專利名稱：與玉米抗絲黑穗病基因連鎖的SNP位點、基于該位點的分子標記LSdCAP4及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種SNP位點及基于其開發(fā)的分子標記及其應用，特別涉及一種與玉米抗絲黑穗病主效抗病位點連鎖的SNP位點及顯著相關的分子標記及在玉米抗絲黑穗病分子標記輔助育種中的應用。屬于基因工程技術領域。
背景技術：
玉米(Zea mays)是重要的糧食和飼料作物，在我國玉米種植面積已升至為第一位、單產和總產保持第二位，僅次于水稻(李少昆，2010)。隨著世界經濟的發(fā)展，物質生活水平的提高，人們對玉米的需求趨勢呈剛性增長。玉米生產的高產、穩(wěn)產已上升為世界糧食安全和未來經濟可持續(xù)發(fā)展的重要影響因子，而玉米病害是主要限制因素之一，提高玉米品種抗病性是實現(xiàn)穩(wěn)產、高產、優(yōu)質的基礎。玉米絲黑穗病(Sphacelotheca rei I iana (Kuhn) Cl int.)是世界春播干旱、冷涼玉米產區(qū)普遍發(fā)生的真菌病害,也是我國玉米生產(北方春玉米區(qū))上的主要病害之一。2002年僅因玉米絲黑穗病，東北三省直接損失玉米I. 2億kg，農民減收9600萬元(以2002玉米單價，0. 8元/kg)造成相當嚴重的經濟損失(王曉鳴等，2003)。利用栽培措施和藥物防治玉米絲黑穗病，既增加生產投入，又帶來了環(huán)境污染。另外，前人研究已經發(fā)現(xiàn)在玉米種質中存抗絲黑穗病材料(王振華，2004; 孫志超，2007 ;郭滿庫，2007 ;王燕，2010)。因此，加強培育和推廣抗病品種是最為有效的措施，也是農業(yè)低碳和可持續(xù)發(fā)展的有效途徑。
抗病育種的關鍵在于對抗源的把握和對抗病規(guī)律的認識。前人研究顯示，玉米對絲黑穗病菌的抗性屬數(shù)量性狀遺傳、同時受加性和顯性、上位性效應控制，其中基因加性效應占主導作用(馬秉元等，1983 ;Bemardo等，1992 ;Akhtar等1990 ;王振華等,2006)。利用不同的抗絲黑穗病玉米種質構建的定位群體(BC，F(xiàn)2:3等)中已經初步定位了至少15 個相關抗絲黑穗病的數(shù)量性狀基因位點(QTL)，其中位于第2染色體的bin2. 09區(qū)域的主效QTL，能在多個研究中被重復檢測到，平均解釋表型變異率35%左右(LU等，1999 ；Lu等， 1999 ；Li等，2008 ;Chen等，2008 ；Shi等，2010);同時，結合分子生物信息學和功能基因組學也挖掘出一系列抗病QTL、抗病基因類似物(RGA，Resistance Gene Analog)和絲黑穗病抗性相關的候選基因(TUGs, tentative unique genes)(吉海蓮等,2007 ;張書紅等,2007)。 但是，目前玉米種質改良和分子輔助育種中尚未有相關抗玉米絲黑穗病主效位點的分子標記開發(fā)與利用的報道。因此，分離抗絲黑穗病主效基因(或QTL)，明確其抗病遺傳機制，開發(fā)功能分子標記，已成為下一步研究的目標。隨著生物信息學、比較基因組學和功能基因組學的不斷發(fā)展和完善，玉米自交系B73測序工作的完成與發(fā)布，為玉米重要數(shù)量性狀基因 (或QTL)的挖掘和分子標記的開發(fā)奠定了基礎。
玉米分子標記的研究始于1975年。自從第一張分子標記遺傳圖譜RFLP圖譜于 1986年誕生以來，玉米分子標記的發(fā)展經歷了 RFLP、SSR到SNP標記的發(fā)展歷程。研究結果表明SNPs (Single nucleotide polymorphisms)在植物基因組中是很豐富的(Drenkardet al. , 2000 ；Nasu et al. , 2002 ；Batley et al. , 2003 ；Hayashi et al.，2004)。與傳統(tǒng)的分子標記比較，SNP有可以容易檢測一個小區(qū)段的優(yōu)勢。目前在植物中植物的抗病基因分子標記定位也開始運用SNP技術。在玉米中SNP的頻率更高，這有利于在玉米中發(fā)現(xiàn)和運用SNP作為分子標記進行定位和基因克隆。Ching(2002)等研究了美國有代表性的36個玉米優(yōu)良自交系，發(fā)現(xiàn)在基因組的非編碼區(qū)平均每31個堿基就有一個SNP差異。在非編碼區(qū)還有高頻率的插入和缺失，平均每85個堿基就有一個這樣的差異。Tenaillon和Rafalski 報道在玉米3’端非翻譯區(qū)和編碼區(qū)分別有每48個堿基和130個堿基就有一個SNP差異 (Tenaillon et al. ,2001 ;Rafalski,2002)。
CAPS(cleaved amplified polymorphic sequence, CAPS)或 dCAPS(derived CAPS)標記是利用SNP位點的常用方式(Michaels and Amasino，1998)。CAPS標記是PCR 反應和酶切相結合產生的一種分子標記。如果不同的材料間在PCR擴增區(qū)域有SNP位點， 且該位點是限制性內切酶作用位點，那么不同材料的PCR擴增產物經特定的酶切后，再進行瓊脂糖凝膠電泳就會表現(xiàn)多態(tài)性。所以這種方法也是一種。簡單的成本較低的方法。但 SNP恰好位于限制性酶切位點這種情況還比較少，于是在CAPS標記的基礎上通過在擴增引物中引入錯配堿基，則可以結合SNP位點引入新的限制性內切酶作用位點，產生和CAPS標記類似的多態(tài)性。這就是dCAPS的方法。用CAPS或dCAPS的方法則可以將幾乎所有的SNP 位點轉化成以PCR為基礎的分子標記(Michaels and Amasino, 1998)。
玉米自交系Mol7和齊319是抗病性突出的優(yōu)良抗源。在美國和其他發(fā)達國家，分子標記輔助選擇育種加速了玉米產量提高的進程，同時為亞洲玉米種質資源的生產及品質的提高提供了巨大的潛力。但在玉米抗病分子標記的應用報道較少。利用傳統(tǒng)的表型鑒定選擇，需要足夠大的群體、多世代的自交或回交、適宜大小的選擇強度和多環(huán)境條件的鑒定表現(xiàn)。尋找與目的抗病位點緊密連鎖的分子標記，對于分子標記輔助抗病育種研究意義重大。所以，加快玉米抗病功能性分子標記開發(fā)，是目前研究的重點，對將來分子輔助抗病回交育種、分子輔助多個抗病基因聚合育種及主效抗病基因分離都具有重要的意義。發(fā)明內容
本發(fā)明的目的之一在于提供一種與玉米抗絲黑穗病基因連鎖的SNP(單核苷酸序列多態(tài)性)位點。
本發(fā)明的目的之二在于提供一種基于SNP位點開發(fā)dCAPS分子標記的方法。
本發(fā)明的目的之三在于提供一種與玉米抗絲黑穗病主效抗病位點顯著相關的分子標記以及用于擴增該分子標記的弓I物對。
本發(fā)明目的之四在于提供了以上所述的SNP位點以及基于SNP位點開發(fā)dCAPS分子標記及其擴增引物對在玉米抗絲黑穗病分子標記輔助育種中的用途。
本發(fā)明的目的是通過以下技術方案實現(xiàn)的
本發(fā)明的一種與玉米抗絲黑穗病基因連鎖的SNP位點，命名為SNP-4，其特征在于，所述的SNP位點位于如SEQ ID NO. 4所示的核苷酸序列中，所述的SNP位點為A51C，其中核苷酸位置的編號基于SEQ ID NO. 4所不的核苷酸序列。
其中，“A51C”為SNP位點的一種表示方法，意在指明該SNP位點在SEQ IDN0. 4所示的核苷酸序列中的位置，并說明該位置的單核苷酸的多態(tài)性，“A51C”具體表示為該SNP位點位于SEQ ID N0.4所示的核苷酸序列的第51位，并且該位置處的核苷酸為腺嘌呤核苷酸(A)或為胞嘧啶核苷酸(C)。
進一步的，本發(fā)明還提供了一種基于SNP位點開發(fā)dCAPS分子標記的方法，其特征在于以含有與玉米抗絲黑穗病顯著相關的SNP-4位點的核苷酸序列為基礎序列，設計 dCAPS引物對，以玉米總DNA為模板進行PCR擴增，使SNP-4位點有效的轉化為dCAPs標記； 其中所述的含有與玉米抗絲黑穗病顯著相關的SNP-4位點的核苷酸序列如SEQ ID NO. 4所/Jn o
在本發(fā)明的具體實施例中，所述的dCAPS引物對序列如下所示
LSCAP4 上游(F) CATGGACCAACCTGAAATGGTCAC (SEQ ID NO. 2 所示)
下游(R) ITTAGCTCTTGGITGAAGCACATG (SEQ ID NO. 3 所示)
本發(fā)明還提供了按照以上所述的方法制備得到的與玉米抗絲黑穗病基因緊密連鎖的dCAPS分子標記，命名為LSdCAP4，其特征在于，所述的分子標記的核苷酸序列如SEQ ID NO. I 所示。
本發(fā)明的分子標記是由玉米基因組主效抗絲黑穗病位點bin2. 09區(qū)域的SNP-4ID 序列轉化得到的，是一個dCAPS分子標記，名稱為LSdCAP4，來源于存在主效抗絲黑穗病位點的玉米自交系Mol7和齊319，是由對應的SNP位點SNP-4轉化而來的，具有序列表中SEQ ID NO. I所述的119個核苷酸序列，對應的SNP位點位于序列表中SEQ ID NO. 4所示的101 個核苷酸序列中。
獲得以上所述的與玉米抗絲黑穗病基因緊密連鎖的dCAPS分子標記的引物對，優(yōu)選的，所述的dCAPS引物對序列如下所示
LSCAP4 上游(F) CATGGACCAACCTGAAATGGTCAC
下游(R) ITTAGCTCTTGGITGAAGCACATG
進一步的，本發(fā)明提出了所述的與玉米抗絲黑穗病基因連鎖的SNP位點在玉米抗絲黑穗病分子標記輔助育種中的用途。
再進一步的，本發(fā)明提出了所述的與玉米抗絲黑穗病基因緊密連鎖的dCAPS分子標記在玉米抗絲黑穗病分子標記輔助育種中的用途。
更進一步的，本發(fā)明提出了所述的引物對在玉米抗絲黑穗病分子標記輔助育種中的用途。
在存在主效抗絲黑穗病位點的玉米自交系Mol7和齊319為抗性供體的回交世代中，篩選到和玉米抗絲黑穗病主效抗病位點顯著相關的分子標記，為進一步分離和克隆抗絲黑穗病基因奠定了基礎。同時該分子標記可用于玉米分子標記輔助育種工作中，用以鑒定含有主效抗絲黑穗病位點的單株材料。
由于玉米對絲黑穗病的抗性屬數(shù)量性狀遺傳，采用前期人工菌土接種、乳熟期進行病株率調查的傳統(tǒng)抗病性鑒定方法，耗費時間較長，本發(fā)明的dCAPS標記在玉米種子期間或子葉長出的早期階段就可鑒定，省時而且準確，因此可用于玉米抗絲黑穗病分子標記輔助育種，加速玉米抗病品種選育的進程。


圖I是標記LSdCAP4對植株DNAPCR后的電泳條帶；
1-5 孔為標記 LSdCAP4 的 PCR 產物；M 為 Marker 2000
圖2是標記LSdCAP4在近等基因系、親本及感病池單株中的電泳檢測照片；
電泳點樣孔1-7為酶切后PCR產物，8-14孔為酶切前PCR產物，其中I孔為含Mol7 供體主效位點近等基因系，2孔為含齊319供體主效抗病位點近等基因系，3孔為未本Mol7, 4孔為齊319，，5孔為黃早四，6-7孔為BC34F2感病家系單株；8_14孔DNA樣品與1_7孔DNA 樣品依次對應；M為Marker PBR322
圖3是LSdCAP4在酶切后分析抗病株和感病株的電泳1-12孔為含主效抗病位點近等基因系(BC4F3) ； 13-24孔為BC4F2感病家系單株； M 為 Marker PBR322
圖4是LSdCAP4在Mol7和齊319供體創(chuàng)建近等基因系的抗感病BAS池中的單株電泳由左至右，1-12孔為Mol7供體近等基因系；13_24孔為Mol7供體BC4F2感病家系單株，26-37孔為齊319供體近等基因系；38-49為齊319供體BC4F2感病家系單株，其中第 25 和第 50 孔為 MARKER PBR322
圖5是LSdCAP4標記在10條染色體上的檢索分布圖6是LSdCAP4標記在第2染色體上的檢索分布圖7是LSdCAP4標記在第2染色體上檢索的堿基區(qū)間分布圖8是LSdCAP4標記PCR產物BLAST后檢索結果的詳細參數(shù)及序列比對分析。
具體實施方式
下面結合具體實施例對本發(fā)明做進一步說明，應該理解的是，這些實施例僅用于例證的目的，決不限制本發(fā)明的保護范圍。
實施例I.與玉米抗絲黑穗病主效抗病位點顯著相關的SNP位點的獲得
一、含主效抗絲黑穗病位點玉米近等基因系的創(chuàng)建
I親本材料
Mol7是由中國農業(yè)科學院作物育種栽培研究所于1974年從美國引入，系 187-2XC103的二環(huán)系。該系具有遺傳基礎豐富、配合力高、適應性廣、桿強不倒、出籽率高和抗絲黑穗病等突出優(yōu)點，是Lan雜優(yōu)類群的代表系和測驗種，其與塘四平頭群、改良Reid 群和旅大紅骨子都具有較強的雜種優(yōu)勢。因Mol7抗絲黑穗病與其組配的雜交種(Fl)也具有優(yōu)良的抗病性，所以在北方春玉米生產上發(fā)揮了巨大的作用。
齊319是1990年由山東省農業(yè)科學院玉米研究所以外引雜交種78599為基礎材料，通過二環(huán)系選育而成的優(yōu)良PN類群種質，含有豐富的熱帶、亞熱帶玉米種質，配合力高，多抗性強，綜合性狀優(yōu)良，是PB雜種優(yōu)勢類群的優(yōu)良代表系和測驗種。齊319高抗玉米絲黑穗病，對玉米南方銹病表現(xiàn)免疫，同時抗玉米大斑病、小斑病、青枯病、粗縮病、黑粉病等，是兼抗多種病害的優(yōu)良玉米自交系。
黃早四為1975年由中國農業(yè)科學院作物育種栽培研究所與北京市農林科學院作物研究所在我國地方種質“塘四平頭類群”中共同選擇育成。該系具有配合力高、適應性廣、 耐旱性強等優(yōu)點，是“塘四平頭類群”的代表系和測驗種，同時具有株型緊湊、花粉量多、抗大斑病和矮花葉病毒病，使在我國玉米育種中應用十分廣泛。該系高感絲黑穗病，一直成為北方春玉米區(qū)直接應用的限制因素，加強對該種質的絲黑穗病抗性改良和利用意義十分重大。
2.近等基因系的基礎群體及創(chuàng)建過程
以Mol7和齊319為抗性供體，黃早四為感病輪回親本，在田間人工接種壓力的選擇下，選擇極端抗病回交家系進行下一輪回交和自交鑒定。對Mol7(或齊319)抗源的抗絲黑穗病回交群體構建，主要通過選擇Mol7 (或齊319)群體中抗性家系的抗性單株進行下一輪回交。具體創(chuàng)建過程為，首先，在授粉前對Mol7(或齊319)群體中各個家系進行長勢(株高、穗位和葉片)正常和性器官發(fā)育(抽雄、散粉和雌穗)正常評估，推測各家系對玉米抗絲黑穗病的抗性，經3次重復的綜合評價，初步篩選出Mol7(或齊319)群體中的抗性家系及行號。第二，選擇Mol7(或齊319)抗性家系中的4-5個正常單株，單獨取花粉，——對應與黃早四進行授粉雜交，同時自交，并掛牌標示好自交單株、回交單株來源。第三，乳熟期調查Mol7(或齊319)群體中家系的發(fā)病率，依據(jù)各個家系發(fā)病率在群體中的分布情況，選擇位于波峰單側極端抗性的3-5個家系的抗性自交單株及其回交單株，并進行保存，以備下一年種植。以此類推，創(chuàng)建出了 BC4F2 (2009年，哈爾濱)世代的基礎近等基因系群體。
3. Mol7供體近等基因系創(chuàng)建方法
以BC4F2抗性家系為材料，通過田間人工接種選擇抗性的單株，再通過SSR標記的連鎖標記篩選、全基因組SSR標記背景檢測和可能抗病區(qū)域的SSR標記檢測分析，最終篩選出僅含主效抗絲黑穗病位點的抗性單株。具體操作為，首先，以主效抗絲黑穗病位點的連鎖SSR標記SSR148152為工具，篩選含有純合Mol7供體主效抗病位點的抗性單株；第二，在玉米全基因組平均隨機選取324對SSR標記，利用Mol7和黃早四親本間存在多態(tài)性的SSR 標記對入選的抗性單株進行背景恢復檢測分析。第三，在玉米染色體binl. 02、binl. 03、 bin2. 08等10個可能存在玉米抗絲黑穗病的區(qū)域內選取113個SSR標記，利用親本Mol7 與黃早四之間存在多態(tài)性的可能抗絲黑穗病區(qū)域標記SSRjf 12份含主效抗絲黑穗病位點的高恢復率單株進行其他可能抗絲黑穗病的位點檢測分析。對于無其他可能導入抗絲黑穗病位點的單株進行自交，從而初步獲得Mol7主效抗絲黑穗病導入基因的純合個體，即獲得 Mo 17供體近等基因系。
4.齊319供體近等基因系創(chuàng)建方法
以BC4F2抗性家系為材料，通過田間人工接種選擇抗性的單株，再通過SSR標記的連鎖標記篩選、全基因組SSR標記背景檢測和可能抗病區(qū)域的SSR標記檢測分析，最終篩選出僅含主效抗絲黑穗病位點的抗性單株。具體操作為，首先，用主效抗絲黑穗病位點的連鎖SSR標記umc2077、bnlgl893和umcl525，篩選含有齊319供體純合主效抗病位點的抗性單株；第二，在玉米全基因組平均隨機選取324對SSR標記，利用齊319和黃早四親本間存在多態(tài)性的SSR標記對入選的抗性單株進行背景恢復檢測分析。第三，在玉米染色體 binl. 02、binl. 03、bin2. 08等10個可能存在玉米抗絲黑穗病的區(qū)域內選取113個SSR標記，利用親本齊319與黃早四之間存在多態(tài)性SSR的標記，對12份含主效抗絲黑穗病位點的高恢復率單株進行其他可能抗絲黑穗病的位點檢測分析。對于無其他可能導入抗絲黑穗病位點的單株進行自交，從而初步獲得齊319主效抗絲黑穗病導入基因的純合個體，即獲得齊319供體近等基因系。
二、玉米抗絲黑穗病主效區(qū)域染色體2. 09內的SNP分析
本研究以抗性高且穩(wěn)定的近等基因系L35(平均發(fā)病率為2.33%，Mol7抗源， BC4F4)、L271 (平均發(fā)病率為2. 9%，齊319抗源，BC4F4)、親本Mo 17、齊319、黃早四(感病輪回親本)及已知抗、感的16份自交系材料進行基因芯片分析，最終獲得主效抗絲黑穗病位點(染色體2. 09區(qū)域內)的抗病相關SNP信息，其中16份自交系材料的2. 09區(qū)域基因芯片分析數(shù)據(jù)由中國農業(yè)科學院作物所玉米研究室提供。而16份自交系的材料選擇，參考于玉米抗絲黑穗病主效位點的供體親本Mol7 (R)和齊319 (HR)，二者分別來自于LAN血緣和PB血緣材料，感病輪回親本為黃早四(HS)，源于感絲黑穗病的SPT血緣材料。為此，選擇了 LAN血緣4份、PB血緣3份和其他血緣I份，共計8份抗性自交系，田間接種發(fā)病率在 0-2. 25%之間，抗病級別分別屬于HR和R ;選擇了 SPT血緣5份、PB血緣I份和其他血緣2 份，共計8份的高感病自交系，其田間接種發(fā)病率在53. 15%-89. 1%之間，抗病級別分別屬于HS (見表I)。
在bin2. 09區(qū)域檢索到抗性差異的SNP信息(自交系的芯片數(shù)據(jù)由中國農業(yè)科學院作物所玉米育種研究室和東北農業(yè)大學玉米研究中心共同合作完成，見表2)。
表I 16份自交系芯片材料的抗病和感病分類表
權利要求
1.一種與玉米抗絲黑穗病基因連鎖的SNP位點，命名為SNP-4，其特征在于，所述的SNP 位點位于如SEQ ID NO. 4所示的核苷酸序列中，所述的SNP位點為A51C，其中核苷酸位置的編號基于SEQ ID NO. 4所不的核苷酸序列。
2.一種基于SNP位點開發(fā)dCAPS分子標記的方法，其特征在于以含有與玉米抗絲黑穗病顯著相關的SNP-4位點的核苷酸序列為基礎序列，設計dCAPS引物對，以玉米總DNA為模板進行PCR擴增，使SNP-4位點有效的轉化為dCAPs標記；其中所述的含有與玉米抗絲黑穗病顯著相關的SNP-4位點的核苷酸序列如SEQ ID NO. 4所示。
3.如權利要求2所述的方法，其特征在于，所述的dCAPS引物對序列如下所示 LSCAP4 上游(F) CATGGACCAACCTGAAATGGTCAC下游(R) ITTAGCTCTTGGITGAAGCACATG。
4.按照權利要求2或3所述的方法得到的與玉米抗絲黑穗病基因緊密連鎖的dCAPS分子標記，命名為LSdCAP4，其特征在于，所述的分子標記的核苷酸序列如SEQ ID NO. I所示。
5.獲得權利要求4所述的與玉米抗絲黑穗病基因緊密連鎖的dCAPS分子標記的引物對。
6.如權利要求5所述的引物對，其特征在于，所述的dCAPS引物對序列如下所示 LSCAP4 上游(F) CATGGACCAACCTGAAATGGTCAC下游(R) ITTAGCTCTTGGITGAAGCACATG。
7.權利要求I所述的與玉米抗絲黑穗病基因連鎖的SNP基因位點在玉米抗絲黑穗病分子標記輔助育種中的用途。
8.權利要求4所述的與玉米抗絲黑穗病基因緊密連鎖的dCAPS分子標記在玉米抗絲黑穗病分子標記輔助育種中的用途。
9.權利要求5或6所述的引物對在玉米抗絲黑穗病分子標記輔助育種中的用途。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種與玉米抗絲黑穗病基因連鎖的SNP位點、基于該位點的分子標記LSdCAP4及其應用，屬于基因工程技術領域。本發(fā)明的一種與玉米抗絲黑穗病基因連鎖的SNP位點，位于如SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列中，基于該SNP位點本發(fā)明建立了與玉米抗絲黑穗病主效抗病位點顯著相關的分子標記，具有序列表中SEQ ID NO.1中119個核苷酸序列。它是由主效抗病位點玉米基因組bin2.09區(qū)域的SNP-4ID序列轉化得到的，該SNP-4ID序列具有序列表中SEQ ID NO.4中的101個核苷酸序列。本發(fā)明可用于玉米抗絲黑穗病分子標記輔助育種，加速玉米抗病品種選育進程。
文檔編號C12N15/10GK102533747SQ20121003119
公開日2012年7月4日 申請日期2012年2月13日 優(yōu)先權日2012年2月13日
發(fā)明者于滔, 劉顯君, 張 林, 曾興, 李新海, 王振華, 翁建鋒, 邸宏, 闞帥帥 申請人:東北農業(yè)大學