèi)都存在一個(gè)同源的由約270氨基酸殘基構(gòu)成的催化結(jié)構(gòu)區(qū)。在細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞周期調(diào)控等系統(tǒng)中，蛋白激酶形成了縱橫交錯(cuò)的網(wǎng)絡(luò)。這類(lèi)酶催化從ATP轉(zhuǎn)移出磷酸并共價(jià)結(jié)合到特定蛋白質(zhì)分子中某些絲氨酸、蘇氨酸或酪氨酸殘基的羥基上，從而改變蛋白質(zhì)、酶的構(gòu)象和活性。
[0006]目前，在植物中已知的與脅迫相關(guān)的蛋白激酶主要有:絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶如 MAPK (mitogen-activated protein kinase), CDPK (calcium-dependent proteinkinase);酪氨酸蛋白激酶如Src家族、Tec家族、ZAP70、家族、JAK家族；還有一種絲氨酸/蘇氨酸/酪氨酸雙特異性蛋白激酶，如DYRK相關(guān)的蛋白激酶，CDC25等。這三類(lèi)蛋白激酶均有文獻(xiàn)報(bào)道參與植物相應(yīng)外界環(huán)境脅迫的信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程，提高植物對(duì)外界逆境的適應(yīng)能力。
[0007]根據(jù)蛋白激酶的磷酸化氨基酸殘基的種類(lèi)，蛋白激酶可以分為Ser/Thr蛋白激酶，Tyr蛋白激酶以及雙特異性Ser/Thr/Tyr蛋白激酶。Ser/Thr蛋白激酶主要包括MAPK，CDPK，JNK等。這種類(lèi)型的蛋白激酶目前研究的較多，并且在信號(hào)傳導(dǎo)途徑中起重要作用。而酪氨酸蛋白激酶分為兩類(lèi)，一類(lèi)是非受體型酪氨酸蛋白激酶，以src基因產(chǎn)物為代表，此外還有Yes、Fyn、Lck、Fgr、Lyn、Fps/Fes及Abl等；另一類(lèi)是受體型酪氨酸蛋白激酶,根據(jù)它們的結(jié)構(gòu)不同，受體型酪氨酸激酶可以分為9種類(lèi)型。在動(dòng)物細(xì)胞中，酪氨酸蛋白激酶往往參與程序性細(xì)胞死亡、癌變等重要細(xì)胞行為。植物中酪氨酸蛋白激酶研究較晚。Maya Mayrose等人的工作表明，西紅柿中的雙特異性激酶LeMPK3能夠提高植物對(duì)病原體的抵抗。文獻(xiàn)提出，在受到病原體的侵害后，LeMPK3激酶的活性首先提高，然后LeMPK3的mRNA的表達(dá)量也短暫的提高。2002年，Parvathi Rudrabhatla等人從花生cDNA文庫(kù)中得到一個(gè)雙特異性蛋白激酶，具有絲氨酸/蘇氨酸/酪氨酸蛋白激酶活性。并且發(fā)現(xiàn)，該激酶的mRNA表達(dá)水平以及激酶活性受到低溫和高鹽脅迫的誘導(dǎo)。但是其蛋白表達(dá)水平卻沒(méi)有明顯的變化。在250mM濃度的NaCl處理24h下，STY的mRNA表達(dá)水平提高了 20倍，在4°C條件下處理24h，其mRNA表達(dá)水平提高了 50倍左右。在IOOmMABA處理下，STY表達(dá)量沒(méi)有變化。
[0008]目前，在許多植物中都發(fā)現(xiàn)蛋白激酶參與抗病，抗逆境等信號(hào)傳遞過(guò)程(ParvathiRudrabhatla, 2002 ；Lizhong Xiong, 2003)。Parvathi Rudrabhatla 等認(rèn)為，花生中的一種STY激酶參與了花生對(duì)非生物脅迫的起始相應(yīng)，證明了一種非MAPK途徑的蛋白激酶級(jí)聯(lián)信號(hào)傳遞過(guò)程在非生物脅迫中起重要作用。Lizhong Xiong等人認(rèn)為,水稻蛋白激酶0sMAPK5能夠提高水稻對(duì)低溫，干旱，高鹽以及病害等的抗性。而Jen Sheen認(rèn)為，鈣離子依賴(lài)的蛋白激酶⑶PK (⑶PKl and⑶PKla)能夠激活與植物抗逆境相關(guān)基因的啟動(dòng)子，參與植物逆境信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程。Riichiro Yoshida等報(bào)道，在擬南芥中ABA誘導(dǎo)的蛋白激酶SnRK2在植物響應(yīng)脫水脅迫的信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程中起到重要的作用。由于植物的逆境耐性是由多基因調(diào)控的復(fù)雜性狀，依靠導(dǎo)入單個(gè)功能性蛋白基因很難實(shí)現(xiàn)植物抗逆性的綜合提高。因此，利用一個(gè)關(guān)鍵性轉(zhuǎn)錄因子促進(jìn)多個(gè)功能基因的表達(dá)，從而增強(qiáng)植物的抗逆性，已經(jīng)成為植物抗逆基因工程的研究熱點(diǎn)。
[0009]綜合目前的研究結(jié)果，蛋白激酶在植物響應(yīng)逆境脅迫的信號(hào)傳導(dǎo)途徑中占有重要的地位。蛋白激酶通過(guò)自身的磷酸化提高或者降低自身的激酶活性，通過(guò)磷酸化底物提高或者降低底物蛋白的酶活性，然后底物蛋白又調(diào)控下游基因的酶活，形成一個(gè)級(jí)聯(lián)調(diào)控途徑。如RAS信號(hào)調(diào)控途徑，在細(xì)胞受體酪氨酸蛋白激酶感受到配體的信號(hào)后，形成二聚體并發(fā)生自身磷酸化，激活RAS，然 后由活化的RAS激活引起蛋白激酶的級(jí)聯(lián)反應(yīng)。這種級(jí)聯(lián)調(diào)控是一種很精密很復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，蛋白激酶可能在上游作為一種開(kāi)關(guān)在行使其功能。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010]本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種植物耐逆性相關(guān)蛋白TaBRI及其編碼基因。
[0011]本發(fā)明提供的一種蛋白，來(lái)源于小麥屬小麥(Triticum aestivum L.),是如下(a)或(b):
[0012](a)由序列表中序列I所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；
[0013](b)將序列I的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物耐逆性相關(guān)的由序列I衍生的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)。
[0014]上述蛋白中，一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加為不超過(guò)10個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加。
[0015]上述序列表中序列I的氨基酸殘基序列由1124個(gè)氨基酸殘基組成。
[0016]編碼上述蛋白的基因也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。
[0017]上述基因?yàn)槿缦翴) -3)中任一一種的DNA分子:
[0018]I)序列表中序列2所示的DNA分子；[0019]2)在嚴(yán)格條件下與I)限定的DNA序列雜交且編碼與植物耐逆性相關(guān)蛋白的DNA分子;
[0020]3)與I)限定的DNA序列具有90%以上同源性，且編碼與植物耐逆性相關(guān)蛋白的DNA分子。
[0021]上述嚴(yán)格條件為在6XSSC，0.5%SDS的溶液中，在65 °C下雜交，然后用
2X SSC, 0.1%SDS 和 I X SSC, 0.1%SDS 各洗膜一次。
[0022]上述序列2由3375個(gè)核苷酸組成，開(kāi)放閱讀框架為自5'端第I至3375位。
[0023]含有上述基因的重組表達(dá)載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。
[0024]上述重組表達(dá)載體為將上述基因插入PBI121中得到的重組載體，具體為將序列表的序列2所示的DNA片段插入pBI121的SmaI和SpeI酶切識(shí)別位點(diǎn)之間得到的重組質(zhì)粒。
[0025]擴(kuò)增上述基因的全長(zhǎng)或其任意片段的引物對(duì)也是本發(fā)明保護(hù)的范圍，上述引物對(duì)由序列表中序列3所示的DNA分子和序列表中序列4所示的DNA分子組成。
[0026]上述的蛋白或上述基因或上述的重組表達(dá)載體在調(diào)控植物耐逆性中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。
[0027]上述應(yīng)用中，所述調(diào)控植物耐逆性具體為提高植物耐逆性；所述耐逆具體為耐干旱、耐鹽、耐高溫和/或耐低溫。
[0028]本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種培育轉(zhuǎn)基因植物的方法。
[0029]本發(fā)明提供的方法，是將上述基因?qū)肽康闹参镏?，得到轉(zhuǎn)基因植物；所述轉(zhuǎn)基因植物耐逆性高于所述目的植物。
[0030]上述基因通過(guò)上述重組表達(dá)載體導(dǎo)入所述目的植物中。
[0031]上述方法中，所述耐逆具體為耐干旱、耐鹽、耐高溫和/或耐低溫。
[0032]上述方法中，所述高溫為42度，所述低溫為3度；
[0033]所述目的植物為雙子葉植物或單子葉植物，所述雙子葉植物具體為擬南芥。
[0034]上述耐干旱體現(xiàn)在提高萌發(fā)率、根長(zhǎng)和/或株高；
[0035]上述耐高溫體現(xiàn)在提高萌發(fā)率、根長(zhǎng)和/或株高；
[0036]上述耐低溫體現(xiàn)在提高萌發(fā)率和/或根長(zhǎng)；
[0037]上述耐鹽體現(xiàn)在提高萌發(fā)率、根長(zhǎng)和/或株高。
[0038]本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)的基因TaBRI在低溫、干旱、高鹽和高溫的誘導(dǎo)下表達(dá)，且將TaBRI基因?qū)霐M南芥中得到的轉(zhuǎn)基因擬南芥，其對(duì)以上四種逆境的抗性高于野生型擬南芥，本發(fā)明提供的蛋白和基因?yàn)槿藶榭刂瓶鼓婧湍湍嫦嚓P(guān)基因的表達(dá)提供了基礎(chǔ)，將在培育抗逆性和耐逆性增強(qiáng)的植物中發(fā)揮重要的作用。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0039]圖1為轉(zhuǎn)基因擬南芥干旱脅迫處理萌發(fā)、根長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)及后期生長(zhǎng)的結(jié)果
[0040]圖2為轉(zhuǎn)基因擬南芥高溫脅迫處理萌發(fā)、根長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)及后期生長(zhǎng)的結(jié)果
[0041]圖3為轉(zhuǎn)基因擬南芥低溫脅迫處理萌發(fā)和根長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0042]圖4為轉(zhuǎn)基因擬南芥鹽脅迫處理萌發(fā)、根長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)及后期生長(zhǎng)的結(jié)果【具體實(shí)施方式】
[0043]下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。
[0044]下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0045]下述實(shí)施例中的％，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為質(zhì)量百分含量。
[0046]實(shí)施例1、TaBRI的克隆
[0047]一、TaBRI 的克隆
[0048]將水培生長(zhǎng)10天左右的普通小麥(Triticum aestivum L.)品種小白麥(Triticum aestivum cv.Xiaobaimai,公眾可從中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所獲得，公眾也可從國(guó)家種質(zhì)資源庫(kù)獲得(編號(hào)為ZM242);提及小白麥的文獻(xiàn)為:孫海桃等，小麥TaDREB6轉(zhuǎn)錄因子互作蛋白的篩選，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，44 (22):4740-4747.;提及小白麥的文獻(xiàn)為:Isolation and molecular characterization of the Triticumaestivum L.ethylene-responsive factor I (TaERF I)that increases multiple stresstolerance, Plant Mol Biol (2007)65:719-732，Zhao Shi Xu, Lan Qin Xia, Ming Chen, XianGuo Cheng, Rui Yue Zhang, Lian Cheng Li, Yun Xing Zhao, Yan Lu, Zhi Yong Ni, LiLiu, Zhi Gang Qiu, You Zhi Ma)三葉期幼苗NaCl處理2小時(shí)，用液氮速凍，-80°C保存?zhèn)溆谩?br> [0049]采用Trizol法(TianGen)提取小白麥葉片總RNA,第一鏈cDNA合成用反轉(zhuǎn)錄酶XL(AMV)。采用SMART法合 成ds cDNA, PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。
[0050]通過(guò)5’ RACE和3’ RACE的方法獲得序列表中的序列2。
[0051]該序列表中序列2所示的基因命名為T(mén)aBRI基因，其開(kāi)放閱讀框架為自序列表的序列2的5'端第1-3375位核苷酸，將該基因編碼的蛋白命名為T(mén)aBRI蛋白，該蛋白的氨基酸序列為序列表中的序列1，由1124個(gè)氨基酸殘基組成。
[0052]上述序列2也可以通過(guò)人工合成。
[0053]實(shí)施例2、TaBRI對(duì)植物耐逆性的影響
[0054]一、重組表達(dá)載體的構(gòu)建
[0055]UTaBRI基因的克隆
[0056]根據(jù)TaBRI基因的序列設(shè)計(jì)引物對(duì)(TaBRI_121F和TaBRI_121R)，引物末端分別引A SmaI和SpeI酶切識(shí)別位點(diǎn)，
[0057]TaBR1-121F:5，-TGTCCCGGGTACATGGATTCCCTGCGGCT-3’ (序列 3)；
[0058]TaBR1-121R:5，-TAAAS1MICTAATCTTTCTCCTCCTTGGCTTCCT-3’(序列 4)。
[0059]提取小白麥葉片總RNA，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA為模板，用上述引物進(jìn)行擴(kuò)增，得到的PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.2%瓊脂糖凝膠電泳，其大小為3.4Kb。將該P(yáng)CR產(chǎn)物送去測(cè)序，該P(yáng)CR產(chǎn)物具有序列表中序列2所示核苷酸，即為T(mén)aBRI基因。
[0060]米用Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0 (TaKaRa 公司，CodeN0.:DV807A)回收純化3.4Kb大小的PCR產(chǎn)物。
[0061]2、重組表達(dá)載體的構(gòu)建
[0062]①用限制性?xún)?nèi)切酶SmaI和SpeI (Promega，R6121，R6591)酶切步驟I回收純化的PCR產(chǎn)物，回收酶切產(chǎn)物；[0063]②用限制性?xún)?nèi)切酶SmaI和SpeI酶切植物真核表達(dá)載體pBI121 (購(gòu)自Clontech公司)，回收載體骨架；
[0064]③將步驟①的酶切產(chǎn)物和步驟②的載體骨架連接，得到連接產(chǎn)物；
[0065]④將步驟③的連接產(chǎn)物電擊轉(zhuǎn)化TOPlO菌株(Tiangen，CB104-03)，37°C過(guò)夜培養(yǎng)，挑取陽(yáng)性克隆提取質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序。
[0066]測(cè)序結(jié)果表明，該質(zhì)粒為將序列表中的序列2所示的DNA片段插入pBI121載體的SmaI和SpeI酶切位點(diǎn)間得到的載體，將該質(zhì)粒命名為pBI121_TaBRI。
[0067]二、轉(zhuǎn)基因植物的獲得
[0068]1、用上述重組質(zhì)粒pBI121_TaBRI轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌C58 (購(gòu)自北京拜爾迪生物技術(shù)公司)，得到重組農(nóng)桿菌。
[0069]提取重組農(nóng)桿菌的質(zhì)粒送去測(cè)序，結(jié)果該質(zhì)粒為pBI121_TaBRI，證明該重組菌為陽(yáng)性重組農(nóng)桿菌，將其命名為C58/pBI121-TaBRI。
[0070]2、將重組農(nóng)桿菌C58/pB1121-TaBRI接種于YEP液體培養(yǎng)基中，28 °C、3000rpm培養(yǎng)約30小時(shí)；
[0071]3、將步驟2的菌液轉(zhuǎn)至YEP液體培養(yǎng)基(含50 u g/ml利福平)中，28°C、300rpm培養(yǎng)約14小時(shí)(菌液0D600達(dá)到1.5-3.0)；
[0072]4、收集菌體，4°C、4000g 離心 IOmin,用 10% 鹿糖(含 0.02%silwet)稀釋至 0D600約為1.0 ；
[0073]5、將擬南芥哥倫比亞生 態(tài)型Col-O(美國(guó)擬南芥信息資源網(wǎng)，以下簡(jiǎn)稱(chēng)為野生型擬南芥，購(gòu)自SALK公司)整株與花盆一起倒扣在盛有步驟4的菌液的容器中，使花浸泡50s左右，浸泡完畢后，取出花盆，側(cè)放于托盤(pán)中，蓋上黑色塑料布，24hr后揭開(kāi)塑料布，直立放置花盆，進(jìn)行正常的光照培養(yǎng)，混收Ttl代轉(zhuǎn)TaBRI擬南芥種子。將Ttl代轉(zhuǎn)TaBRI擬南芥種子播種到含有50mg/ml卡那霉素的MS培養(yǎng)基上后得到4株T1代轉(zhuǎn)TaBRI擬南芥幼苗。
[0074]采用同樣的方法將空載體pBI 121轉(zhuǎn)入野生型擬南芥，得到T1代轉(zhuǎn)空載體擬南芥。
[0075]分別將T1代轉(zhuǎn)TaBRI擬南芥和T1代轉(zhuǎn)空載體擬南芥播種、自交，直到得到T3代轉(zhuǎn)TaBRI擬南芥和T3代轉(zhuǎn)空載體擬南芥。
[0076]提取T3代轉(zhuǎn)TaBRI擬南芥植株的DNA，以TaBRI_121F和TaBRI_121R為引物進(jìn)行PCR檢測(cè)，得到條帶為3.4Kb的陽(yáng)性T3代轉(zhuǎn)TaBRI擬南芥植株。
[0077]提取T3代轉(zhuǎn)空載體擬南芥的基因組DNA，用TaBRI_121F和TaBRI_121R為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，沒(méi)有得到3.4Kb的目的片段，說(shuō)明T3代轉(zhuǎn)空載體擬南芥構(gòu)建成功。
[0078]三、轉(zhuǎn)基因植物的耐逆性鑒定
[0079]1、干旱逆境脅迫處理鑒定實(shí)驗(yàn)
[0080]分別將編號(hào)為BRI的陽(yáng)性T3代轉(zhuǎn)TaBRI擬南芥種子、T3代轉(zhuǎn)空載體擬南芥種子和野生型擬南芥種子(WT)播種在分別含有2% (質(zhì)量體積比)PEG和4% (質(zhì)量體積比)PEG的MS培養(yǎng)基中，然后移植盆栽培養(yǎng)，各取50個(gè)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，結(jié)果取平均值。
[0081]在播種后第10天觀察MS培養(yǎng)基上的萌發(fā)結(jié)果如圖1A所示，可以看出，T3代轉(zhuǎn)TaBRI擬南芥(BRI)種子和野生型擬南芥種子(WT)在含2%和4%PEG的MS培養(yǎng)基中的萌發(fā)率均有所下降，但轉(zhuǎn)基因擬南芥仍表現(xiàn)一定的優(yōu)勢(shì)。統(tǒng)計(jì)萌發(fā)率，結(jié)果如圖1B所示，
[0082]T3代轉(zhuǎn)TaBRI擬南芥(BRI)種子在含有2%PEG和4%PEG的MS培養(yǎng)基的萌發(fā)率分別為76%和68% ；
[0083]野生型擬南芥(WT)種子在含有2%PEG和4%PEG的MS培養(yǎng)基的萌發(fā)率分別為74%和 54% ；
[0084]在播種后第15天統(tǒng)計(jì)根長(zhǎng)(以主根長(zhǎng)記)，結(jié)果如圖1C所示，
[0085]T3代轉(zhuǎn)TaBRI擬南芥(BRI)種子在含有2%PEG和4%PEG的MS培養(yǎng)基的主根長(zhǎng)分別為25cm和18cm ；
[0086]野生型擬南芥(WT)種子在含有2%PEG和4%PEG的MS培養(yǎng)基的主根長(zhǎng)分別為17cm和 13cm ；
[0087]在播種后第25天觀察和統(tǒng)計(jì)株高，結(jié)果如圖1D和IE所示，
[0088]T3代轉(zhuǎn)TaBRI擬南芥(BRI)種子在含有2%PEG和4%PEG的MS培養(yǎng)基的株高分別為 18cm 和 15cm ；
[0089]野生型擬南芥(WT)種子在含有2%PEG和4%PEG的MS培養(yǎng)基的株高分別為IOcm和 7 cm ;
[0090]結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因株系在2個(gè)不同PFG濃度處理下萌發(fā)率均高于野生型，2%PEG濃度處理時(shí)差異不明顯，而4%PEG濃度處理時(shí)差異明顯，轉(zhuǎn)基因擬南芥萌發(fā)率為68%，而野生型擬南芥僅為54%。測(cè)量根長(zhǎng)結(jié)果比較，2個(gè)不同濃度處理下轉(zhuǎn)基因植株均為野生型植株的
1.4倍以上。后期的生長(zhǎng)轉(zhuǎn)基因植株也優(yōu)于野生型，且測(cè)量株高結(jié)果比較，轉(zhuǎn)基因植株為野生型植株的1.8倍以上。
[0091 ] 2、高溫逆境脅迫種子萌發(fā)實(shí)驗(yàn)
[0092]分別將T3代轉(zhuǎn)TaBRI擬南芥(BRI)種子和野生型擬南芥種子(WT)經(jīng)42度高溫處理Oh、lh、2h和4h，再種在普通MS培養(yǎng)基上，然后移植盆栽培養(yǎng)，各取50個(gè)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，結(jié)果取平均值。
[0093]在播種后第10天觀察普通MS培養(yǎng)基上的萌發(fā)結(jié)果如圖2A所示，可以看出，T3R轉(zhuǎn)TaBRI擬南芥(BRI)種子和野生型擬南芥種子(WT)隨著處理時(shí)間的加長(zhǎng)，萌發(fā)率均有所下降，但轉(zhuǎn)基因株系仍表現(xiàn)一定的優(yōu)勢(shì)。統(tǒng)計(jì)萌發(fā)率如圖2B所示，T3代轉(zhuǎn)TaBRI擬南芥(BRI)種子經(jīng)42度高溫處理0h、lh、2h和4h的萌發(fā)率分別為60%、68%、65%和60% ；
[0094]野生型擬南芥種子(WT)種子經(jīng)42度高溫處理0h、lh、2h和4h的萌發(fā)率分別為50%、50%、48%和 30% ；
[0095]在播種后第15天觀察和統(tǒng)計(jì)主根長(zhǎng)，結(jié)果如圖2C和2D所示，
[0096]T3代轉(zhuǎn)TaBRI擬南芥(BRI)種子經(jīng)42度高溫處理0h、lh、2h和4h的主根長(zhǎng)度分別為 19cm、22cm、14cm 和 16cm ；
[0097]野生型擬南芥種子(WT)種子經(jīng)42度高溫處理Oh、lh、2h和4h的主根長(zhǎng)度分別為14cm、13cm、I Icm 和 IOcm ；
[0098]在播種后第25天觀察和統(tǒng)計(jì)株高，結(jié)果如圖2E和2F所示，
[0099]T3代轉(zhuǎn)TaBRI擬南芥(BRI)種子經(jīng)42度高溫處理0h、lh、2h和4h的株高分別為14.8cm、15.2cm、13.2cm 和 11.4cm ；
[0100]野生型擬南芥種子(WT)種子經(jīng)42度高溫處理0h、lh、2h和4h的株高分別為
14.9cm、11.1cm、10.8cm 和 9.2cm ；
[0101]T3代轉(zhuǎn)空載體擬南芥和野生型擬南芥的結(jié)果無(wú)顯著差異。[0102]結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因株系在4個(gè)不同時(shí)間段的處理下萌發(fā)率均高于野生型，且野生型隨著處理時(shí)間的加長(zhǎng)萌發(fā)率明顯下降，而轉(zhuǎn)基因植株無(wú)明顯變化，4h后野生型擬南芥萌發(fā)率僅有30%，而轉(zhuǎn)基因擬南芥仍高達(dá)60%。測(cè)量根長(zhǎng)結(jié)果比較，4個(gè)不同時(shí)間段處理下轉(zhuǎn)基因植株均為野生型植株的1.3倍以上。后期的生長(zhǎng)轉(zhuǎn)基因植株也優(yōu)于野生型，且測(cè)量株高結(jié)果比較，Oh處理時(shí)轉(zhuǎn)基因與野生型擬南芥無(wú)差異，高溫處理后轉(zhuǎn)基因植株為野生型植株的1.2倍以上。
[0103]3、低溫逆境脅迫處理鑒定實(shí)驗(yàn)
[0104]分別將T3代轉(zhuǎn)TaBRI擬南芥(BRI)種子、T3代轉(zhuǎn)空載體擬南芥種子和野生型擬南芥種子(WT)經(jīng)3度低溫處理0h、0.5h、Ih和2h，再種在普通MS培養(yǎng)基上，然后移植到盆栽培養(yǎng)，各取50個(gè)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，結(jié)果取平均值。
[0105]在播種后第10天觀察萌發(fā)結(jié)果如圖3A所示，可以看出，T3代轉(zhuǎn)TaBRI擬南芥(BRI)種子和野生型擬南芥種子(WT)隨著處理時(shí)間的加長(zhǎng)，萌發(fā)率均有所下降，但轉(zhuǎn)基因株系仍表現(xiàn)一定的優(yōu)勢(shì)。統(tǒng)計(jì)萌發(fā)率，結(jié)果如圖3B所示，
[0106]T3代轉(zhuǎn)TaBRI擬南芥(BRI)種子經(jīng)3度低溫處理0h、0.5h、lh和2h的萌發(fā)率分別為 63%、77%、63% 和 68% ；
[0107]野生型擬南芥種子(WT)種子經(jīng)3度低溫處理0h、0.5h、lh和2h的萌發(fā)率分別為45%、55%、60%、58% ；
[0108]在播種后第15天統(tǒng)計(jì)根長(zhǎng)(主根長(zhǎng)度)，結(jié)果如圖3C所示，
[0109]T3代轉(zhuǎn)TaBRI擬南芥(BRI)種子經(jīng)3度低溫處理0h、0.5h、lh和2h的根長(zhǎng)分別為20cm、23cm、24cm 和 25cm ；
[0110]野生型擬南芥種子(WT)種子經(jīng)3度低溫處理0h、0.5h、lh和2h的根長(zhǎng)分別為19cm、17cm、15cm 和 14cm ；
[0111]T3代轉(zhuǎn)空載體擬南芥和野生型擬南芥的結(jié)果無(wú)顯著差異。
[0112]結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因株系在4個(gè)不同時(shí)間段的處理下萌發(fā)率均高于野生型，轉(zhuǎn)基因株系在63%以上，而野生型植株在60%以下。測(cè)量根長(zhǎng)結(jié)果比較，4個(gè)不同時(shí)間段處理下轉(zhuǎn)基因植株均為野生型植株的1.5倍以上。
[0113]4、高鹽逆境脅迫處理鑒定實(shí)驗(yàn)
[0114]分別將編號(hào)為BRI1-1、BRI1-2和BRI1-3的T3代轉(zhuǎn)TaBRI擬南芥種子、T3代轉(zhuǎn)空載體擬南芥種子和野生型擬南芥種子(WT)播種在分別含有0mM、50mM、100mM和150mM的MS培養(yǎng)基中，然后移植盆栽培養(yǎng)，每個(gè)株系各取50個(gè)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，結(jié)果取平均值。
[0115]在播種后第10天觀察萌發(fā)結(jié)果如圖4A所示，可以看出，編號(hào)為BRIl-1的！^代轉(zhuǎn)TaBRI擬南芥(BRI)種子和野生型擬南芥種子(WT)隨著濃度的加大萌發(fā)率均有所下降，但轉(zhuǎn)基因株系仍表現(xiàn)一定的優(yōu)勢(shì)。
[0116]統(tǒng)計(jì)萌發(fā)率,結(jié)果如圖4B所示，
[0117]編號(hào)為BRIl-1 的 T3R轉(zhuǎn)TaBRI 擬南芥(BRI)種子在含有0mM、50mM、IOOmM和 150mM
的MS培養(yǎng)基的萌發(fā)率分別為68%、64%、48%和38% ；
[0118]野生型擬南芥種子(WT)種子在含有0mM、50mM、IOOmM和150mM的MS培養(yǎng)基的萌發(fā)率分別為 66%、62%、38%、32%。
[0119]在播種后第15天觀察和統(tǒng)計(jì)在含有50mM的MS培養(yǎng)基根長(zhǎng)(主根)，結(jié)果如圖4C和4D所示，可以看出，編號(hào)為BRI1-1、BRI1-2和BRI 1_6的T3代轉(zhuǎn)TaBRI擬南芥的根長(zhǎng)均大于野生型擬南芥。編號(hào)為BRI1-1、BRI1-2和BRI1-6的T3代轉(zhuǎn)TaBRI擬南芥(BRI)種子在含有50mMNaCl的MS培養(yǎng)基的根長(zhǎng)分別為24cm、27cm和27cm ；
[0120]野生型擬南芥種子(WT)種子在含50mMNaCl的MS培養(yǎng)基的根長(zhǎng)為18cm ；
[0121 ] 在播種后第20天觀察在花盆中生長(zhǎng)情況，結(jié)果如圖4E，可以看出，T3代轉(zhuǎn)TaBRI擬南芥(TaBRI)在含50mMNaCl處理后三個(gè)株系的生長(zhǎng)情況均優(yōu)于野生型擬南芥(WT)。
[0122]在播種后第20天觀察和統(tǒng)計(jì)株高，結(jié)果如圖4F和圖4G所示，
[0123]編號(hào)為BRI1-1、BRI1-2和BRI 1_6的T3代轉(zhuǎn)TaBRI擬南芥(BRI)種子在含有50mMNaCl的MS培養(yǎng)基的株高分別為14.3cm、15.6cm和16.6cm ；
[0124]野生型擬南芥種子(WT)種子在含50mMNaCl的MS培養(yǎng)基的株高為13cm。
[0125]T3代轉(zhuǎn)空載體擬南芥和野生型擬南芥的結(jié)果無(wú)顯著差異。
[0126]結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因株系在4個(gè)不同鹽濃度的處理下萌發(fā)率均高于野生型，在IOOmMNaCl處理下差異最為明顯，轉(zhuǎn)基因株系萌發(fā)率為48%，而野生型僅為38%。測(cè)量50mMNaCl處理下三個(gè)轉(zhuǎn)基因株系與野生型擬南芥根長(zhǎng)結(jié)果比較，轉(zhuǎn)基因植株為野生型植株的1.2倍以上。后期的生長(zhǎng)中觀察葉片和株型，轉(zhuǎn)基因明顯比野生型擬南芥生長(zhǎng)要好，株高為野生型植株的1. 1倍以上。
【權(quán)利要求】
1.一種蛋白，是如下(a)或(b): Ca)由序列表中序列I所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)； (b)將序列I的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物耐逆性相關(guān)的由序列I衍生的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)。
2.編碼權(quán)利要求1所述蛋白的基因。
3.如權(quán)利要求2所述的基因，其特征在于:所述基因?yàn)槿缦翴)-3)中任一一種的DNA分子: 1)序列表中序列2所不的DNA分子； 2)在嚴(yán)格條件下與I)限定的DNA序列雜交且編碼與植物耐逆性相關(guān)蛋白的DNA分子； 3)與I)限定的DNA序列具有90%以上同源性，且編碼與植物耐逆性相關(guān)蛋白的DNA分子。
4.含有權(quán)利要求2或3所述基因的重組表達(dá)載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌。
5.如權(quán)利要求4所述的重組表達(dá)載體，其特征在于:所述重組表達(dá)載體為將權(quán)利要求2或3所述基因插入PBI121中得到的重組載體。
6.擴(kuò)增權(quán)利要求2或3所述基因的全長(zhǎng)或其任意片段的引物對(duì)。
7.權(quán)利要求1所述的蛋白或權(quán)利要求2或3所述基因或權(quán)利要求4或5所述的重組表達(dá)載體在調(diào)控植物耐逆性中的`應(yīng)用；所述調(diào)控植物耐逆性具體為提高植物耐逆性；所述耐逆具體為耐干旱、耐鹽、耐高溫和/或耐低溫。
8.一種培育轉(zhuǎn)基因植物的方法，是將權(quán)利要求2或3所述基因?qū)肽康闹参镏?，得到轉(zhuǎn)基因植物；所述轉(zhuǎn)基因植物耐逆性高于所述目的植物。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于:權(quán)利要求2或3所述基因通過(guò)權(quán)利要求4或5所述的重組表達(dá)載體導(dǎo)入所述目的植物中； 所述耐逆為耐干旱、耐鹽、耐高溫和/或耐低溫。
10.如權(quán)利要求8或9所述的方法，其特征在于:所述高溫為42度，所述低溫為3度； 所述目的植物為雙子葉植物或單子葉植物，所述雙子葉植物具體為擬南芥。
【文檔編號(hào)】C12N1/19GK103509092SQ201210201271
【公開(kāi)日】2014年1月15日 申請(qǐng)日期:2012年6月15日 優(yōu)先權(quán)日:2012年6月15日
【發(fā)明者】徐兆師, 馬有志, 裴麗麗, 翟朝增, 劉沛, 李連城, 陳明 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所