專利名稱：一種克服靶細菌限制修飾障礙導入外源dna的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生物技術領域，尤其涉及一種克服靶細菌限制修飾障礙導入外源DNA的方法。
背景技術：
細菌限制修飾系統由限制性內切酶(限制酶)與DNA甲基轉移酶組成，前者能夠特異性識別并切割DNA，后者能夠向DNA的堿基添加一個甲基修飾，從而防止限制酶對DNA的切割。限制修飾系統能夠選擇性的降解侵入細菌內部的外源DNA，實現細菌自我保護的目的。根據限制修飾系統的亞基組成、切割位點、序列特異性與輔因子特征，將其劃分為四大類型。I型、II型和III型限制修飾系統的限制酶亞基能夠識別并切割未甲基化的DNA，但如果DNA首先被甲基轉移酶亞基識別并修飾后，限制酶即不能完成切割。IV型限制修飾 系統只有限制酶組成，不含甲基轉移酶，它識別并切割具有外源甲基化模式的DNA，因此，是一種甲基化依賴的限制酶。另外，最近研究表明DNA骨架的磷硫酰修飾酶及其對應的限制酶是一類新型的限制修飾系統(Nucleic Acids Research, 38, 7133-7141)。這種復雜的修飾-切割模式，極大的保護了細菌自身DNA的安全性，是細菌作為有效防止噬菌體、環(huán)境中死細菌釋放的DNA等外源DNA入侵的主要手段。同時，這也成為現今利用分子生物學手段將外源DNA導入細菌、實現遺傳操作的主要障礙。含有多套限制修飾系統細菌的遺傳操作尤為困難。迄今為止研究人員發(fā)明了兩類技術克服限制修飾障礙。第一類策略即修飾外源DNA的策略，包括體外修飾和大腸桿菌體內修飾。如利用靶細菌粗蛋白抽提物(含有DNA甲基轉移酶)體外修飾外源DNA，能夠實現對幽門螺桿菌、蠟樣芽胞桿菌和韋氏芽胞桿菌的轉化(MolecularMicrobiology,37,1066-1074,Applied and Environmental Microbiology,74,7817-7820);或在大腸桿菌中克隆表達靶細菌DNA甲基轉移酶，體內修飾外源質粒DNA，如在大腸桿菌TOPlO中克隆表達青春棒桿菌的兩個DNA甲基轉移酶，進行穿梭質粒的體內修飾，實現了青春棒桿菌的遺傳轉化(Nucleic Acids Research, 37, e3)。第二類方法即滅活限制修飾系統的方法，包括利用物理手段滅活和基因敲除。利用轉化后加熱的方法暫時性滅活靶細菌限制酶，外源質粒對谷氨酸棒桿菌轉化率提高至IO8CFUz^g DNA (MicrobialBiotechnology, 52, 541-545);敲除丙酮丁醇梭菌CAC1502基因后可以使其接受非甲基化質粒DNA(PLoS 0NE,5,e9038);但也有報道表明敲除SauI限制性內切酶不足以使金黃色葡萄球菌接受外源 DNA (Applied and Environmental Microbiology, 75, 3034-3038)。雖然上述技術可以在一定程度上提高外源DNA對靶細菌的轉化率，但是還存在以下問題和不足之處部分方案雖然能夠利用靶細菌DNA甲基轉移酶在體外修飾外源DNA分子，但利用粗蛋白抽提物的體外修飾效率較低，且在修飾的同時限制酶也會降解部分質粒；體內修飾方案未解除大腸桿菌自身DNA甲基轉移酶對外源DNA分子的甲基化，這種帶有大腸桿菌甲基化模式的DNA易激活靶細菌的III型限制系統；許多細菌的限制酶為非熱敏感性，不能利用加熱手段暫時滅活；如果細菌含有多套限制修飾系統時，逐個敲除限制酶基因費時費力，同時敲除限制酶還造成靶細菌易受噬菌體感染，對工業(yè)微生物發(fā)酵菌種的構建極為不利；技術的通用性不強，可能僅適用于一種或少數幾種細菌

發(fā)明內容
本發(fā)明的一個目的是提供一種將外源DNA分子導入靶細菌的方法。本發(fā)明提供的方法，包括如下步驟I)將靶細菌基因組中所有DNA甲基轉移酶編碼基因在自身限制修飾系統缺失的大腸桿菌中共表達，得到重組菌A ；2)將外源DNA分子導入所述重組菌A進行體內修飾，得到甲基化修飾的外源DNA分子;
3)將所述甲基化修飾的外源DNA分子導入所述靶細菌中。上述方法中，步驟I)中，所述將靶細菌基因組中所有的DNA甲基轉移酶編碼基因在自身限制修飾系統缺失的大腸桿菌中共表達為將所述靶細菌基因組中所有的DNA甲基轉移酶編碼基因通過重組載體導入所述自身限制修飾系統缺失的大腸桿菌內；步驟2)包括如下步驟A)將所述外源DNA分子導入所述重組菌A中，得到重組菌B ;B)誘導培養(yǎng)所述重組菌B，得到誘導后重組菌B ；C)提取所述誘導后重組菌B的DNA，即得到甲基化修飾的外源DNA分子。上述方法中，步驟I)中，所述重組載體為將所述所有DNA甲基轉移酶編碼基因均插入pWYE724質粒中，得到共表達所有DNA甲基轉移酶的重組載體；上述重組載體中的每個DNA甲基轉移酶編碼基因可以使用各自的啟動子或共用一個啟動子(構成操縱子的結構)。步驟2)的B)中，所述誘導培養(yǎng)采用的誘導劑為阿拉伯糖。上述方法中，步驟2)的B)中，所述誘導培養(yǎng)為將所述重組菌B在含有終濃度為0.2% (質量百分含量)的阿拉伯糖的液體培養(yǎng)基中誘導培養(yǎng)；所述誘導培養(yǎng)的溫度為25°C _37°C，所述誘導培養(yǎng)的時間為3-24小時；所述誘導培養(yǎng)的溫度具體為30°C，所述誘導培養(yǎng)的時間具體為12小時。上述方法中，所述靶細菌為含有限制修飾系統的真細菌或古生菌，所述含有限制修飾系統的真細菌或古生菌具體為解淀粉芽胞桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)TA208、臘樣芽胞桿菌(Bacillus cereus)ATCC 10987 或漢氏硝化細菌(Nitrobacterhamburgensis)X14 ；所述自身限制修飾系統缺失的大腸桿菌具體為大腸桿菌(Escherichiacoli)EC135CGMCCN0. 5925 ;其限制修飾系統基因型為 mcrAA (mrr-hsdRMS-mcrBC)Δdcm::FRTΔdam::FRT。上述方法中，所述外源DNA 分子為 pAD123、pAD43_25、pMK3、pMK4、pHCMC02、PHCMC04、pDG148StuI、pWYE748 或 pBBRl-MCSS-P^^ 345Q-GFP。上述方法中，所述解淀粉芽胞桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)TA208中所有 DNA 甲基轉移酶編碼基因為 BAMTA208_06525、BAMTA208_6715、BAMTA208_19835和 BAMTA208_16660 ；所述 BAMTA208_06525、BAMTA208_6715、BAMTA208_19835 和BAMTA208_16660的核苷酸序列依次為序列表中的序列2、序列3、序列4和序列5 ；所述蠟樣芽胞桿菌(Bacillus cereus)ATCC 10987中所有DNA甲基轉移酶編碼基因為 BCE_0393、BCE_4605、BCE_5606、BCE_5607、BCE_0365 和 BCE_0392 ;所述 BCE_0393、BCE_4605、BCE_5606、BCE_5607、BCE_0365和BCE_0392的核苷酸序列依次為序列表中的序列6、序列7、序列8、序列9、序列10和序列11 ；所述漢氏硝化細菌(Nitrobacter hamburgensis)X14中所有DNA甲基轉移酶編碼基因為 Nham_0569、Nham_0582、Nham_0803 和 Nham_3225 ;所述 Nham_0569、Nham_0582、Nham_0803和Nham_3225的核苷酸序列依次為序列表中的序列12、序列13、序列14和序列15。
在上述方法前還包括確定靶細菌基因組中所有DNA甲基轉移酶編碼基因的步驟(a)通過同源序列比對等方法，預測靶細菌中編碼DNA甲基轉移酶的基因；(b)將預測的所有編碼DNA甲基轉移酶的基因分別連入可誘導的表達載體，再轉入自身限制修飾系統缺失的大腸桿菌中，然后分別誘導培養(yǎng)。(C)分別制備上述轉入表達載體的大腸桿菌的基因組DNA (包括染色體DNA與表達載體)，檢測DNA是否含已被甲基化修飾，如果確定DNA已被甲基化修飾，即證明預測的DNA甲基轉移酶確實具有DNA甲基化修飾功能，并且其蛋白在大腸桿菌中具有活性。檢測方法包括高效液相色譜法和DNA點雜交方法。上述DNA甲基轉移酶，包括I型、II型與III型甲基轉移酶，I型DNA甲基轉移酶應包括甲基轉移亞基與DNA識別亞基。其中所述可誘導的表達載體，可以是低拷貝，也可以是高拷貝載體，但應與轉化靶細菌的穿梭/整合質粒能夠相容。甲基轉移酶的啟動子可以是其自身的啟動子，也可以是在大腸桿菌中可誘導型的啟動子，包括但不局限于阿拉伯糖誘導啟動子、IPTG誘導型啟動子和鼠李糖誘導啟動子。甲基轉移酶誘導溫度為8°C -43°C。其中所述自身限制修飾系統缺失的大腸桿菌為已知的限制酶、DNA甲基轉移酶完全缺失的大腸桿菌，這些酶包括但不局限于Dam、Dcm、EcoKI> Mrr> McrA和Mrr。本發(fā)明的另一個目的是提供一株大腸桿菌(Escherichia coli)EC135。本發(fā)明提供的大腸桿菌，其保藏編號為CGMCC NO. 5925。菌株EC135于2012年3月21日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCCJia :北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所，郵編100101)，保藏號為CGMCC No. 5925，其分類命名為大腸埃希氏菌(Escherichia coli)。其中所述轉化靶細菌的方法，因選擇的靶細菌不同而異，包括但不局限于化學轉化法、接合轉移、電轉化法及原生質體轉化法。本發(fā)明的實驗證明，本發(fā)明與現有的克服細菌限制修飾障礙，實現遺傳操作的方法相比，優(yōu)點在于I.使用一株自身限制修飾系統完全缺失的大腸桿菌作為宿主，一方面克服了大腸桿菌修飾模式(Dam、Dcm和EcoKI)對靶細菌IV型限制修飾系統的激活作用，另一方面，大腸桿菌Mrr、McrA和McrBC的缺失有利于靶細菌DNA甲基轉移酶的克隆表達；2.對靶細菌所有的DNA甲基轉移酶進行共表達，真正實現靶細菌DNA甲基化模式的精確模擬；
3.使用的是在大腸桿菌體內DNA甲基化修飾的方式，在培養(yǎng)細菌的過程中同時完成，無需額外的體外反應，無需添加甲基化反應底物，方便快捷；4.在本發(fā)明中可使用釀酒酵母組裝多個甲基轉移酶基因，共表達質粒的構建可在一周內完成，加速了靶細菌限制修飾障礙克服的過程；5.利用本方法得到的靶細菌轉化子，其限制修飾系統與出發(fā)菌株一致。本方法不會對靶細菌原有的限制修飾系統造成損傷；6.本發(fā)明具有很強的通用性，已成功應用于兩株芽胞桿菌，一株革蘭氏陰性、化能自養(yǎng)細菌的遺傳操作，并有望擴展至更多的細菌種屬。本發(fā)明對于含有多套限制修飾系統的頑固型細菌遺傳操作系統構建具有重要意義。


圖I為TOPlOdcm基因敲除PCR檢測結果圖2為EC135dam基因敲除PCR檢測結果圖3為解淀粉芽胞桿菌TA208DNA甲基轉移酶基因PCR擴增結果圖4為點雜交檢測解淀粉芽胞桿菌TA208DNA甲基轉移酶活性圖5為pWYE724質粒圖譜圖6為EcoRV單切檢測pM. Bam電泳7為pM. Bam質粒圖譜圖8為不同宿主制備的穿梭質粒對解淀粉芽胞桿菌ΤΑ208的轉化效率(*未檢測到)圖9為解淀粉芽胞桿菌TA208upp基因敲除PCR驗證結果圖10為解淀粉芽胞桿菌ΤΑ208和BS043在MM、MM+5-FU培養(yǎng)基生長情況圖11為點雜交檢測蠟樣芽胞桿菌ATCC 10987DNA甲基轉移酶活性圖12為HindIII單切檢測pM. Bce電泳圖
圖13為pM. Bce質粒圖譜圖14為不同宿主制備的穿梭質粒對蠟樣芽胞桿菌ATCC 10987的轉化效率(*未檢測到)圖15為點雜交檢測漢氏硝化細菌X14DNA甲基轉移酶活性圖16為BamHI單切檢測pM. Nham電泳17為pM. Nham質粒圖譜圖18為綠色熒光蛋白在漢氏硝化細菌Χ14中的表達
具體實施例方式以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。以下實施例中的定量試驗，均設置三次重復實驗，結果取平均值。實施例I、限制修飾系統完全缺失的大腸桿菌EC135的構建
以大腸桿菌T0P10 (北京全式金生物技術有限公司，貨號為⑶101)為出發(fā)菌株，依次敲除dcm基因(Dcm甲基化酶編碼基因)，將染色體recA基因突變?yōu)橐吧停贸齞am基因(Dam甲基化酶編碼基因)得到大腸桿菌EC135，具體如下制備T0P10菌株的感受態(tài)細胞，將質粒pKD46(購自美國Coli Genetic StockCenter,以下簡寫為CGSC，編號7739)轉化入T0P10菌株，30°C篩選氨芐青霉素抗性轉化子，得到 T0P10/pKD46o利用引物WB089與WB090，以pKD3質粒(購自美國CGSC，編號7631)為模板擴增氯霉素抗性基因，切膠回收1166bp，得到氯霉素抗性基因PCR產物。將T0P10/pKD46菌株在LB培養(yǎng)基中30°C培養(yǎng)，在OD6tltl為O. 2時加入終濃度IOOmM的阿拉伯糖誘導I小時，制備感受態(tài)后利用5μ L回收的氯霉素抗性基因PCR產物轉化 40 μ L感受態(tài)細胞，30°C復蘇I小時后將復蘇產物涂布于含有34 μ g/mL氯霉素的LB平板，37 °C培養(yǎng)過夜。挑選重組子，利用引物WB064和WB065進行菌落PCR鑒定。陽性重組子PCR產物大小應為1816bp，而原始基因大小為1980bp。挑取陽性重組子，在LB液體培養(yǎng)基中42°C連續(xù)培養(yǎng)三代，以消除pKD46質粒，得到TOPlOdcm: :CmR菌株。稀釋涂布平板后挑取單菌落TOPlOdcm: : CmR菌株制備電轉感受態(tài)，將pCP20 (購自美國CGSC，編號7629)質粒轉化入TOPlOdcm: : CmR菌株，篩選氨芐青霉素抗性重組子后挑單菌落在不含抗生素的LB培養(yǎng)基中30°C培養(yǎng)至0D_為O. 2，然后提高溫度至42°C培養(yǎng)過夜。稀釋菌液后涂布無抗性的LB平板，挑取單菌落利用引物WB064和WB065進行菌落PCR鑒定。氯霉素抗性基因消除的陽性重組子擴增產物應為大小應為886bp (圖I)，將陽性重組子命名為 TOPlOAdcm: :FRT。由于dam與recA雙突變是致死基因型，因此在敲除dam基因之前要先回復突變recAl基因。利用引物WB253和WB254，以大腸桿菌W3110 (購自美國CGSC，編號4474)染色體DNA為模板擴增野生型recA基因(1236bp),連接至載體pKOV (購自美國Addgene,貨號#25769)的 NotI 與 BamHI 位點，得到 pKOV-recA。將 pKOV-recA 轉化入 T0P10 Δ dcm: :FRT菌株，30°C篩選氯霉素抗性轉化子，挑取轉化子后在42°C液體LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，并涂布含有氯霉素的LB平板，使pKOV-recA整合至染色體recAl位點。得到單菌落后利用引物WB255和WB256進行菌落PCR，如果有大于7Kb的PCR條帶，即說明pKOV-recA已整合至染色體。挑取正確的重組子，42°C培養(yǎng)后涂布于含有10%蔗糖的LB平板，將單菌落在含有氯霉素和不含氯霉素的LB平板上劃線同時傳代，挑選氯霉素敏感的菌落。利用引物WB255和WB256擴增recA基因后測序，recA+重組子recA基因第482位堿基應為G，而T0P10菌株為A。dam基因的敲除與dcm敲除步驟相同，所用的氯霉素抗性基因擴增引物為WB087和WB088，外側檢測引物為WB062和WB063?；蚯贸髷U增產物大小為740bp，原始基因大小為 1356bp(圖 2)。經過上述三步遺傳操作，所得到的dcm dam缺失、recA回復突變的菌株即為EC135。上述提到的菌株EC135于2012年3月21日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCCjia :北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所，郵編100101)，保藏號為CGMCC No. 5925，其分類命名為大腸埃希氏菌(Escherichiacoli)。
所用到的PCR弓丨物序列見表I。表I、本發(fā)明所使用的PCR弓丨物

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引物名稱引物序列(5’ -3’ )
WB089CTAAATGGCTGTAATTATGTTAACCTGTCGGCCATCTCAGATGGCCGGTGAAATCTTTGAGCGATTGTGTAGGCTGGAG
WB090ACCGGAATACGGAATTTCGCTTCTCCCGGCGCTTCAAAACCCATTAAGCGCGCGCATAACGGCTGACATGGGAATTAGC
WB064TGCTGAAGCTACCGCAAACCATG
WB065GCACTCCCAGACAATCAATACGC
WB253ATAAGAATGCGGCCGCCACTTGATACTGTATGAGCATACAG
WB254CGCGGATCCCGGGATGTTGATTCTGTCATGGCAT
WB255ATTACCCGGCGGGAATGCTTCAG
WB256TTTACGTCGCAGTTCTTGCTCAC
WB087CTGGATGCTGTCGGAGCTTTCTCCACAGCCGGAGAAGGTGTAATTAGTTAGTCAGCTTGAGCGATTGTGTAGGCTGGAG
WB088ACTTTGACGACATGCAATTTTGCGCGCTGATACCACTCACGCGTTAACATCGTATCTAACGGCTGACATGGGAATTAGC
WB062GGCCGATCTGAAGTAATCAAGGT
WB063TCCAGATAGCTCAGAGGTGTCGC
WB325ATGCCATAGCATTTTTATCC
WR475CGTAGTTTATTCATGAATTCCTCCTTCAACTATGTACTTGAGGTAATCGA
WB476TCGATTACCTCAAGTACATAGTTGAAGGAGGAATTCATGAATAAACTACG
WB477TTATTGCTGTTCATGAATTCCTCCTTTATTCAGATTCTTTATTATCGTAT
WB478ATACGATAATAAAGAATCTGAATAAAGGAGGAATTCATGAACAGCAATAA
WB479GAAAAAAAACGCATGAATTCCTCCTTTATTCTAAATCTAATAATTCATTT
WB480AAATGAATTATTAGATTTAGAATAAAGGAGGAATTCATGCGTTTTTTTTC
WB326GATTTAATCTGTATCAGGWB325
WB575ATACAGTTCATATGTCTTACCTCCTTTAATCGGCGGTATTTTGTGTAGAT
WB576ATCTACACAAAATACCGCCGATTAAAGGAGGTAAGACATATGAACTGTAT
WB577TTTAAACATATAACACTTTCCTCCTTTACGCTTCTAATGTCTCTCGAATG
WB578CATTCGAGAGACATTAGAAGCGTAAAGGAGGAAAGTGTTATATGTTTAAA

權利要求
1.一種將外源DNA分子導入靶細菌的方法，包括如下步驟 .1)將靶細菌基因組中所有DNA甲基轉移酶編碼基因在自身限制修飾系統缺失的大腸桿菌中共表達，得到重組菌A ; .2)將外源DNA分子導入所述重組菌A進行體內修飾，得到甲基化修飾的外源DNA分子； .3)將所述甲基化修飾的外源DNA分子導入所述靶細菌中。
2.根據權利要求I所述的方法，其特征在于 步驟I)中，所述將靶細菌基因組中所有的DNA甲基轉移酶編碼基因在自身限制修飾系統缺失的大腸桿菌中共表達為將所述靶細菌基因組中所有的DNA甲基轉移酶編碼基因通過重組載體導入所述自身限制修飾系統缺失的大腸桿菌內； 步驟2)包括如下步驟 A)將所述外源DNA分子導入所述重組菌A中，得到重組菌B； B)誘導培養(yǎng)所述重組菌B，得到誘導后重組菌B; C)提取所述誘導后重組菌B的DNA，即得到甲基化修飾的外源DNA分子。
3.根據權利要求I或2所述的方法，其特征在于 步驟I)中，所述重組載體為將所述所有DNA甲基轉移酶編碼基因均插入PWYE724質粒中，得到共表達所有DNA甲基轉移酶的重組載體； 步驟2)的B)中，所述誘導培養(yǎng)采用的誘導劑為阿拉伯糖。
4.根據權利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于 步驟2)的B)中，所述誘導培養(yǎng)為將所述重組菌B在含有終濃度為O. 2% (質量百分含量)的阿拉伯糖的液體培養(yǎng)基中誘導培養(yǎng)； 所述誘導培養(yǎng)的溫度為25V _37°C，所述誘導培養(yǎng)的時間為3-24小時； 所述誘導培養(yǎng)的溫度具體為30°C，所述誘導培養(yǎng)的時間具體為12小時。
5.根據權利要求1-4中任一所述的方法,其特征在于 所述靶細菌為含有限制修飾系統的真細菌或古生菌，所述含有限制修飾系統的真細菌或古生菌具體為解淀粉芽胞桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)TA208、臘樣芽胞桿菌(Bacillus cereus)ATCC 10987 或漢氏硝化細菌(Nitrobacter hamburgensis)X14 ； 所述自身限制修飾系統缺失的大腸桿菌具體為大腸桿菌(Escherichia coli)EC135CGMCCNo. 5925。
6.根據權利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于所述外源DNA分子為pAD123、pMK3、pMK4、pHCMC02、pHCMC 04、pDG148StuI、pWYE748 或 pBBRl-MCS5_PNham 345Q-GFP。
7.根據權利要求1-6中任一所述的方法,其特征在于 所述解淀粉芽胞桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)TA208中所有DNA甲基轉移酶編碼基因為 BAMTA208_06525、BAMTA208_6715、BAMTA208_19835 和 BAMTA208_16660 ;所述BAMTA208_06525、BAMTA208_6715、BAMTA208_19835 和 BAMTA208_16660 的核苷酸序列依次為序列表中的序列2、序列3、序列4和序列5 ； 所述蠟樣芽胞桿菌(Bacillus cereus)ATCC 10987中所有DNA甲基轉移酶編碼基因為 BCE_0393、BCE_4605、BCE_5606、BCE_5607、BCE_0365 和 BCE_0392 ；所述 BCE_0393、BCE_4605、BCE_5606、BCE_5607、BCE_0365和BCE_0392的核苷酸序列依次為序列表中的序列6、序列7、序列8、序列9、序列10和序列11 ；所述漢氏硝化細菌(Nitrobacter hamburgensis)X14中所有DNA甲基轉移酶編碼基因為 Nham_0569、Nham_0582、Nham_0803 和 Nham_3225 ;所述 Nham_0569、Nham_0582、Nham_0803和Nham_3225的核苷酸序列依次為序列表中的序列12、序列13、序列14和序列15。
8.大腸桿菌(Escherichia coli)EC135，其保藏編號為 CGMCC No. 5925。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種克服靶細菌限制修飾障礙導入外源DNA的方法。本發(fā)明提供的方法，包括如下步驟1)將靶細菌基因組中所有DNA甲基轉移酶編碼基因在自身限制修飾系統缺失的大腸桿菌中共表達，得到重組菌A；2)將外源DNA分子導入所述重組菌A進行體內修飾，得到甲基化修飾的外源DNA分子；3)將所述甲基化修飾的外源DNA分子導入所述靶細菌中。本發(fā)明的實驗證明，本發(fā)明與現有的克服細菌限制修飾障礙，實現遺傳操作的方法相比轉化率高。
文檔編號C12R1/085GK102618476SQ20121008012
公開日2012年8月1日 申請日期2012年3月23日 優(yōu)先權日2012年3月23日
發(fā)明者張國強, 溫廷益 申請人:中國科學院微生物研究所