專利名稱：一種立體選擇性α-羥酸脫氫酶的篩選方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及ー種立體選擇性α -羥酸脫氫酶的篩選方法。
(ニ)
背景技術(shù)：
立體選擇性α -羥酸脫氫酶為ー類特殊的氧化還原酶，能立體選擇性催化外消旋α-羥羧酸類化合物中的一種異構(gòu)體生成相應(yīng)的α -酮酸，反應(yīng)液中留下另外一種異構(gòu)體(見下式)，由于產(chǎn)物中光學(xué)活性的α-羥酸與酮酸的性質(zhì)差異較大，易于分離。利用該酶可以用于生產(chǎn)手性的α-羥酸和酮酸，具有良好的開發(fā)應(yīng)用前景。
權(quán)利要求
1.一種立體選擇性a -羥酸脫氫酶的篩選方法，所述方法包括 (1)取被測含有a-羥酸脫氫酶的樣品溶于pH為5 9的緩沖液中，添加結(jié)構(gòu)如式(I)所示的a -羥酸的手性單體作為底物至底物終濃度為I IOOmM,于20 50°C水浴中進行轉(zhuǎn)化反應(yīng)；
2.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，步驟(2)中轉(zhuǎn)化液呈現(xiàn)紅棕色時，所述方法進一步包括步驟(3)和(4) (3)另取轉(zhuǎn)化液顯紅棕色的待測樣品溶于pH為5 9的緩沖液中，添加立體構(gòu)型與步驟(I)相反的手性單體作為底物至底物終濃度為I IOOmM,于20 50°C水浴中進行轉(zhuǎn)化反應(yīng); (4)取轉(zhuǎn)化液添加2，4-二硝基苯肼溶液進行顯色反應(yīng)20 90min，反應(yīng)結(jié)束后，若有黃亮色絮狀沉淀生成，且加入NaOH溶液后，黃亮色的絮狀沉淀變成顏色均一的紅棕色溶液，則表明待測樣品中含有的a-羥酸脫氫酶沒有立體選擇性；若顯淡綠色，表明待測樣品中含有與步驟(I)底物的立體構(gòu)型一致的a-羥酸脫氫酶。
3.如權(quán)利要求I或2所述的方法，其特征在于所述扁桃酸及其衍生物為下列之一(I)扁桃酸，(2) 2-氟扁桃酸、(3) 2-氯扁桃酸、(4) 3-氯扁桃酸、(5) 4-氟扁桃酸、(6) 4-氯扁桃酸、(7) 4-溴扁桃酸、(8) 2,4-二氟扁桃酸、(9) 3, 5-二氟扁桃酸，(10)苯基乳酸。
4.如權(quán)利要求I或2所述的方法，其特征在于所述pH為5 9的緩沖液為pH7. 5 8.0的磷酸二氫鈉-磷酸氫二鈉緩沖液。
5.如權(quán)利要求I或2所述的方法，其特征在于所述2，4_二硝基苯肼溶液為濃度為0.5 6mM的鹽酸或硫酸溶液，其中2，4- 二硝基苯肼的濃度為0. 01 5mM。
6.如權(quán)利要求I或2所述的方法，其特征在于所述NaOH溶液濃度為0.I 5M。
7.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于所述待測樣品為微生物菌體，所述方法如下 (A)取待篩選的微生物菌體均勻分散于pH = 6. 0 9. 0的磷酸緩沖液中，制成0D600值為5 10的菌懸液，添加結(jié)構(gòu)如式(I)所示a -羥酸的外消旋體作為底物至底物終濃度為I IOOmM,于20 50°C水浴中進行反應(yīng)，取轉(zhuǎn)化液添加0. 2 3mL的2，4- 二硝基苯肼溶液進行反應(yīng)20 90min，反應(yīng)結(jié)束后繼續(xù)加入3 IOmL的NaOH溶液，顯紅棕色的為a-羥酸脫氫酶陽性樣品，顯淡綠色的為a-羥酸脫氫酶陰性樣品；(B)另取a-羥酸脫氫酶陽性樣品兩份，溶于pH 7. 5 8. O的磷酸二氫鈉-磷酸氫二鈉緩沖液中，各自添加手性的結(jié)構(gòu)如式(I)所示的R-或S-a-羥酸單體進行對照，所添加的R-或S- a -羥酸終濃度為I IOOmM,于20 50°C水浴中進行反應(yīng)，分別取轉(zhuǎn)化液添加.2,4- 二硝基苯肼溶液進行反應(yīng)20 90min后，繼續(xù)加入NaOH溶液進行顯色，若僅有一份轉(zhuǎn) 化液顯紅棕色，表明樣品中所含的a-羥酸脫氫酶的光學(xué)選擇性與呈紅棕色樣品中添加的手性a-羥酸的立體構(gòu)型一致，兩份轉(zhuǎn)化液均顯紅棕色表明樣品中所含的a-羥酸脫氫酶沒有光學(xué)選擇性； 上述步驟(A)和⑶中，所述2，4- 二硝基苯肼溶液為濃度為0. 5 6mM的鹽酸或硫酸溶液，其中2，4- 二硝基苯肼的濃度為0. 01 5mM ;所述NaOH溶液濃度為0. I 5M。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種立體選擇性α-羥酸脫氫酶的篩選方法。本發(fā)明將待測樣品與手性的S-或R-扁桃酸及其衍生物單體進行反應(yīng)后，取反應(yīng)轉(zhuǎn)化液添加2，4-二硝基苯肼溶液進行顯色反應(yīng)，若有黃亮色絮狀沉淀生成，且添加NaOH溶液后黃亮色的絮狀沉淀變成顏色均一的紅棕色溶液，則表明待測樣品中含有與底物的立體構(gòu)型一致的脫氫酶；若顯淡綠色，表明待測樣品中不含有與底物的立體構(gòu)型一致的脫氫酶。本方法基于簡單的顯色法能快速的確定被測樣品的脫氫酶活性及選擇性，具有操作簡單，反應(yīng)靈敏，檢測迅速，設(shè)備要求低，通用性強等優(yōu)點，為具有一種光學(xué)選擇性手性扁桃酸及其相關(guān)衍生物脫氫酶的篩選帶來了極大的便利。
文檔編號C12Q1/04GK102660632SQ201210110398
公開日2012年9月12日 申請日期2012年4月13日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月13日
發(fā)明者沈寅初, 王威, 薛亞平, 鄭裕國 申請人:浙江工業(yè)大學(xué)