專利名稱：一種(s)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯的生物制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種(S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯的生物制備方法。
背景技術(shù)：
(S) -4-氯-3-羥基丁酸乙酯是制備羥甲基戊二酰CoA (HMG-CoA)還原酶抑制劑如他汀類藥物的關(guān)鍵手性中間體。他汀類藥物是目前世界上最為暢銷的降膽固醇和降血脂藥物，因此，作為他汀類藥物關(guān)鍵手性中間體的(S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯具有較高的需求量和廣泛的應(yīng)用范圍。目前，利用還原法生產(chǎn)4-氯-3-羰基丁酸乙酯的方法可以分為化學(xué)法和生物法， 其中生物法以其所具有的反應(yīng)條件溫和、立體專一性強(qiáng)、轉(zhuǎn)化率高等特點(diǎn)被廣泛地研究和應(yīng)用。在生物法過程所選取的還原酶中，又以NAD依賴型和可以以異丙醇作為氫供體者為最佳。因?yàn)镹AD較NADP廉價(jià)，而異丙醇相較于葡萄糖，氧化后不會(huì)產(chǎn)生酸性物質(zhì)，且不易造成反應(yīng)液乳化，有利于下一步的提取過程。在該過程反應(yīng)體系的選擇中，又以單一水相反應(yīng)體系為較好。生產(chǎn)中大量使用有機(jī)溶劑，可能增加環(huán)境和安全風(fēng)險(xiǎn)。在單一水相反應(yīng)體系獲得較高的底物濃度，是目前該項(xiàng)研究中的熱點(diǎn)。中國發(fā)明專利申請(qǐng)例如申請(qǐng)?zhí)?00810124754. 2、201010213724. 6、 201110225388. I等公開了數(shù)種酮還原酶生產(chǎn)(S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯的方法，然而這些方法采用的輔因子均為昂貴的NADP，并需要添加葡萄糖作為氫供體。其底物濃度雖然可以達(dá)到30 %，但是必須添加大量有機(jī)溶劑形成兩相體系，并且需要分批補(bǔ)料加入底物，操作繁瑣。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種改進(jìn)的-4-氯-3-羥基丁酸乙酯的生物制備方法。為解決以上技術(shù)問題，本發(fā)明采取如下技術(shù)方案一種(S) -4-氯-3-羥基丁酸乙酯的生物制備方法，其以4-氯-3-羰基丁酸乙酯為底物，使該底物在生物催化劑和氫供體的存在下發(fā)生不對(duì)稱還原反應(yīng)生成(S) -4-氯-3-羥基丁酸乙酯，特別是，所述生物催化劑為酮還原酶KRED102，所述氫供體為異丙醇，所述不對(duì)稱還原反應(yīng)在pH為5. O 9. O的水相緩沖液中進(jìn)行,并且反應(yīng)體系中添加有聚乙二醇400 作為底物分散劑以及二價(jià)金屬離子作為酶活力增強(qiáng)劑。根據(jù)本發(fā)明的進(jìn)一步實(shí)施方案反應(yīng)起始時(shí)的反應(yīng)體系中，4-氯-3-羰基丁酸乙酯的濃度為I % 30% (w/v)，酮還原酶KRED102的濃度為O. 01% O. 8% (w/v)，異丙醇的濃度為1% -20%，聚乙二醇400的濃度為10% 70% (v/v)，所述二價(jià)金屬離子的濃度為 10 500mM。其中反應(yīng)起始時(shí)的反應(yīng)體系中，4-氯-3-羰基丁酸乙酯的濃度優(yōu)選為10 % 20% (w/v)例如為16% (w/v)，酮還原酶KRED102的濃度優(yōu)選為O. 02% O. 1% (w/v)例如為O. 04% (w/v)，異丙醇的濃度優(yōu)選為5% 10% (v/v)例如為8% (v/v)，聚乙二醇400的濃度為40% 60% (v/v)例如為50% (v/v)，二價(jià)金屬離子的濃度優(yōu)選為O. 5 2mM例如為ImM，二價(jià)金屬離子可以以其無機(jī)鹽例如鹽酸鹽、硫酸鹽等形式引入到反應(yīng)體系中。所述的水相緩沖溶液優(yōu)選為磷酸鹽緩沖液或Tri-HCl緩沖液。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)具體方面，所述制備方法的實(shí)施過程如下在反應(yīng)容器中加入水相緩沖溶液，依次加入底物4-氯-3-羰基丁酸乙酯，異丙醇，酮還原酶KRED102，聚乙二醇400，含有所述二價(jià)金屬離子的無機(jī)鹽，于溫度20°C 40°C下，攪拌反應(yīng)，利用氣相色譜監(jiān)測反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率，至轉(zhuǎn)化率達(dá)到80% 100%，加入乙酸乙酯多次萃取，合并有機(jī)相并蒸干，即得(S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯產(chǎn)品。其中，反應(yīng)溫度進(jìn)一步優(yōu)選為25°C 37°C。通過該實(shí)施過程獲得的(S) -4-氯-3-羥基丁酸乙酯產(chǎn)品已經(jīng)達(dá)到應(yīng)用的要求，無需再進(jìn)一步純化。優(yōu)選地，所述的二價(jià)金屬離子為鈣離子或鎂離子，含有所述二價(jià)金屬離子的無機(jī)鹽為氯化鈣或氯化鎂。根據(jù)本發(fā)明，所用的原料4-氯-3-羰基丁酸乙酯、酮還原酶KRED102、聚乙二醇 400均可商購獲得。本說明書中公開的所有特征，或公開的所有方法或過程中的步驟，除了互相排斥的特征和/或步驟以外，均可以以任何方式組合。由于以上技術(shù)方案的實(shí)施，本發(fā)明與已有技術(shù)相比具有如下優(yōu)勢(shì)本發(fā)明方法通過添加廉價(jià)且來源廣泛的輔料，有效地改進(jìn)了傳統(tǒng)酶催化生產(chǎn)過程中底物濃度低、酶反應(yīng)耗時(shí)長等缺點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)高效、低成本制備(S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯； 并且，添加的輔料不會(huì)影響產(chǎn)物的分離和純化，底物和其它物質(zhì)可一次投入，也無需使用其它機(jī)溶劑，操作簡單，特別適合在制藥工業(yè)中推廣應(yīng)用。


圖I為實(shí)施例I中不加聚乙二醇400以及聚乙二醇400加入量分別為占反應(yīng)體系總體積的10%、30%和50%的聚乙二醇400時(shí)，反應(yīng)轉(zhuǎn)化率隨反應(yīng)時(shí)間的變化圖；圖2為實(shí)施例2中不加鈣離子以及鈣離子加入量分別為O. ImM、ImM和5mM時(shí)，反應(yīng)轉(zhuǎn)化率隨反應(yīng)時(shí)間的變化圖。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明提供的(S) -4-氯-3-羥基丁酸乙酯的生物制備方法，其是在pH為5. O
9.O的磷酸鹽緩沖液或Tri-HCl緩沖液中，加入O. I O. 8% (w/v)的酮還原酶KRED102作為生物催化劑，采用10% 70% (v/v)的聚乙二醇400作為底物分散劑，采用10 500mM 的鈣離子或其它二價(jià)金屬離子作為酶活力增強(qiáng)劑，不對(duì)稱還原濃度為I % 30% (w/v)的 4-氯-3-羰基丁酸乙酯，加入I. 2至I. 5當(dāng)量的異丙醇作為氫供體，以80% 100%的轉(zhuǎn)化率，在2 24小時(shí)內(nèi)生成目的產(chǎn)物(S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯，其反應(yīng)式如下所示
權(quán)利要求
1.一種(S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯的生物制備方法，其以4-氯-3-羰基丁酸乙酯為底物，使該底物在生物催化劑和氫供體的存在下發(fā)生不對(duì)稱還原反應(yīng)生成(S) -4-氯-3-羥基丁酸乙酯，其特征在于所述生物催化劑為酮還原酶KRED102，所述氫供體為異丙醇，所述不對(duì)稱還原反應(yīng)在pH為5. (T9. O的水相緩沖液中進(jìn)行，并且反應(yīng)體系中添加有聚乙二醇 400作為底物分散劑以及二價(jià)金屬離子作為酶活力增強(qiáng)劑。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的(S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯的生物制備方法，其特征在于反應(yīng)起始時(shí)的反應(yīng)體系中，4-氯-3-羰基丁酸乙酯的濃度為19T30% (w/v)，酮還原酶 KRED102的濃度為O. 019Γ0. 8% (w/v)，異丙醇的濃度為1%_20%，聚乙二醇400的濃度為 10% 70% (v/v)，所述二價(jià)金屬離子的濃度為O. I 20禮。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的(S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯的生物制備方法，其特征在于 反應(yīng)起始時(shí)的反應(yīng)體系中，4-氯-3-羰基丁酸乙酯的濃度為109T20%(W/v)。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的(S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯的生物制備方法，其特征在于 反應(yīng)起始時(shí)的反應(yīng)體系中，酮還原酶KRED102的濃度為O. 029Γ O. l%(w/v)。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的(S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯的生物制備方法，其特征在于 反應(yīng)起始時(shí)的反應(yīng)體系中，異丙醇的濃度為59TlO%(v/v)。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的(S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯的生物制備方法，其特征在于 反應(yīng)起始時(shí)的反應(yīng)體系中，聚乙二醇400的濃度為409Γ60%(ν/ν)。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的(S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯的生物制備方法，其特征在于 反應(yīng)起始時(shí)的反應(yīng)體系中，二價(jià)金屬離子的濃度為O. 5^2 mM。
8.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的(S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯的生物制備方法，其特征在于所述的水相緩沖溶液為磷酸鹽緩沖液或Tri-HCl緩沖液。
9.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的(S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯的生物制備方法，其特征在于所述制備方法的實(shí)施過程如下在反應(yīng)容器中加入水相緩沖溶液，依次加入底物 4-氯-3-羰基丁酸乙酯，異丙醇，酮還原酶KRED102，聚乙二醇400，含有所述二價(jià)金屬離子的無機(jī)鹽，于溫度20°C 40°C下，攪拌反應(yīng)，利用氣相色譜監(jiān)測反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率，至轉(zhuǎn)化率達(dá)到809^100%，加入乙酸乙酯多次萃取，合并有機(jī)相并蒸干，即得(S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯產(chǎn)品。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的(S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯的生物制備方法，其特征在于 所述的二價(jià)金屬離子為鈣離子或鎂離子，含有所述二價(jià)金屬離子的無機(jī)鹽為氯化鈣或氯化鎂。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種(S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯的生物制備方法，其以4-氯-3-羰基丁酸乙酯為底物，使該底物在生物催化劑和氫供體的存在下發(fā)生不對(duì)稱還原反應(yīng)生成(S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯，特別是，所述生物催化劑為酮還原酶KRED102，所述氫供體為異丙醇，所述不對(duì)稱還原反應(yīng)在pH為5.0~9.0的水相緩沖液中進(jìn)行，并且反應(yīng)體系中添加有聚乙二醇400作為底物分散劑以及二價(jià)金屬離子作為酶活力增強(qiáng)劑。本發(fā)明方法通過添加廉價(jià)且來源廣泛的輔料，有效地改進(jìn)了傳統(tǒng)酶催化生產(chǎn)過程中底物濃度低、酶反應(yīng)耗時(shí)長等缺點(diǎn)，且操作簡單，特別適合在制藥工業(yè)中推廣應(yīng)用。
文檔編號(hào)C12P7/62GK102605011SQ20121006934
公開日2012年7月25日 申請(qǐng)日期2012年3月16日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月16日
發(fā)明者唐圓圓, 李斌, 陶軍華, 鞠鑫 申請(qǐng)人:蘇州漢酶生物技術(shù)有限公司