專利名稱：檢測結(jié)核桿菌藥敏性的方法及培養(yǎng)基的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種檢測 結(jié)核桿菌藥敏性的方法和培養(yǎng)基，尤其涉及一種可以不加入顯色劑即可觀察結(jié)核桿菌藥敏性的方法和培養(yǎng)基。
背景技術(shù)：
結(jié)核桿菌(MTB)是高致死率的傳染病，自上世紀80年代以來，全球結(jié)核病疫情出現(xiàn)了急劇惡化，其中重要原因之一是結(jié)核桿菌耐藥性，耐藥性已成為治療和控制結(jié)核病的巨大障礙，因此，檢測結(jié)核桿菌藥物敏感性對于控制疫情、治療疾病、藥物篩選和研發(fā)等均極為重要。WHO推薦的比例法穩(wěn)定性較好，但是需要4周時間，無法為臨床提供及時的用藥參考；BACTEC 3D方法可在一周內(nèi)報告結(jié)果，但是該方法采用放射性元素，價格昂貴。張文宏等(《微生物與感染》，2008，3 (4) :p204)報道了試驗三磷酸腺苷發(fā)光法快速檢測結(jié)核分枝桿菌藥敏性，5^7天后檢測敏感菌釋放的ATP，從而判定MTB對藥物的敏感性；彭麗等(《中國防癆雜質(zhì)》，2005，27 (I) :pl8)報道了以分支桿菌噬菌體為基礎(chǔ)的噬菌體生物擴增法，利用噬菌體生長快、只能活在分支桿菌中增殖的特性，可大大縮短檢測時間；此外還報道耐藥性基因測定，如PCR-單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析、DNA測序、DNA芯片檢測等；雖然上述方法應(yīng)用前景較好，但是上述對操作條件和操作人員技能要求較高，不利于工業(yè)上使用。2000年，Caviedes等人建立了一種新的MTB耐藥性檢測技術(shù)——顯微鏡觀察藥物敏感度檢測技術(shù)(MODS)，通過倒置顯微鏡對MTB特征性索狀結(jié)果進行觀察，來確定MTB的生長，從而進行藥敏判斷，胡忠義、崔振玲等(《中華預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志》2011,45(1) :p21)進行了MTB痰涂陽標本直接藥敏實驗，證明MODS技術(shù)直接檢測痰涂陽標本中MTB對藥物的敏感度具有快速、準確、廉價的優(yōu)點，可作為痰涂陽標本直接藥敏檢測方法。在MODS方法中，將MTB與藥物一起與培養(yǎng)基混合，然后進行培養(yǎng)，所用培養(yǎng)基主要為固體培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基、以及在此基礎(chǔ)上的固液雙相培養(yǎng)基、半流體培養(yǎng)基等，其中液體培養(yǎng)基能夠使MTB廣發(fā)接觸營養(yǎng)成分，因此MTB生長較快，但是液體培養(yǎng)基不利于肉眼觀察，一般需要加入顯色劑染色，以判斷結(jié)核桿菌是否生長，而顯色劑往往會給MTB帶來毒性，因此影響藥敏性的判斷。

發(fā)明內(nèi)容
針對目前液體培養(yǎng)基、以及檢測結(jié)核桿菌藥敏性方法不便于直接肉眼觀察的問題，本發(fā)明提供了一種新的檢測結(jié)核桿菌藥敏性的方法和培養(yǎng)基。本發(fā)明第一個方面是提供一種檢測結(jié)核桿菌藥敏性的培養(yǎng)基，包括液體培養(yǎng)基、促生長組分，所述培養(yǎng)基為酸性，pH值彡4. 5。所述培養(yǎng)基pH值優(yōu)選為4. 5 6. 5，更優(yōu)選為5 6。其中，所述液體培養(yǎng)基可以是單獨的液體培養(yǎng)基，也可以是來自含有液體培養(yǎng)基的固液雙相培養(yǎng)基、或包括所述液體培養(yǎng)基的混合物。
所述液體培養(yǎng)基如米氏培養(yǎng)基、蘇通培養(yǎng)基、以及其它可用液體培養(yǎng)基、或上述培養(yǎng)基的改良，可以是其中的任意一種或多種的混合，并優(yōu)選為米氏培養(yǎng)基7H9、7H10、7H11、或上述任意培養(yǎng)基的改良、或其中任意幾種的組合，更優(yōu)選為米氏培養(yǎng)基7H9、7H10、或上述任意培養(yǎng)基的改良、或其混合物；最有選為米氏培養(yǎng)基7H9、7H10、或其混合物。所述促生長組分指的是促進結(jié)核桿菌生長的營養(yǎng)組分，如牛血清蛋白、小牛血清、酵母提取物、葡萄糖(右旋糖)、氯化鈉、硫酸鎂、氯化錳、油酸、過氧化氫酶(Catalase)等，可以是其中的任意一種或幾種的混合物。根據(jù)本發(fā)明所述培養(yǎng)基的一種實施例，所述液體培養(yǎng)基包括米氏培養(yǎng)基，以及用于調(diào)節(jié)PH值的酸，此外，還可以包括蛋白胨、酵母提取物、瓊脂、甘油、乳化劑中的任意一種或幾種的混合物；所述酸可以是有機酸或無機酸，并優(yōu)選為無機酸，如磷酸、鹽酸、磷酸氫鹽、磷酸二氫鹽等，可以是其中的任意一種或幾種的混合物，所述鹽優(yōu)選為鉀鹽、鈉鹽、或其 混合物。所述蛋白胨可以是來自于動物或植物，如牛肉蛋白胨、魚蛋白胨、大豆蛋白胨等，具體例子包括酪蛋白胨、骨蛋白胨、胰蛋白胨等。所述乳化劑可以是脂肪酸環(huán)氧乙烯酯、多元醇脂肪酸酯、多元醇脂肪酸酯與環(huán)氧乙烷縮合物等，如吐溫-20、吐溫-21、吐溫-40、吐溫-60、吐溫-21、吐溫-80、吐溫-81、吐溫-85等，可以是一種或多種的混合物。根據(jù)所述培養(yǎng)基的另一種優(yōu)選實施例，所述培養(yǎng)基還包括抗生素，以抑制其它菌的生長，可以是單一抗生素或多種抗生素的混合物，如多粘菌素B、兩性菌素B、萘啶酸、甲氧芐嘧啶、氨芐西林等。本發(fā)明的第二個方面是提供一種檢測結(jié)核桿菌藥敏性的方法，步驟包括
步驟1，將待測菌用上述內(nèi)容中任意一種培養(yǎng)基配成菌液；
步驟2，將所述菌液與藥物混合，進行培養(yǎng)；
步驟3，3 20天后觀察沉淀，根據(jù)出現(xiàn)的沉淀量判斷待測菌對藥物的敏感度。其中，步驟2中，藥物在與菌液的混合物中濃度優(yōu)選為llOOOyg/ml，更優(yōu)選為10 3500 μ g/ml,更優(yōu)選為12. 5 3200 μ g/ml,更優(yōu)選為100 500 μ g/ml,更優(yōu)選為150 500 μ g/ml,如 200 μ g/ml>400 μ g/ml 等。其中，所述藥物指的是抗結(jié)核桿菌藥物，如氧氟沙星、左氧氟沙星、利福平、利福布丁、吡嗪酰胺、乙胺丁醇、對氨基水楊酸、異煙肼等，或者上述化合物的衍生物；優(yōu)選為吡嗪酰胺。其中，菌液中待測菌濃度優(yōu)選為IO2 109CFU/ml，更優(yōu)選為IO3 106CFU/ml，更優(yōu)選為 104 105CFU/mUn 2X104CFU/ml、5X104CFU/ml、6X104CFU/ml。其中，觀察沉淀時間優(yōu)選為5 20天后，更優(yōu)選為7 14天后，更優(yōu)選為7 10或1(Γ14天后。當(dāng)菌量較大時，活菌生長會產(chǎn)生沉淀，死菌沉淀與活菌沉淀可能出現(xiàn)混淆，因此，上述方法中，培養(yǎng)基中還可以加入顯色劑，如ΜΤΤ、刃天青、XTT等,此時,活菌產(chǎn)生的沉淀帶有其它顏色，而死菌沉淀為白色，但是顯色劑并不是必須的。因此，本發(fā)明上述的檢測結(jié)核桿菌藥敏性的培養(yǎng)基中，還可以包括顯色劑，如ΜΤΤ、刃天青、XTT等，但是顯色劑并不是必須的。
根據(jù)本發(fā)明上述檢測結(jié)核桿菌藥敏性方法的一種優(yōu)選實施方式，將菌液和藥物置于培養(yǎng)板中進行培養(yǎng)。根據(jù)本發(fā)明所述檢測結(jié)核桿菌藥敏性方法的進一步優(yōu)選實施方式，所述培養(yǎng)板的培養(yǎng)孔為U型孔，即培養(yǎng)孔底部為球面。本發(fā)明提供的檢測結(jié)核桿菌藥敏性的方法和培養(yǎng)基，可以在不使用顯色劑的情況下，通過倒置顯微鏡或放大鏡、或肉眼直接對沉淀進行觀察，不需要特殊設(shè)備讀取結(jié)果，只需肉眼觀察孔底菌量和顏色變化即可判斷結(jié)核分枝桿菌的藥物敏感性。
具體實施例方式本發(fā)明提供了一種用于檢測結(jié)核桿菌藥敏性的方法和培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基為酸性，在不加入顯色劑的情況下，即可通過肉眼直接觀察。
以檢測MTB對吡嗪酰胺藥敏性為例，下面通過具體實施例,對本發(fā)明進行詳細的介紹和描述，以使更好的理解本發(fā)明內(nèi)容，但是應(yīng)當(dāng)理解的是，下述實施例并不限制本發(fā)明范圍。菌株來源
MTB標準株(H37Rv，保藏號ATCC27294)和牛分枝桿菌(M. bovis，保藏號ATCC19210)購自美國國家菌種保藏中心。60株已知結(jié)果的MTB臨床分離株來自上海市肺科醫(yī)院菌株庫，已知PZA藥敏結(jié)果，且藥敏結(jié)果經(jīng)羅氏絕對濃度法和Bactec MIGIT藥敏檢測(Bactec MIGIT藥敏檢測為WHO推薦的方法)結(jié)果一致的MTB菌株，60株菌株中30株為對吡嗪酰胺(PZA)敏感的MTB菌株，30株為對PZA耐藥的MTB菌株。280株未知藥敏結(jié)果的MTB臨床分離株，來源于上海市肺科醫(yī)院結(jié)核科2011年I月 12月住院患者的痰標本培養(yǎng)物，經(jīng)菌種鑒定為MTB。培養(yǎng)基組分
液體培養(yǎng)基
米氏培養(yǎng)基7H94. 7-5. 9g
酪蛋白胨1.25g
甘油2-5ml
吐溫 80O. I-Iml
磷酸二氫鉀調(diào)節(jié)PH值至5飛。促生長成分
小牛血清50. Og
右旋糖20. Og
NaCl8. 5g
過氧化氫霉O. 03g
油酸O. 05-0. Ig
在培養(yǎng)過程中，為了抑制空氣中其它菌的污染，還可以加入抗生素成分，但是抗生素不是必須的。抗牛素多粘菌素B50U/ml
兩性霉素B5 μ g/ml
萘啶酸5-20 μ g/ml
甲氧芐嘧啶2-5 μ g/ml
氨節(jié)西林10-25 μ g/ml
上述培養(yǎng)基僅為舉例，所述液體培養(yǎng)基也可以是其它米氏培養(yǎng)基如7H10、7H11等，也可以是蘇通培養(yǎng)基、或其它常用培養(yǎng)基。實施例I 檢測藥敏性的方法
將50株已知菌株分別于液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)2周，重懸、磨菌，取懸濁液用液體培養(yǎng)基配成菌液，每種菌株分三組，每一組菌株濃度為IX 105、4X104、2X 104、1X IO4和5 X 103CFU/ml。含吡嗪酰胺的96孔U型孔培養(yǎng)板中，每孔加入100 μ I菌液，各個培養(yǎng)孔中吡嗪酸胺濃度分別從 12. 5mg/ml>25mg/ml>50mg/ml>IOOmg/ml>200mg/ml>400mg/ml>800mg/ml>1600mg/ml 梯度增加至 3200mg/ml。每種菌株第一組不加顯色劑，第二組加入刃天青、第三組加入MTT。37°C條件下培養(yǎng)，3天后即可通過倒置放大鏡觀察。其中
I)直接肉眼觀察(BMM)
出現(xiàn)肉眼可見的白色菌體沉淀為陽性，無肉眼可見菌體沉淀為陰性。MIC9tl定義為孔底可見白色菌體沉淀小于10%對照孔的最低藥物濃度。2)刃天青(REMA)
顏色從藍色變成粉色即預(yù)示細菌生長。MIC9tl被定義為阻止顏色變化的最低藥物濃度。3) MTT (REMA)
顏色變成紫色，加入SDS-DMF溶液變黃色，即預(yù)示細菌生長。MIC9tl被定義為阻止顏色變化的最低藥物濃度。觀察結(jié)果
每次實驗均以H37Rv為敏感株質(zhì)控，以M. bovis為耐藥株質(zhì)控，同一菌株的MIC值重復(fù)檢測3次；MIC值結(jié)果先以肉眼觀察結(jié)果記錄為BMM法結(jié)果；再以REMA法和MTT法對MIC結(jié)果進行確認。以Bactec MGIT藥敏結(jié)果為標準，表I和表2中給出了本發(fā)明上述三種觀察方法的MIC檢測結(jié)果和Medcalc軟件初步確定的敏感性和特異性結(jié)果。 表1，50株已知結(jié)果的MTB菌株的MIC檢測結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種檢測結(jié)核桿菌藥敏性的培養(yǎng)基，其特征在于，包括液體培養(yǎng)基、促生長成分，所述培養(yǎng)基為酸性，pH值> 4. 5。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的檢測結(jié)核桿菌藥敏性的培養(yǎng)基，其特征在于，所述培養(yǎng)基PH值為5 6。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的檢測結(jié)核桿菌藥敏性的培養(yǎng)基，其特征在于，還包括抑制其它菌生長的抗生素。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的檢測結(jié)核桿菌藥敏性的培養(yǎng)基，其特征在于，還包括顯色劑。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的檢測結(jié)核桿菌藥敏性的培養(yǎng)基，其特征在于，所述液體培養(yǎng)基為米氏培養(yǎng)基7H9、7H10、7H11、及各種可用于結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)的培養(yǎng)基、或其中任意幾種的組合。
6.一種檢測結(jié)合桿菌藥敏性的方法，其特征在于，步驟包括 步驟I，將待測菌用權(quán)利要求I所述培養(yǎng)基配成菌液； 步驟2，將所述菌液與藥物混合，進行培養(yǎng)； 步驟3，5 20天后，根據(jù)出現(xiàn)的沉淀量判斷待測菌對藥物的敏感度。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，培養(yǎng)溫度為35 37°C。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，步驟2中藥物在與菌液的混合物中濃度為10 3500ug/ml。
9.根據(jù)權(quán)利要求6或8所述的方法，其特征在于，在所述菌液中，待測菌濃度為IO3 106CFU/ml。
10.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述培養(yǎng)在培養(yǎng)板中進行，所述培養(yǎng)板的培養(yǎng)孔為U型孔。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種檢測結(jié)核桿菌藥敏性的方法和培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基為酸性，pH值≥4.5。將結(jié)核桿菌與藥物、以及本發(fā)明所述培養(yǎng)基混合后進行培養(yǎng)，3~20天即可觀察，觀察方法可以是通過肉眼直接觀察沉淀。利用本發(fā)明所述方法和培養(yǎng)基，建立的微量MIC檢測判斷MTB菌藥敏性的方法，不需要昂貴的儀器設(shè)備，僅需肉眼判讀，結(jié)果準確，既可以獲得較為詳細的菌株耐藥數(shù)據(jù)，又可以提供簡單明了的藥敏判斷結(jié)果，作為一種準確、快速、低成本、易于操作藥敏檢測方法，在臨床、以及企業(yè)中藥物篩選和研發(fā)過程中具有良好的推廣應(yīng)用前景。
文檔編號C12R1/32GK102703572SQ201210181480
公開日2012年10月3日 申請日期2012年6月5日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月5日
發(fā)明者崔振玲, 王潔, 胡忠義, 陸俊梅, 黃曉辰 申請人:上海市肺科醫(yī)院