專利名稱：歐洲型舞毒蛾的實(shí)時(shí)熒光pcr檢測方法及檢測用引物和探針的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及林業(yè)和植物檢疫技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種歐洲型舞毒蛾的檢測方法； 尤其涉及一種歐洲型舞毒蛾的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測方法；此外，本發(fā)明還涉及檢測歐洲型舞毒蛾的引物和探針。
背景技術(shù)：
舞毒蛾Lymantria dispar (Linnaeus)屬鱗翅目(Lepidoptera)、毒蛾科(Lyman triidae)、毒蛾屬(Lymantria),是世界公認(rèn)的全北溫帶地區(qū)森林和觀賞性林木害蟲。舞毒蛾幼蟲寄主范圍廣，主要有楊、柳、榆、櫟、落葉松、椴、云杉等樹木。主要分布在歐洲、北美、中國、日本、朝鮮，根據(jù)其形態(tài)特征、生物學(xué)習(xí)性和地理分布，舞毒蛾被分為亞洲亞種 (L. disparasiatica Vnukovsk ii)、歐洲亞種(L. dispardispar (Linnaeus))和日本亞種 (L. dispar japonica (Motschulsky))。亞洲亞種和日本亞種被統(tǒng)稱為亞洲型舞毒蛾,其中亞洲亞種在我國有分布，歐洲亞種則被稱為歐洲型舞毒蛾。亞洲型舞毒蛾主要分布在亞洲和部分歐洲地區(qū)，雌成蟲飛行能力強(qiáng)，可為害約500種寄主植物。歐洲型舞毒蛾原產(chǎn)歐洲，于 1869年由歐洲傳入美國，雌成蟲不能飛行，為害約250種寄主植物。歐洲型舞毒蛾在歐洲為害嚴(yán)重，分布廣泛，1948年Cointat就描述了舞毒蛾在法國普羅旺斯地區(qū)的大爆發(fā)，1962年Kailidis報(bào)道了舞毒蛾在希臘的危害，1972年 Keremidchiev報(bào)道了舞毒蛾在保加利亞的危害等。舞毒蛾在亞洲和歐洲的危害歷史久遠(yuǎn)， 近年普遍受到關(guān)注的原因是歐洲型和亞洲型舞毒蛾先后被引入了北美，美加持續(xù)關(guān)注。舞毒蛾最先被引入北美是由一次人為意外。在1869年由E. Leopold Trouvelot將舞毒蛾做為產(chǎn)絲昆蟲從歐洲引入美國的波士頓附近，由于在實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)時(shí)部分成蟲逃逸，10年后舞毒蛾在Trouvelot家的周圍大爆發(fā)。1890年美國政府和州政府開始了采取噴藥進(jìn)行根除舞毒蛾的行動，但是，由于無法根除徹底而導(dǎo)致行動失敗。從那以后，舞毒蛾以每年6 9km的速度向美國的西南方向蔓延?，F(xiàn)在，歐洲型舞毒蛾在北美的分布包括了美國的東北方以及東南和中西部的部分地區(qū)，受危害的林木面積達(dá)200萬hm2，還有加拿大東部的部分地區(qū)。 由于舞毒蛾的檢疫重要性，因此，尋求快速、準(zhǔn)確的歐洲型舞毒蛾的檢測鑒定方法是現(xiàn)階段檢疫技術(shù)亟待解決的問題和發(fā)展的方向。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種歐洲型舞毒蛾的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測方法；為此，本發(fā)明還提供用于上述方法的檢測引物和探針。利用歐洲型舞毒蛾檢測引物及探針可以快速、準(zhǔn)確地對歐洲型舞毒蛾進(jìn)行檢測鑒定。本發(fā)明根據(jù)亞洲型舞毒蛾、歐洲型舞毒蛾、北美型舞毒蛾這幾個(gè)地理種群的mtDNA 中部分基因的序列設(shè)計(jì)特異性引物和探針，建立了歐洲型舞毒蛾的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測方法，以達(dá)到快速準(zhǔn)確檢測鑒定歐洲型舞毒蛾的目的。
在本發(fā)明的一方面，提供一種歐洲型舞毒蛾的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測方法，包括如下步驟(I)設(shè)計(jì)引物和探針；該引物的序列為上游引物EU-F :5’ -AACTTCAGGATGTCCGAAAAATCA-3’ (SEQ ID NO. I)；下游引物EU-R :5，-ACAGCTTTCCTTCTACITTTATCTTTACCT-3，(SEQ ID NO. 2)；該探針的序列為歐洲型舞毒蛾探針EU-MGB FTGGATCTCCTCCTCCTP (SEQ ID NO. 3)或其互補(bǔ)鏈；(2)提取歐洲型舞毒蛾DNA ；(3)采用步驟⑴設(shè)計(jì)的引物和探針進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR檢測。步驟⑵具體為取歐洲型舞毒蛾單頭蟲樣放入研缽，加液氮磨成粉末狀，用試劑盒提取樣品DNA。步驟(3)中，所述實(shí)時(shí)熒光PCR檢測的反應(yīng)體系為25 iiL，包括2 X Premix Ex Taq
12.5 u L, 50 X ROX Reference Dye0.5iiL，步驟(I)設(shè)計(jì)的上下游引物 EU-F/R 各 I. 0 y L， EU-MGB探針l.OuL, DNA模板2. Ou L,超純水補(bǔ)至25 u L。步驟(3)中，所述實(shí)時(shí)熒光PCR檢測的反應(yīng)程序?yàn)轭A(yù)變性95°C 30seC ;然后 95°C 5sec，65°C 34sec 循環(huán) 40 次。在本發(fā)明的另一方面，提供一種用于檢測歐洲型舞毒蛾的引物，其序列為上游引物EU-F :5’ -AACTTCAGGATGTCCGAAAAATCA-3’ (SEQ ID NO. I)；下游引物EU-R :5，-ACAGCTTTCCTTCTACITTTATCTTTACCT-3，(SEQ ID NO.2)。在本發(fā)明的另一方面，提供一種用于檢測歐洲型舞毒蛾的探針，其序列為 EU-MGB FTGGATCTCCTCCTCCTP(SEQ ID NO. 3)或其互補(bǔ)鏈。上述實(shí)時(shí)熒光PCR檢測方法采用MGB (全稱為Minor Groove Binder)探針。MGB 探針一是在探針的3’端標(biāo)記了自身不發(fā)光的淬滅熒光分子，以取代常規(guī)可發(fā)光的TAMRA熒光標(biāo)記；二是探針的3’端另結(jié)合了 Minor groove binder結(jié)合物,使探針的Tm值提高,大大增加了探針的雜交穩(wěn)定性。該方法具有如下優(yōu)點(diǎn)1、更容易設(shè)計(jì)；2、探針更短3、提高配對與司E配對模板間的Tm值差異；4、實(shí)驗(yàn)結(jié)果更精確、分辯率更高；5、雜交的穩(wěn)定性提高；
6、低背景；7、重復(fù)性更強(qiáng)。該方法適合病原體的檢測、SNP和突變體檢測，既可以進(jìn)行基因定量分析，又可以進(jìn)行基因突變分析。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果在于I、檢測時(shí)間大大縮短，可以在六個(gè)小時(shí)內(nèi)完成檢測，傳統(tǒng)的常規(guī)方法需10-20天；2、對歐洲型舞毒蛾的鑒定準(zhǔn)確率增大，傳統(tǒng)的常規(guī)方法還需要其他詳細(xì)產(chǎn)地等信息支持才能鑒定。


圖I是本發(fā)明的引物EU-F/EU-R和探針EU-MGB在歐洲型舞毒蛾上的位置示意圖；圖2是亞洲型、歐洲型、北美型舞毒蛾序列在探針位置的比對示意圖；圖3是不同來源的5個(gè)舞毒蛾樣品實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增的結(jié)果示意圖；圖4是不同來源的20個(gè)舞毒蛾樣品實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增的結(jié)果示意圖5是不同稀釋濃度的歐洲型舞毒蛾樣品實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增的結(jié)果示意圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按常規(guī)條件，例如Sambrook等人,分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(New York : Co Id Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述條件,或按制造廠商所建議的條件。實(shí)施例II.設(shè)計(jì)引物和探針根據(jù)舞毒蛾這幾個(gè)地理種群的mtDNA (線粒體DNA)中部分基因的序列設(shè)計(jì)如下特異性引物EU-F/R和探針EU-MGB (引物和探針由上?；倒竞铣?歐洲型舞毒蛾引物上游引物EU-F :5’ -AACTTCAGGATGTCCGAAAAATCA-3’ (SEQ ID NO. I)；下游引物EU-R :5，-ACAGCTTTCCTTCTACITTTATCTTTACCT-3，(SEQ ID NO. 2)；歐洲型舞毒蛾探針EU-MGB :FTGGATCTCCTCCTCCTP (SEQ ID NO. 3)或其互補(bǔ)鏈。上述引物及探針的檢測原理如圖I所示，3種不同類型舞毒蛾序列在探針位置的比對見圖2。2、提取舞毒蛾DNA取舞毒蛾單頭蟲樣(樣品來源見表I)放入研缽，加液氮磨成粉末狀，用DNeasy Blood&Tissue Kitt (Qiagen 公司)提取樣品 DNA。表I舞毒蛾樣品信息
權(quán)利要求
1.一種歐洲型舞毒蛾的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測方法，其特征在于，包括如下步驟(1)設(shè)計(jì)引物和探針；該引物的序列為上游引物 EU-F :5’ -AACTTCAGGATGTCCGAAAAATCA-3’ (SEQ ID NO. I)；下游引物 EU-R :5，-ACAGCTTTCCTTCTACITTTATCTTTACCT-3，(SEQ ID NO. 2)；該探針的序列為歐洲型舞毒蛾探針EU-MGB FTGGATCTCCTCCTCCTP (SEQ ID NO. 3)或其互補(bǔ)鏈；(2)提取歐洲型舞毒蛾DNA；(3)采用步驟(I)設(shè)計(jì)的引物和探針進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR檢測。
2.如權(quán)利要求I所述的歐洲型舞毒蛾的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測方法，其特征在于，步驟⑵ 具體為取歐洲型舞毒蛾單頭蟲樣放入研缽，加液氮磨成粉末狀，用試劑盒提取樣品DNA。
3.如權(quán)利要求I所述的歐洲型舞毒蛾的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測方法，其特征在于，步驟⑶ 中，所述實(shí)時(shí)熒光PCR檢測的反應(yīng)體系為25 ii L，包括2 X PremixEx Taq 12. 5 U L, 50 X ROX Reference DyeO. L，步驟(I)設(shè)計(jì)的上下游引物 EU-F/R 各 I. 0 y L，EU-MGB 探針 l.OuL, DNA模板2. 0 ii L，超純水補(bǔ)至25 u L。
4.如權(quán)利要求I或3所述的歐洲型舞毒蛾的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測方法，其特征在于， 步驟(3)中，所述實(shí)時(shí)熒光PCR檢測的反應(yīng)程序?yàn)轭A(yù)變性95°C 30seC;然后95°C 5sec, 65 °C 34sec 循環(huán) 40 次。
5.一種用于檢測歐洲型舞毒蛾的引物，其特征在于，其序列為上游引物 EU-F :5’ -AACTTCAGGATGTCCGAAAAATCA-3’ (SEQ ID NO. I)；下游引物 EU-R :5，-ACAGCTTTCCTTCTACITTTATCTTTACCT-3，(SEQ ID NO.2)。
6.一種用于檢測歐洲型舞毒蛾的探針，其特征在于，其序列為EU-MGB FTGGATCTCCTCCTCCTP (SEQ ID NO. 3)或其互補(bǔ)鏈。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種歐洲型舞毒蛾的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測方法及檢測用引物和探針，根據(jù)亞洲型舞毒蛾、歐洲型舞毒蛾、北美型舞毒蛾這幾個(gè)地理種群的mtDNA中部分基因的序列設(shè)計(jì)特異性引物EU-F/R和探針EU-MGB，建立了歐洲型舞毒蛾的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測方法，以達(dá)到快速準(zhǔn)確檢測鑒定歐洲型舞毒蛾的目的。
文檔編號C12N15/11GK102534024SQ20121003028
公開日2012年7月4日 申請日期2012年2月10日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月10日
發(fā)明者葉軍, 周國梁, 易建平, 朱雅君, 林瑤 申請人:中華人民共和國上海出入境檢驗(yàn)檢疫局