專利名稱：與中國(guó)荷斯坦奶牛產(chǎn)奶性狀相關(guān)的snp標(biāo)記及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程及分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體地說(shuō)，涉及一種與中國(guó)荷斯坦奶牛產(chǎn)奶性狀相關(guān)的SNP標(biāo)記及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
奶業(yè)的發(fā)展對(duì)于改善人們的膳食結(jié)構(gòu)，增強(qiáng)國(guó)民體質(zhì)，促進(jìn)經(jīng)濟(jì)發(fā)展等方面，都具有重要作用。奶牛產(chǎn)業(yè)是奶業(yè)發(fā)展的龍頭產(chǎn)業(yè)，而我國(guó)奶牛產(chǎn)業(yè)的發(fā)展水平明顯落后于世界發(fā)達(dá)國(guó)家，總產(chǎn)奶量占世界總量的不足6%，人均占有量?jī)H為世界平均水平的四分之一，奶牛單產(chǎn)不到世界發(fā)達(dá)國(guó)家的一半。以擴(kuò)充奶牛數(shù)量提高產(chǎn)奶總量的傳統(tǒng)發(fā)展模式易受到空間和發(fā)展規(guī)模的限制，影響了奶農(nóng)養(yǎng)殖的積極性。因此，培育高產(chǎn)奶牛群體已成為我國(guó)奶牛產(chǎn)業(yè)發(fā)展的關(guān)鍵。只有不斷改良奶牛群體的遺傳水平，才能從根本上提高其經(jīng)濟(jì)性狀的生產(chǎn)性能，從而促進(jìn)我國(guó)奶牛產(chǎn)業(yè)持續(xù)健康發(fā)展。 隨著分子數(shù)量遺傳學(xué)、分子生物學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，有關(guān)分子遺傳標(biāo)記和標(biāo)記輔助選擇的研究被廣泛開(kāi)展，并在畜禽育種中應(yīng)用，產(chǎn)生了巨大的影響。PCR-RFLP(PCR-Restriction Fragment Length Polymorphism)是在PCR技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的，其基本原理是用PCR擴(kuò)增目的DNA片段，擴(kuò)增產(chǎn)物用特異性限制性內(nèi)切酶消化切割成不同大小片段，直接利用凝膠電泳圖進(jìn)行分析。不同等位基因的限制性酶切位點(diǎn)分布不同，產(chǎn)生不同長(zhǎng)度的DNA片段條帶，從而達(dá)到鑒定不同基因型的目的。分子育種，即分子標(biāo)記輔助選擇育種，是指利用DNA分子標(biāo)記對(duì)育種材料進(jìn)行選擇，綜合改良畜禽重要經(jīng)濟(jì)性狀，是傳統(tǒng)遺傳育種與現(xiàn)代分子生物學(xué)有機(jī)結(jié)合的育種方法。分子育種為家畜育種開(kāi)辟了一條新的途徑，隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展，分子標(biāo)記在家畜育種中的作用將日益突出。在奶牛育種中，人們希望選擇與產(chǎn)奶性狀密切相關(guān)，且與數(shù)量性狀緊密連鎖的DNA標(biāo)記，以實(shí)現(xiàn)早期選種和提高育種準(zhǔn)確性的目標(biāo)，從而加快遺傳育種進(jìn)程。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種與中國(guó)荷斯坦奶牛產(chǎn)奶性狀相關(guān)的SNP標(biāo)記及其應(yīng)用。本發(fā)明的另一目的是提供用于檢測(cè)所述與中國(guó)荷斯坦奶牛產(chǎn)奶性狀相關(guān)的SNP標(biāo)記的引物及含有該引物的試劑盒。為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明的一種與中國(guó)荷斯坦奶牛產(chǎn)奶性狀相關(guān)的SNP標(biāo)記，其位于中國(guó)荷斯坦奶牛PTK2基因如SEQ ID NO. I所示序列的227bp處，此處堿基為T(mén)的中國(guó)荷斯坦奶牛的產(chǎn)奶量、乳蛋白含量顯著高于此處堿基為G的中國(guó)荷斯坦奶牛，而乳脂率前者顯著低于后者。本發(fā)明還提供用于檢測(cè)上述與中國(guó)荷斯坦奶牛產(chǎn)奶性狀相關(guān)的SNP標(biāo)記的引物，包括正向引物 F5’ -TCTGAATCTGCCTCATAAC-3’和反向引物 R5' -CTGCTCCGTCTGTGCT-3'。本發(fā)明還提供上述與中國(guó)荷斯坦奶牛產(chǎn)奶性狀相關(guān)的SNP標(biāo)記在鑒定產(chǎn)奶量高的中國(guó)荷斯坦奶牛優(yōu)勢(shì)品種中的應(yīng)用，其包括步驟1)提取待測(cè)中國(guó)荷斯坦奶牛的基因組DNA ；2)以待測(cè)中國(guó)荷斯坦奶牛的基因組DNA為模版，利用所述引物F和R，通過(guò)PCR反應(yīng)擴(kuò)增出中國(guó)荷斯坦奶牛PTK2基因496bp片段；3)檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，如果擴(kuò)增產(chǎn)物序列中227bp處的堿基為T(mén)，則待測(cè)中國(guó)荷斯坦奶牛屬于產(chǎn)奶量高的中國(guó)荷斯坦奶牛優(yōu)勢(shì)品種。前述應(yīng)用中，步驟2)中PCR反應(yīng)使用的擴(kuò)增體系以25 ill計(jì)為50ng/ill模板DNAl u 1，10pmol/u I 弓I物 F 和 R 各 I y 1，IOmmoI/L dNTPmix2. 0 u l,5U/u L Taq DNA 聚合酶0. 125 iil，IOXPCR反應(yīng)緩沖液2.5 iil，余量為水。前述應(yīng)用中，步驟2)中PCR反應(yīng)的條件為94°C5分鐘；94°C 30秒，47. 5°C 35秒，72 0C 35秒，34個(gè)循環(huán)；72°C 10分鐘。前述應(yīng)用中，步驟3)中檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物采用RFLP法，具體為用內(nèi)切酶NlaIII對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切，并對(duì)酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)， 如果檢測(cè)結(jié)果僅為一條帶，則待測(cè)中國(guó)荷斯坦奶牛屬于產(chǎn)奶量高的中國(guó)荷斯坦奶牛優(yōu)勢(shì)品種，檢測(cè)結(jié)果出現(xiàn)兩條帶，則待測(cè)中國(guó)荷斯坦奶牛屬于普通品種。本發(fā)明還提供含有所述引物F和R的用于檢測(cè)中國(guó)荷斯坦奶牛產(chǎn)奶性狀的試劑盒。所述試劑盒還包括dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg2+、PCR反應(yīng)緩沖液中的一種或多種。優(yōu)選所述試劑盒還包括標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模板。本發(fā)明進(jìn)一步提供所述與中國(guó)荷斯坦奶牛產(chǎn)奶性狀相關(guān)的SNP標(biāo)記在中國(guó)荷斯坦奶牛分子標(biāo)記輔助育種中的應(yīng)用。本發(fā)明利用中國(guó)荷斯坦奶牛的PTK2基因的SNP位點(diǎn)進(jìn)行基因分型，并對(duì)該基因的T227G與奶牛的產(chǎn)奶性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，通過(guò)SAS9. 0軟件Mixed過(guò)程進(jìn)行線性模擬分析發(fā)現(xiàn)，TT基因型個(gè)體的產(chǎn)奶量、乳蛋白量顯著高于TG、GG基因型個(gè)體(P < 0. 05)，乳脂率顯著低于GG基因型個(gè)體(P<0.05)。該多態(tài)位點(diǎn)的檢出，既為分子育種提供了新的素材，又為中國(guó)荷斯坦奶牛產(chǎn)奶性狀的標(biāo)記輔助選擇提供了科學(xué)依據(jù)。本發(fā)明提供了一種與中國(guó)荷斯坦奶牛產(chǎn)奶性狀相關(guān)的SNP標(biāo)記及其應(yīng)用，既采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)和測(cè)序技術(shù)篩選到與中國(guó)荷斯坦奶牛產(chǎn)奶性狀相關(guān)的SNP標(biāo)記，并通過(guò)限制片段多態(tài)性(RFLP)方法來(lái)檢測(cè)待測(cè)中國(guó)荷斯坦奶牛的基因型，根據(jù)基因型進(jìn)行產(chǎn)奶量高的中國(guó)荷斯坦奶牛優(yōu)勢(shì)品種的選育，從而加快中國(guó)荷斯坦奶牛的育種進(jìn)程。本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)在于(一)本發(fā)明提供的分子遺傳標(biāo)記不受中國(guó)荷斯坦奶牛的年齡、性別等限制，可用于中國(guó)荷斯坦奶牛的早期選育，甚至在中國(guó)荷斯坦奶牛剛出生時(shí)就可準(zhǔn)確地進(jìn)行篩選，可大大加快中國(guó)荷斯坦奶牛的育種進(jìn)程；(二)檢測(cè)方法準(zhǔn)確。


圖I為PCR-RFLP瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)圖；其中，M DL2000DNAMarkero圖2為本發(fā)明中國(guó)荷斯坦奶牛三種基因型的測(cè)序峰圖。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段，所用原料均為市售商品。實(shí)施例I與中國(guó)荷斯坦奶牛產(chǎn)奶性狀相關(guān)的SNP標(biāo)記的獲得I. I中國(guó)荷斯坦奶牛血液DNA提取
本實(shí)施例中使用的牛血樣為_(kāi)20°C保存的凝結(jié)牛全血，全血分為血凝塊和血清，血凝塊為黯紅色,血清呈清亮黃色,血液中只有白細(xì)胞內(nèi)含有DNA，白細(xì)胞主要存在于血凝塊部分。采用天根血液DNA提取試劑盒從血塊中提取基因組DNA，按照試劑盒說(shuō)明稍作調(diào)整，具體步驟如下I)預(yù)備2mL已滅菌的圓底離心管，每個(gè)管內(nèi)放置一顆潔凈鋼珠(直徑約 5mm-6mm)；2)取出血液樣品，融化后，用手術(shù)剪刀剪取約200 ii 1-300 U I凝血塊于離心管中。加入600 u I細(xì)胞裂解液CL，放入Qiangen組織研磨器中，以30次/秒的頻率研磨5分鐘，放置在55°C烘箱中處理2-3分鐘，其間顛倒混勻數(shù)次，取出鋼珠丟棄；3) 10, OOOrpm離心lmin，棄去暗紅色上清；4)再次加入600 U I細(xì)胞裂解液CL，振蕩器振蕩使沉淀物散開(kāi)懸浮，10，OOOrpm離心lmin,棄去上清；5)加入200 U I緩沖液GS，用渦旋儀充分懸浮血塊顆粒；6)加入20 ill蛋白酶K，220 ill緩沖液GB，充分晃動(dòng)混勻；7) 55°C轉(zhuǎn)爐中過(guò)夜消化，消化初始階段，要顛倒混勻數(shù)次以促進(jìn)消化過(guò)程，直至溶液變澄清透明，一般為淺棕色；8)加入200 U I冰鎮(zhèn)無(wú)水乙醇，輕輕上下顛倒混勻，5000轉(zhuǎn)/分離心2分鐘，將雜質(zhì)如牛毛等沉淀至管底。將離心管中液體轉(zhuǎn)移到吸附柱中，12，OOOrpm離心30s，棄去收集管中的廢液，未離心完全的再次離心；9)向吸附柱中加入500 ill去蛋白液⑶，靜置2分鐘，12，OOOrpm離心30s，棄去收
集管中廢液；10)向吸附柱中加入700 U I漂洗液PW，靜置2分鐘，12，OOOrpm離心30s，棄去廢液；11)重復(fù)上一步；12) 12, OOOrpm 離心 2min ；13)將吸附柱轉(zhuǎn)移到新的I. 5mL離心管中，開(kāi)口在55°C烘箱中晾置2分鐘，至乙醇揮發(fā)完全；14)加入100 U I預(yù)熱的洗脫緩沖液TB，蓋蓋在55°C烘箱中靜置2min ；15) 12, OOOrpm 離心 2min,棄吸附柱?；蚪MDNA存在于離心管溶液中，4°C保存?zhèn)溆没騙20°C長(zhǎng)期保存。 I. 2目的片段和SNP位點(diǎn)的獲得以及PCR-RFLP分型(I)擴(kuò)增含SNP位點(diǎn)的核苷酸片段根據(jù)Ensembl數(shù)據(jù)庫(kù)收錄的PTK2基因(ENSBTAG00000009578)序列設(shè)計(jì)引物，包括正向引物 F5 ’ -TCTGAATCTGCCTCATAAC-3，和反向引物 R5 ' -CTGCTCCGTCTGTGCT-3 '，擴(kuò)增出待測(cè)SNP所在的核苷酸片段，如SEQ ID NO. I所示。該SNP位點(diǎn)位于該P(yáng)CR擴(kuò)增片段的227bp處，該處堿基可以為T(mén)或G，當(dāng)該處堿基為G時(shí)，可被NlaIII內(nèi)切酶(識(shí)別序列為CATG)識(shí)別。其中，PCR反應(yīng)體系以25 ill計(jì)為50ng/ill模板DNA I yl，IOpmol/引物F和R各 I ii 1，lOmmol/L dNTP mix2. O u l,5U/u L Taq DNA聚合酶0. 125 y I，IOXPCR反應(yīng)緩沖液2.5 yl，余量為水。PCR 反應(yīng)條件為94°C 5 分鐘；94°C 30 秒，47. 5°C 35 秒，72°C 35 秒，34 個(gè)循環(huán)；72 0C 10 分鐘。(2)針對(duì)第227位堿基的不同選擇適當(dāng)?shù)膬?nèi)切酶進(jìn)行PCR-RFLP該P(yáng)CR產(chǎn)物用NlaIII內(nèi)切酶酶切，反應(yīng)體系以20ul計(jì)為IOU/ii LNlaIII內(nèi)切酶0. 5ul，10 X NEB 緩沖液 2ul，10ug/ul 100 X BSAO. 2ul，上述 PCR 產(chǎn)物 12ul，余量為水。反應(yīng)條件為37°C溫育4小時(shí)。然后，將得到的酶切產(chǎn)物在瓊脂糖凝 膠中電泳，溴化乙錠染色，凝膠成像系統(tǒng)中觀察(圖I)。3、基因型判定及關(guān)聯(lián)分析根據(jù)PCR-RFLP的結(jié)果判定該位點(diǎn)在檢測(cè)群體中的基因型。當(dāng)擴(kuò)增片段的227bp處堿基均為G時(shí)，NlaIII內(nèi)切酶可識(shí)別該位點(diǎn)，即可將PCR擴(kuò)增片段切成兩個(gè)片段，一個(gè)為227bp，另一個(gè)片段為269bp，該基因型記為GG型；當(dāng)227bp處的堿基都為T(mén)時(shí)，NlaIII內(nèi)切酶不可識(shí)別，即PCR擴(kuò)增片段不能被切開(kāi)，凝膠中只有一條帶，長(zhǎng)度為496bp，該基因型記為T(mén)T型；當(dāng)227bp處既含有G堿基又含有T堿基時(shí)，即凝膠電泳中含有三條帶，長(zhǎng)度分別為496bp、227bp和269bp，該基因型記為雜合型TG型。即，該位點(diǎn)可分為3種基因型TT :496，TG :496/227/269, GG :227/269。3種基因型測(cè)序峰圖見(jiàn)圖2。實(shí)施例2中國(guó)荷斯坦奶牛不同基因型與產(chǎn)奶性狀的關(guān)聯(lián)分析及檢測(cè)應(yīng)用按照實(shí)施例I的方法，對(duì)采自北京地區(qū)不同奶牛養(yǎng)殖場(chǎng)的14個(gè)公牛家系共608頭中國(guó)荷斯坦奶牛進(jìn)行PCR-RFLP檢測(cè)，PTK2基因如SEQ ID NO. I所示序列227bp位點(diǎn)的分析結(jié)果如表I所示。運(yùn)用SAS9. 0軟件Mixed程序進(jìn)行線性模擬分析SNP多態(tài)位點(diǎn)的基因型與產(chǎn)奶性狀的關(guān)聯(lián)關(guān)系，分析時(shí)以個(gè)體育種值(EBV)代表表型值，采用的模型如下Yijk = U +G^ajIeijk其中，Yijk為個(gè)體育種值，U為育種值群體均值，Gi為基因型效應(yīng)，Bj為微效多基因效應(yīng)，eijk為隨機(jī)誤差效應(yīng)。表ISNP位點(diǎn)在中國(guó)荷斯坦奶牛群體中的基因型頻率及等位基因頻率
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Gtl44(j0.:. 由表I可知，TT純合型個(gè)數(shù)體顯著高于TG型、GG型，T等位基因?yàn)閮?yōu)勢(shì)基因。進(jìn)行卡方適合性檢驗(yàn)，( 1 )期望值與觀測(cè)值差異不顯著，可知該位點(diǎn)在群體中處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)。表2中國(guó)荷斯坦奶牛PTK2基因SNP位點(diǎn)與產(chǎn)奶性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析
權(quán)利要求
1.ー種與中國(guó)荷斯坦奶牛產(chǎn)奶性狀相關(guān)的SNP標(biāo)記，其特征在于，其位于中國(guó)荷斯坦奶牛PTK2基因如SEQ ID NO. I所示序列的227bp處，此處堿基為T(mén)的中國(guó)荷斯坦奶牛的產(chǎn)奶量、乳蛋白含量顯著高于此處堿基為G的中國(guó)荷斯坦奶牛，而乳脂率前者顯著低于后者。
2.用于檢測(cè)權(quán)利要求I所述與中國(guó)荷斯坦奶牛產(chǎn)奶性狀相關(guān)的SNP標(biāo)記的引物，其特征在于，包括正向引物F5’ -TCTGAATCTGCCTCATAAC-3’和反向引物R5' -CTGCTCCGTCTGTGCT-3'。
3.權(quán)利要求I所述與中國(guó)荷斯坦奶牛產(chǎn)奶性狀相關(guān)的SNP標(biāo)記在鑒定產(chǎn)奶量高的中國(guó)荷斯坦奶牛優(yōu)勢(shì)品種中的應(yīng)用，其包括步驟 1)提取待測(cè)中國(guó)荷斯坦奶牛的基因組DNA; 2)以待測(cè)中國(guó)荷斯坦奶牛的基因組DNA為模版，利用權(quán)利要求2所述引物F和R，通過(guò)PCR反應(yīng)擴(kuò)增出中國(guó)荷斯坦奶牛PTK2基因496bp片段； 3)檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，如果擴(kuò)增產(chǎn)物序列中227bp處的堿基為T(mén)，則待測(cè)中國(guó)荷斯坦奶牛屬于產(chǎn)奶量高的中國(guó)荷斯坦奶牛優(yōu)勢(shì)品種。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，步驟2)中PCR反應(yīng)使用的擴(kuò)增體系以 25 μ I 計(jì)為50ng/ μ I 模板 DNAl μ 1，IOpmoI/d 弓I 物 F 和 R 各 I μ 1，IOmmoI/L dNTPmix2. Ομ l,5U/y L Taq DNA 聚合酶 O. 125 μ I，IOXPCR 反應(yīng)緩沖液 2. 5 μ I，余量為水。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于，步驟2)中PCR反應(yīng)使用的條件為94°C5分鐘；94°C 30 秒，47. 50C 35 秒，72°C 35 秒，34 個(gè)循環(huán)；72°C 10 分鐘。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，步驟3)中檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物采用RFLP法，具體為用內(nèi)切酶NlaIII對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切，并對(duì)酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，如果檢測(cè)結(jié)果僅為一條帯，則待測(cè)中國(guó)荷斯坦奶牛屬于產(chǎn)奶量高的中國(guó)荷斯坦奶牛優(yōu)勢(shì)品種，檢測(cè)結(jié)果出現(xiàn)兩條帶，則待測(cè)中國(guó)荷斯坦奶牛屬于普通品種。
7.含有權(quán)利要求2所述引物的用于檢測(cè)中國(guó)荷斯坦奶牛產(chǎn)奶性狀的試劑盒。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括dNTPs、TaqDNA聚合酶、Mg2+、PCR反應(yīng)緩沖液中的ー種或多種。
9.根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模板。
10.權(quán)利要求I所述與中國(guó)荷斯坦奶牛產(chǎn)奶性狀相關(guān)的SNP標(biāo)記在中國(guó)荷斯坦奶牛分子標(biāo)記輔助育種中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種與中國(guó)荷斯坦奶牛產(chǎn)奶性狀相關(guān)的SNP標(biāo)記及其應(yīng)用，其位于中國(guó)荷斯坦奶牛PTK2基因如SEQ ID NO.1所示序列的227bp處，此處堿基為T(mén)的中國(guó)荷斯坦奶牛的產(chǎn)奶量、乳蛋白含量顯著高于此處堿基為G的中國(guó)荷斯坦奶牛，而乳脂率前者顯著低于后者。本發(fā)明采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)和測(cè)序技術(shù)篩選到與中國(guó)荷斯坦奶牛產(chǎn)奶性狀相關(guān)的SNP標(biāo)記，并通過(guò)限制片段多態(tài)性(RFLP)方法來(lái)檢測(cè)待測(cè)中國(guó)荷斯坦奶牛的基因型，根據(jù)基因型進(jìn)行產(chǎn)奶量高的中國(guó)荷斯坦奶牛優(yōu)勢(shì)品種的選育，從而加快中國(guó)荷斯坦奶牛的育種進(jìn)程。
文檔編號(hào)C12N15/11GK102676514SQ20121017547
公開(kāi)日2012年9月19日 申請(qǐng)日期2012年5月30日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月30日
發(fā)明者劉劍鋒, 張勤, 張勝利, 王海飛, 趙紅梅 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)