專(zhuān)利名稱(chēng)：非接觸式電導(dǎo)法實(shí)現(xiàn)pcr反應(yīng)過(guò)程的實(shí)時(shí)檢測(cè)系統(tǒng)和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種非接觸式電導(dǎo)法實(shí)現(xiàn)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)過(guò)程的實(shí)時(shí)檢測(cè)系統(tǒng)和方法，包括聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)微芯片、非接觸式電導(dǎo)電化學(xué)檢測(cè)電極、高靈敏度讀出電路和分析方法等，屬電化學(xué)傳感技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
致病微生物的快速檢測(cè)和分析是食品安全、環(huán)境監(jiān)測(cè)、公共衛(wèi)生等領(lǐng)域迫切需求的技術(shù)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)為微生物的檢測(cè)分析提供了有效的工具，該技術(shù)的主要優(yōu)點(diǎn)是在核酸的擴(kuò)增過(guò)程中對(duì)核酸進(jìn)行定量分析，從而縮短了常規(guī)終點(diǎn)檢測(cè)法所需要的時(shí)間。然而，目前所有的實(shí)時(shí)定量PCR均是基于光學(xué)檢測(cè)方法，需要進(jìn)行熒光標(biāo)記同時(shí)需要復(fù)雜和昂貴的光學(xué)檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行熒光檢測(cè)，儀器構(gòu)造復(fù)雜，難以小型化，只適合在中心實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，因此目前尚缺乏適合于現(xiàn)場(chǎng)微生物快速測(cè)定的手段和儀器。電化學(xué)檢測(cè)方法的原理是以脫氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)的擴(kuò)增產(chǎn)物為敏感對(duì)象，電化學(xué)電極為信號(hào)轉(zhuǎn)換器，以電勢(shì)、電流或電導(dǎo)等為特征檢測(cè)信號(hào)，實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)檢測(cè)PCR反應(yīng)過(guò)程。檢測(cè)的依據(jù)在于1)DNA的一些組分在一定電勢(shì)窗口下有電化學(xué)活性的 (例如鳥(niǎo)嘌呤)，可直接在電極表面實(shí)現(xiàn)電子轉(zhuǎn)移；2)通過(guò)外部的一些氧化還原媒介(如亞甲基藍(lán)、Hoechst 33258、道諾霉素和棘霉素等)來(lái)實(shí)現(xiàn)電子傳遞，借助于這些與DNA選擇性結(jié)合的有電化學(xué)活性的指示劑來(lái)進(jìn)行雜交檢測(cè)。以納米金顆粒做標(biāo)記物不僅有更好的生物相容性，它的表面可以催化銀顆粒的沉積，增加了信噪比。近年來(lái)的電化學(xué)檢測(cè)法已經(jīng)達(dá)到了較高的靈敏度，如靈敏度達(dá)ng/uL級(jí)或用ssDNA探針標(biāo)記雜交甚至可以達(dá)到單分子檢測(cè)水平。相比較于熒光法的背景光干擾多，電化學(xué)法的背景噪聲較小，檢測(cè)效率較高。如上所述，電化學(xué)檢測(cè)具有靈敏度高、成本低、易于集成化、微型化等優(yōu)點(diǎn)，若能將電化學(xué)檢測(cè)方法與先進(jìn)的微機(jī)械加工技術(shù)相匹配，具有實(shí)現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)的潛力，因此采用電化學(xué)方法對(duì)PCR 過(guò)程進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測(cè)，不僅能得到可與熒光定量PCR媲美的檢測(cè)結(jié)果，且電化學(xué)檢測(cè)所需的設(shè)備簡(jiǎn)單，操作方便，可在條件簡(jiǎn)陋的場(chǎng)合應(yīng)用且不需要專(zhuān)業(yè)人員操作。雖然片上的DNA擴(kuò)增分析的電化學(xué)技術(shù)已經(jīng)較成熟，目前文獻(xiàn)報(bào)道的電化學(xué)檢測(cè)實(shí)時(shí)PCR過(guò)程均采用接觸式電極直接測(cè)定，不管是用非標(biāo)記法還是標(biāo)記法，基于的原理都是檢測(cè)終產(chǎn)物在電極表面富集或引起電極表面離子濃度變化而引起電流或電阻抗的變化。 因此電極表面會(huì)有殘留物，它的二次檢測(cè)遠(yuǎn)達(dá)不到第一次檢測(cè)時(shí)的性能。雖然可以在二次檢測(cè)前對(duì)電極進(jìn)行清洗處理，但是這樣的過(guò)程就復(fù)雜化了，且效果不能十分明顯。若使用一次性電極，則增加了檢測(cè)的成本和資源的浪費(fèi)。接觸法檢測(cè)的優(yōu)點(diǎn)是分辨率較高，但是表面吸附易飽和，檢測(cè)范圍受限，易污染，復(fù)用性不高，使用壽命短。且電極加壓后對(duì)溶液中分子有電離水解作用，不利于敏感檢測(cè)。在使用標(biāo)記法的過(guò)程中，標(biāo)記物與目標(biāo)DNA雜交，其空間結(jié)構(gòu)都發(fā)生了變化，發(fā)生空間阻礙效應(yīng)，從而影響結(jié)合效率
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種非接觸式電導(dǎo)法實(shí)現(xiàn)PCR反應(yīng)過(guò)程的實(shí)時(shí)檢測(cè)系統(tǒng)和方法，本發(fā)明的特征是用非傳統(tǒng)的非接觸式電導(dǎo)檢測(cè)方法(capacitively-coupled, contactless conductivity detection, C4D)代替?zhèn)鹘y(tǒng)的接觸式電化學(xué)方法,實(shí)現(xiàn)集成芯片上的PCR過(guò)程的實(shí)時(shí)檢測(cè)系統(tǒng)。非接觸式方法因?yàn)殡姌O不與電解液直接接觸，大大小減小了背景噪聲，可以達(dá)到更小的檢測(cè)限。另外也無(wú)直接接觸導(dǎo)致的電極表面產(chǎn)生氣泡的問(wèn)題。易集成，且電極和溶液都不易被污染，電極的復(fù)用性很高。目前文獻(xiàn)報(bào)道應(yīng)用于電泳芯片的非接觸式電極系統(tǒng)可達(dá)的檢測(cè)限在5X 10_8和1X10_7M之間。本發(fā)明是將非接觸式概念引入到集成的PCR擴(kuò)增及檢測(cè)芯片中，不僅大大簡(jiǎn)化了 PCR擴(kuò)增的體系(無(wú)需標(biāo)記物和探針)，而且又提高了電極的使用壽命，由此減少了設(shè)備的成本。而且系統(tǒng)所需的設(shè)備都十分簡(jiǎn)單，易集成，可在條件簡(jiǎn)陋的現(xiàn)場(chǎng)使用及便攜式應(yīng)用。本發(fā)明的目的是通過(guò)以下措施來(lái)達(dá)到基于微機(jī)電系統(tǒng)(MEMS)技術(shù)設(shè)計(jì)制造PCR 微芯片，并集成非接觸式電導(dǎo)檢測(cè)器，設(shè)計(jì)制作微米級(jí)甚至納米級(jí)介電絕緣層，顯著提高電導(dǎo)檢測(cè)器的靈敏度；PCR微芯片同時(shí)集成溫度傳感電極和加熱電極，基于差分信號(hào)放大原理和溫度補(bǔ)償原理，顯著提高讀出電路的分辨率和抗干擾能力；工作電極采用的是叉指電極結(jié)構(gòu)，每根電極均作為工作電極，因此它感應(yīng)的總體信號(hào)要遠(yuǎn)大于單電極，具有更高的檢測(cè)靈敏度和分辨率；本發(fā)明采用實(shí)際樣本進(jìn)行分析和驗(yàn)證所建立PCR反應(yīng)過(guò)程的非接觸式電導(dǎo)檢測(cè)方法。本發(fā)明提供了一種有效的檢測(cè)實(shí)時(shí)核酸擴(kuò)增過(guò)程的電化學(xué)檢測(cè)方法，通過(guò)該方法可以檢測(cè)待測(cè)核酸的初始濃度，且能在PC機(jī)上實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)核酸擴(kuò)增過(guò)程。用厚度為100 μ m 的蓋玻片作絕緣層做初步的實(shí)驗(yàn)，在以純化的DNA水溶液為檢測(cè)對(duì)象的實(shí)驗(yàn)中，只需10 μ L 的樣品體積，可達(dá)到O. Ipg/μ L的檢測(cè)下限和O. 5pg/yL的分辨率，且可區(qū)分單鏈或雙鏈 DNA (單鏈DNA的阻抗比雙鏈DNA大，同濃度雙鏈DNA產(chǎn)生的電壓差大于單鏈DNA)。隨著絕緣層厚度的減小和材料的優(yōu)化(納米級(jí)厚的氮化硅或二氧化硅)，該非接觸式檢測(cè)系統(tǒng)的靈敏度和分辨率預(yù)計(jì)可被改善到fg/ U L級(jí)以下。相應(yīng)地，fg/ μ L級(jí)水平的模板初始濃度的PCR反應(yīng)預(yù)計(jì)在溫度循環(huán)5min以?xún)?nèi)即可定性檢測(cè)到明顯的擴(kuò)增產(chǎn)物增加引起的電壓變化，非?？焖儆行АＳ靡阎牟煌跏紳舛鹊哪０暹M(jìn)行一系列的PCR擴(kuò)增反應(yīng)，記錄相同循環(huán)數(shù)內(nèi)產(chǎn)生的電壓差變化，制定標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，即可作為定量PCR的依據(jù)。實(shí)現(xiàn)該方法的系統(tǒng)易控制，操作簡(jiǎn)便，易集成，體積小，功耗小，成本低，檢測(cè)電極使用壽命長(zhǎng)。實(shí)現(xiàn)該方法的集成系統(tǒng)因?yàn)轶w積小，可將多個(gè)反應(yīng)腔和控制系統(tǒng)做在同一個(gè)裝置上，實(shí)現(xiàn)高通量并行檢測(cè)多個(gè)樣本，且易便攜化，可在現(xiàn)場(chǎng)應(yīng)用，有非常廣的應(yīng)用范圍。所述實(shí)時(shí)檢測(cè)系統(tǒng)包括基于MEMS集成的PCR微芯片、交流激勵(lì)電源、電流轉(zhuǎn)電壓及放大電路、溫度傳感電路、加熱電路、數(shù)模/模數(shù)轉(zhuǎn)換接口 DAQ及上位的Labview控制中心；其中，交流激勵(lì)電源連接PCR微芯片中的電化學(xué)檢測(cè)電極；加熱控制電路連接PCR微芯片中的加熱電極；電化學(xué)檢測(cè)電極另一端則與電流轉(zhuǎn)電壓及放大電路連接；溫度傳感電路連接PCR微芯片中的溫度傳感電極；溫度傳感電路、電流轉(zhuǎn)電壓放大電路又與模數(shù)/數(shù)模轉(zhuǎn)換接口 DAQ連接，模數(shù)/數(shù)模轉(zhuǎn)換接口 DAQ分別與上位機(jī)的Labview控制中心及加熱控制電路連接，所述的集成PCR微芯片集成了微反應(yīng)腔、溫度傳感電極和加熱電極以及電化學(xué)檢測(cè)電極，硅基底正面刻蝕微反應(yīng)腔，背面集成加熱電極和溫度傳感電極；電化學(xué)檢測(cè)電極為叉指電極，通過(guò)絕緣層與硅基底鍵合，與微反應(yīng)腔形成密閉結(jié)構(gòu)，通過(guò)控制硅基底背面的溫度傳感器電極和解熱電極實(shí)現(xiàn)擴(kuò)增反應(yīng)所需的溫度循環(huán)。本發(fā)明提供的非接觸式電導(dǎo)檢測(cè)實(shí)時(shí)核酸擴(kuò)增過(guò)程的方法與傳統(tǒng)的核酸擴(kuò)增電化學(xué)檢測(cè)法具有以下特點(diǎn)I、本發(fā)明采用非接觸式電導(dǎo)檢測(cè)，避免了檢測(cè)電極和待測(cè)對(duì)象之間的相互污染， 無(wú)需電極清洗重生等復(fù)雜步驟，操作簡(jiǎn)便，電極復(fù)用性高，使用壽命長(zhǎng)，且檢測(cè)結(jié)果可靠性聞。2、本發(fā)明電化學(xué)檢測(cè)電極采用叉指電極作為工作電極，檢測(cè)效率遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于普通的單工作電極。叉指電極的工作性能由叉指長(zhǎng)度、叉指間距、叉指數(shù)、有效工作面積等多種參數(shù)決定，通過(guò)多種方式的優(yōu)化都可再大大改進(jìn)叉指電極的檢測(cè)分辨率和靈敏度，升級(jí)方便。3、本發(fā)明采用等離子體增強(qiáng)化學(xué)汽相沉積(PECVD)技術(shù)濺射二氧化硅或氮化硅薄膜代替?zhèn)鹘y(tǒng)的聚二甲基硅氧烷(PDMS)材料和普通玻片來(lái)作電極的電介質(zhì)層和絕緣層， 既可起到隔離作用，又可使溶液和電極非常接近，減小絕緣層本身對(duì)電化學(xué)電導(dǎo)的貢獻(xiàn)，以提高靈敏度和分辨率，同時(shí)材料表面特性更適合PCR擴(kuò)增過(guò)程。4、本發(fā)明的單個(gè)反應(yīng)集成系統(tǒng)體積小、功耗小，將多個(gè)反應(yīng)腔和控制系統(tǒng)集成，可同時(shí)擴(kuò)增檢測(cè)多個(gè)DNA樣品，縮短檢測(cè)分析的時(shí)間，提高了檢測(cè)的信息通量。5、本發(fā)明的實(shí)現(xiàn)可采用微型化的電源和電路裝置，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，功耗低，電壓要求低，是一種便攜化檢測(cè)分析設(shè)備。6、本發(fā)明所述的溫度控制系統(tǒng)采用Labview完成，測(cè)溫電極的電阻信號(hào)轉(zhuǎn)換成電壓信號(hào)經(jīng)放大，該電壓信號(hào)通過(guò)數(shù)據(jù)采集卡進(jìn)行模數(shù)轉(zhuǎn)換成為數(shù)字電壓信號(hào)，并由Labivew 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析生成反饋信號(hào)，經(jīng)由數(shù)據(jù)卡的D/A功能輸出電壓控制加熱電極溫度的上升或下降。反饋信號(hào)可采用PID運(yùn)算控制等算法，可提高溫度控制的準(zhǔn)確性和智能化。7、本發(fā)明采用同時(shí)具有數(shù)模轉(zhuǎn)換和模數(shù)轉(zhuǎn)換功能的多功能數(shù)據(jù)卡，將電導(dǎo)信號(hào)、 溫度信號(hào)和溫度反饋信號(hào)與PC機(jī)的通訊集成在一起，簡(jiǎn)化整個(gè)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)。8、本發(fā)明由于采用了微機(jī)電系統(tǒng)(MEMS)技術(shù)制造微反應(yīng)室、加熱電極、溫度傳感器和非接觸式電導(dǎo)檢測(cè)器，其溫度控制裝置結(jié)構(gòu)和溫度控制程序簡(jiǎn)單，擴(kuò)增反應(yīng)迅速，電導(dǎo)檢測(cè)分辨率和靈敏度高，并且可由PC機(jī)控制軟件實(shí)現(xiàn)了整個(gè)反應(yīng)過(guò)程的程序化、智能化， 圖形化操作界面友好便于人機(jī)對(duì)話(huà)。


圖I.本發(fā)明的系統(tǒng)設(shè)計(jì)結(jié)構(gòu)示意圖。圖2.微集成芯片的結(jié)構(gòu)圖。其中，(A)PCR微芯片的截面示意圖；(B)反應(yīng)腔體結(jié)構(gòu)；(C)集成的溫度傳感器電極加熱電極結(jié)構(gòu)；(D)CD4用的叉指電極結(jié)構(gòu)。圖3.本發(fā)明中的信號(hào)轉(zhuǎn)換和調(diào)理電路。㈧溫度信號(hào)轉(zhuǎn)換及放大電路，Rsensor為溫度傳感器的電阻，Vsensor為溫度信號(hào)轉(zhuǎn)化并放大后的電壓信號(hào)，該端直接與DAQ的模數(shù)轉(zhuǎn)換輸入口相連；⑶芯片加熱控制電路，中間矩形框?yàn)殡妷赫{(diào)節(jié)器芯片，Vlfeatw為直接加載在加熱電極兩端的加熱電壓，V_tMl為控制電壓調(diào)節(jié)器芯片電壓開(kāi)斷的信號(hào)，與DAQ的數(shù)模轉(zhuǎn)換接口相連；(C)叉指電極的輸出信號(hào)轉(zhuǎn)換電路，Ii為叉指電極的輸出電流，V。為電流轉(zhuǎn)換并放大后的電壓信號(hào)，與DAQ的模數(shù)轉(zhuǎn)換接口相連。圖4. PC軟件控制的操作界面。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖描述本發(fā)明的具體實(shí)施方式
。圖I顯示的為本發(fā)明的整個(gè)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)裝置示意圖。該系統(tǒng)包括集成的PCR微芯片(虛線(xiàn)框內(nèi))、交流激勵(lì)電源、電流轉(zhuǎn)電壓及放大電路、溫度控制電路(傳感器信號(hào)轉(zhuǎn)換及放大和加熱控制)、數(shù)模/模數(shù)轉(zhuǎn)換接口(DAQ)及上位機(jī)的Labview控制中心。其中，集成的PCR微芯片結(jié)構(gòu)，集成了微反應(yīng)腔(B)、溫度傳感器電極和加熱電極 (C)、電化學(xué)檢測(cè)電極⑶等模塊(如圖2所示)。圖2中，㈧為結(jié)構(gòu)示意圖，該尺寸并非實(shí)際的尺寸，實(shí)際的集成的PCR微芯片平面尺寸為15_X12mm。各層中檢測(cè)電極、PCR反應(yīng)所在的腔體和集成的溫度控制電極的實(shí)際結(jié)構(gòu)和尺寸分別對(duì)應(yīng)(B)、(C)、(D)。(B)中反應(yīng)腔中心面積約為50mm2,2個(gè)圓形進(jìn)樣口半徑為Imm,微流體管道寬50μηι。(C)中的電極材料為金屬鉬。⑶中的叉指電極材料為金屬金，叉指寬3mm, 60mm長(zhǎng),相鄰叉指間距為9mm,圓形進(jìn)樣口半徑為2mm，鍵合時(shí)與⑶中的進(jìn)樣口對(duì)準(zhǔn)。圖㈧顯示共有兩層基底構(gòu)成。制作的方法是首先在雙拋光氧化的硅基底一面用光刻膠AZ4620將掩模板圖形化，顯影后用HF 溶液溶解裸露的SiO2,同時(shí)用膠或者藍(lán)膜保護(hù)未光刻的另外一面SiO2層；將腔體圖形表面的Si基底暴露出來(lái)，再用50% KOH在50°C恒溫水浴槽中刻蝕出具有一定深度的腔體。用丙酮除膠并重新干凈硅基底，另外一面用lift-off工藝制作Pt金屬電極(C)，作為集成的加熱電極和溫度傳感電極，用于實(shí)時(shí)精確的溫度控制。在電極支撐物(例如普通玻璃片) 表面用同樣的lift-off工藝制作金電極作為電化學(xué)檢測(cè)電極(D)并打孔作為進(jìn)出樣口，然后用標(biāo)準(zhǔn)工藝在此電極表面生長(zhǎng)很簿的Si3N4或SiO2層作為絕緣層。叉指電極面與硅基底的微反應(yīng)腔體面通過(guò)紫外膠鍵合，兩基底的圓形進(jìn)樣口分別對(duì)準(zhǔn)，這樣就可與微反應(yīng)室形成密閉結(jié)構(gòu)。(C)和(D)中電極通過(guò)焊接點(diǎn)上的金屬引線(xiàn)與外圍控制電路相連。在實(shí)際檢測(cè)中，兩個(gè)微集成芯片同時(shí)進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)并實(shí)時(shí)檢測(cè)兩路的電導(dǎo)信號(hào)。如圖I中所示，交流激勵(lì)源產(chǎn)生35kHz、IOV的正弦電壓，接入叉指電極使其產(chǎn)生感應(yīng)電流。此感應(yīng)電流不能直接被數(shù)據(jù)卡采集，因此需要通過(guò)簡(jiǎn)單的運(yùn)算放大器電路(圖3C) 轉(zhuǎn)換成電壓信號(hào)。因?yàn)殡娙蓠詈袭a(chǎn)生的電流較小，轉(zhuǎn)換成的電壓信號(hào)也較微弱，不能直接測(cè)量。通過(guò)調(diào)節(jié)圖3C的電阻R阻值實(shí)現(xiàn)合適倍數(shù)的放大，這樣轉(zhuǎn)化后的電壓才能控制在數(shù)據(jù)采集卡的采樣范圍和采樣精度之內(nèi)。為避免高頻交流信號(hào)之間互相干擾，叉指電極的激勵(lì)信號(hào)線(xiàn)與信號(hào)讀出線(xiàn)盡量遠(yuǎn)離并相互隔離。調(diào)理后的電壓信號(hào)通過(guò)高性能接口 DAQ(采樣頻率至少為500kHz,幅度-IOV 10V)采樣被傳輸至上位機(jī)的Labview控制中心,進(jìn)行去噪、濾波、波形檢測(cè)等數(shù)字處理，最后以極微小的延時(shí)顯示當(dāng)前的微芯片中溶液的電導(dǎo)變化引起的電壓變化。檢測(cè)樣品中，PCR擴(kuò)增的進(jìn)行同時(shí)引起各種離子的釋放，從而引起溶液電導(dǎo)的變化，產(chǎn)生感應(yīng)電流的差值。所以上位機(jī)的Labview控制中心顯示的信號(hào)差實(shí)時(shí)反應(yīng)了 PCR擴(kuò)增情況。圖I中的溫度控制模塊實(shí)現(xiàn)信號(hào)轉(zhuǎn)換和信號(hào)調(diào)理功能，由圖3A的橋式電路及信號(hào)放大電路組成。隨著芯片溫度的變化，芯片上的Pt溫度傳感器電阻也產(chǎn)生線(xiàn)性變化，該電阻變化通過(guò)橋式電路轉(zhuǎn)化成電壓信號(hào)。但是該電壓信號(hào)較微弱，不能直接測(cè)量，因此電壓信號(hào)同樣需要放大到DAQ的采樣范圍和精度之內(nèi)；上位機(jī)的Labview控制中心對(duì)經(jīng)DAQ 采集的溫度信號(hào)進(jìn)一步通過(guò)低通濾波電路去除背景噪聲，提高了電壓信號(hào)的信噪比；最終將處理過(guò)的數(shù)字電壓將信號(hào)還原成溫度傳感器檢測(cè)的溫度信號(hào)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)芯片溫度的測(cè)定。接著上位機(jī)的Labview控制中心以此溫度信號(hào)為輸入反饋信號(hào)，根據(jù)標(biāo)定的溫度循環(huán)的要求計(jì)算，通過(guò)脈沖調(diào)制算法(PWM)得到電極加熱的控制信號(hào)，經(jīng)過(guò)DAQ形成模擬信號(hào)供給電壓調(diào)節(jié)器(圖3B);電壓調(diào)節(jié)器控制加載在加熱電極兩端的電壓開(kāi)斷時(shí)間，從而調(diào)節(jié)功率，實(shí)現(xiàn)不同速率的溫度升降。PWM算法可以保證溫度的快速升溫，防止溫度過(guò)沖并穩(wěn)定溫度。直流電源由集成的DC/DC模塊直接供電。系統(tǒng)的模擬電路部分(圖3)都集成在一個(gè)約15cmX IOcm大的PCB板上，并通過(guò)屏蔽盒與外界隔離，有效抵制外界干擾。圖4顯示的是本發(fā)明中上位機(jī)的Labview控制中心操作界面。叉指電極的信號(hào)流與溫度調(diào)控信號(hào)通過(guò)同一個(gè)多路DAQ與上位機(jī)相連,并由Labview控制中心對(duì)數(shù)據(jù)采集卡實(shí)現(xiàn)分時(shí)復(fù)用功能，保證多通道工作的前提下又能在單通道實(shí)現(xiàn)較高采樣率。數(shù)字信號(hào)的濾波、計(jì)算等處理都在Labview程序后端平臺(tái)進(jìn)行，并未在操作界面顯示?？刂平缑嬗糜跍囟瓤刂频膯?dòng)、實(shí)際溫度的顯示和PCR過(guò)程電壓變化的實(shí)時(shí)顯示及存儲(chǔ)等操作，非常直觀且操作非常簡(jiǎn)便。系統(tǒng)操作步驟I、微反應(yīng)腔體先用O. 5% (質(zhì)量)的BSA溶液注滿(mǎn)半封閉I小時(shí)，可以減少PCR反應(yīng)物的被吸附，提高芯片PCR的反應(yīng)效率。2、將BSA抽取干凈，用氣動(dòng)進(jìn)樣方式將反應(yīng)混合物注入微反應(yīng)腔，進(jìn)出口用石蠟油或PDMS密封，防止溫度循環(huán)過(guò)程中樣品的揮發(fā)。一個(gè)微芯片加入帶有模 板的PCR反應(yīng)混合物。另外一個(gè)微芯片加不帶模板的PCR反應(yīng)混合物，作為陰性對(duì)照樣本。進(jìn)樣品用石蠟油或礦物油密封。3、運(yùn)行Labview程序，看到穩(wěn)定的溫度和電壓波形顯示后，選擇存儲(chǔ)的文件地址， 然后啟動(dòng)溫度控制功能，即可進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，并將實(shí)時(shí)檢測(cè)的電導(dǎo)信號(hào)變化顯示及存儲(chǔ)。PCR擴(kuò)增反應(yīng)無(wú)需標(biāo)記物和探針。4、可根據(jù)反應(yīng)結(jié)果自主選擇反應(yīng)結(jié)束的時(shí)間。停止溫度控制后，將反應(yīng)混合物從微腔體中抽取，再用緩沖液和去離子水多次清洗微腔。因?yàn)殡姌O不與檢測(cè)樣本直接接觸，所以電極的性能一直保持不變，則腔體清洗后的芯片即可用于下一次的檢測(cè)。
權(quán)利要求
1.一種非接觸式電導(dǎo)法實(shí)現(xiàn)PCR過(guò)程的實(shí)時(shí)檢測(cè)系統(tǒng)，其特征在于包括基于MEMS集成的PCR微芯片、交流激勵(lì)電源、電流轉(zhuǎn)電壓及放大電路、溫度傳感電路、加熱電路、數(shù)模/模數(shù)轉(zhuǎn)換接口 DAQ及上位的Labview控制中心；其中，交流激勵(lì)電源連接PCR微芯片中的電化學(xué)檢測(cè)電極；加熱控制電路連接PCR微芯片中的加熱電極；電化學(xué)檢測(cè)電極另一端則與電流轉(zhuǎn)電壓及放大電路連接；溫度傳感電路連接PCR微芯片中的溫度傳感電極；溫度傳感電路、電流轉(zhuǎn)電壓放大電路又與模數(shù)/數(shù)模轉(zhuǎn)換接口 DAQ連接，模數(shù)/數(shù)模轉(zhuǎn)換接口 DAQ分別與上位機(jī)的Labview控制中心和加熱控制電路連接，所述的集成PCR微芯片集成了微反應(yīng)腔、溫度傳感電極和加熱電極以及電化學(xué)檢測(cè)電極，硅基底正面刻蝕微反應(yīng)腔，背面集成加熱電極和溫度傳感電極；電化學(xué)檢測(cè)電極為叉指電極，通過(guò)絕緣層與硅基底鍵合，與微反應(yīng)腔形成密閉結(jié)構(gòu)，通過(guò)控制硅基底背面的溫度傳感器電極和加熱電極實(shí)現(xiàn)擴(kuò)增反應(yīng)所需的溫度循環(huán)。
2.按權(quán)利要求I所述的系統(tǒng)，其特征在于電化學(xué)檢測(cè)電極與硅基體的微反應(yīng)腔體通過(guò)紫外膠鍵合，兩基底的圓形進(jìn)口分別對(duì)準(zhǔn)，叉指電極通過(guò)焊接點(diǎn)上的金屬引線(xiàn)與外圍電流轉(zhuǎn)電壓放大電路相連。
3.按權(quán)利要求I所述的系統(tǒng)，其特征在于①交流激勵(lì)電源產(chǎn)生35KHz、10V的正弦電壓，接入叉指電極產(chǎn)生感應(yīng)電流；感應(yīng)電流信號(hào)通過(guò)電流轉(zhuǎn)電壓電路轉(zhuǎn)換并放大成可被數(shù)據(jù)采集卡檢測(cè)的電壓信號(hào)；②所述的接口DAQ采樣頻率至少為500KHz，幅度為-IOV 10V。
4.按權(quán)利要求I所述的系統(tǒng)，其特征在于(a)所述的集成的PCR微芯片尺寸為15mmX12mm ；(b)所述的微反應(yīng)腔的面積為50mm2,微流體管道寬50μ m。
5.按權(quán)利要求I或2所述的系統(tǒng)，其特征在于所述的叉指電極材料為金，叉指寬為 3mm,長(zhǎng)為60mm,相鄰叉指間距為9mm,圓形進(jìn)樣口半徑為2mm,鍵合時(shí)與反應(yīng)腔體進(jìn)樣口對(duì)準(zhǔn)。
6.按權(quán)利要求3所述的系統(tǒng)，其特征在于檢測(cè)的電壓信號(hào)被送入上位機(jī)的Labview控制中心，進(jìn)行去噪、濾波、波形檢測(cè)處理，最后以極微小的延時(shí)顯示當(dāng)前的微芯片中溶液的電導(dǎo)變化引起的電壓變化；檢測(cè)中，PCR擴(kuò)增的進(jìn)行同時(shí)引起各種離子的釋放，從而引起溶液電導(dǎo)的變化，產(chǎn)生感應(yīng)電流的差值，上位機(jī)的Labview控制中心顯示的信號(hào)差實(shí)時(shí)反應(yīng)了 PCR擴(kuò)增情況。
7.按權(quán)利要求I或6所述的系統(tǒng),其特征在于上位機(jī)的Labview控制中心采集到溫度信號(hào)后，根據(jù)標(biāo)定的溫度循環(huán)的要求，通過(guò)PWM脈沖調(diào)制算法，給出加熱電極的電壓控制； PWM算法保證溫度的快速升溫，防止溫度過(guò)沖并穩(wěn)定溫度。
8.使用按權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)所述的系統(tǒng)的方法，其特征在于操作步驟是(1)微反應(yīng)腔膠體先用O.5%的BSA注滿(mǎn)半封閉I小時(shí)，減少PCR反應(yīng)物的被吸附，提高芯片PCR的反應(yīng)效率；(2)將BSA抽取干凈，用氣動(dòng)進(jìn)樣方式將反應(yīng)混合物注入微反應(yīng)腔，進(jìn)出口用石蠟油或 PDMS密封，防止溫度循環(huán)過(guò)程中樣品的揮發(fā)；一個(gè)微芯片加入帶有模板的PCR反應(yīng)混合物； 另外一個(gè)微芯片加不帶模板的PCR反應(yīng)混合物，作為陰性對(duì)照樣本；進(jìn)樣品用石蠟油或礦物油密封；(3)運(yùn)行上位機(jī)的Labview控制中心，當(dāng)顯示穩(wěn)定的溫度和電壓波形后，選擇存儲(chǔ)的文件地址，然后啟動(dòng)溫度控制功能，即可進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，并將實(shí)時(shí)檢測(cè)的電導(dǎo)信號(hào)變化顯示及存儲(chǔ)；(4)根據(jù)反應(yīng)結(jié)果自主選擇反應(yīng)結(jié)束的時(shí)間；停止溫度控制后，將反應(yīng)混合物從微腔體中抽取，再用緩沖液和去離子水多次清洗微腔；因?yàn)殡姌O不與檢測(cè)樣本直接接觸，所以電極的性能一直保持不變，則腔體清洗后的芯片即可用于下一次的檢測(cè)。
9.按權(quán)利要求8所述的系統(tǒng)使用方法，其特征在于步驟(3)中PCR擴(kuò)增反應(yīng)無(wú)需標(biāo)記物和探針。
全文摘要
本發(fā)明涉及非接觸式電導(dǎo)法實(shí)現(xiàn)PCR過(guò)程的實(shí)時(shí)檢測(cè)系統(tǒng)和方法，其特征在于所述系統(tǒng)包括基于MEMS集成的PCR微芯片、交流激勵(lì)電源、電流轉(zhuǎn)電壓及放大電路、溫度傳感電路、加熱電路、數(shù)模/模數(shù)轉(zhuǎn)換接口DAQ及上位的Labview控制中心；所述的集成PCR微芯片集成了微反應(yīng)腔、溫度傳感電極和加熱電極以及電化學(xué)檢測(cè)電極，硅基底正面刻蝕微反應(yīng)腔，背面集成加熱電極和溫度傳感電極；電化學(xué)檢測(cè)電極為叉指電極，通過(guò)絕緣層與硅基底鍵合，與微反應(yīng)腔形成密閉結(jié)構(gòu)，通過(guò)控制硅基底背面的溫度傳感電極和加熱電極實(shí)現(xiàn)擴(kuò)增反應(yīng)所需的溫度循環(huán)。本發(fā)明所述的檢測(cè)系統(tǒng)的靈敏度和分辨率可達(dá)fg/μL以下，電極復(fù)用性高，使用壽命長(zhǎng)、檢測(cè)結(jié)果可靠性高。
文檔編號(hào)C12M1/34GK102604827SQ20121009310
公開(kāi)日2012年7月25日 申請(qǐng)日期2012年3月31日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月31日
發(fā)明者張洹千, 方新心, 景奉香, 趙建龍, 金慶輝 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院上海微系統(tǒng)與信息技術(shù)研究所