專利名稱：一種用于制備轉(zhuǎn)基因小鼠的精子處理方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于轉(zhuǎn)基因領(lǐng)域，涉及一種用于制備轉(zhuǎn)基因小鼠的精子處理方法。
背景技術(shù)：
轉(zhuǎn)基因方法已被廣泛地應(yīng)用于現(xiàn)代生命科學(xué)研究和基因功能研究的各領(lǐng)域中。目前，基因轉(zhuǎn)移技術(shù)主要有DNA顯微注射法、ES細(xì)胞介導(dǎo)法、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體法、精子載體法等。雖然利用這些方法能將外源基因?qū)氚屑?xì)胞內(nèi)，并獲得相應(yīng)的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，但也存在某些局限性。其中，最常用的DNA顯微注射法需要昂貴的實(shí)驗(yàn)設(shè)備，工作繁瑣，技術(shù)要求高，夕卜源基因?qū)肼实停a(chǎn)成本高；雖然逆轉(zhuǎn)錄病毒載體法的基因轉(zhuǎn)移效率較高，但基因插入是隨機(jī)的，且攜帶的DNA片段大小受限制，產(chǎn)生的后代多為嵌合體；ES細(xì)胞介導(dǎo)法雖能在細(xì)胞水平進(jìn)行性別篩選和進(jìn)行同源同組，但目前僅能在小鼠、倉(cāng)鼠和人早期胚胎中分離到ES細(xì)胞，且建立ES細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的條件技術(shù)高、成本大，使得該技術(shù)的廣泛應(yīng)用受到一定限制。精子載體法(Sperm -mediated gene transfer, SMGT)是最近發(fā)展起來(lái)的一種轉(zhuǎn)基因技術(shù)，因其操作簡(jiǎn)單、成本低廉、易于篩選，備受研究人員的關(guān)注。早在1971年，Brackett等將家兔精子與H3標(biāo)記的SV40DNA共培養(yǎng)后，發(fā)現(xiàn)精子頭部有放射性物質(zhì)存在，用處理的精子進(jìn)行人工授精，在2細(xì)胞胚胎中能檢測(cè)到SV40DNA。Lavitrano等用小鼠附睪精子與外源DNA載體共溫育，通過(guò)卵子體外受精獲得轉(zhuǎn)基因鼠，后代中的30%是轉(zhuǎn)基因小鼠，外源基因穩(wěn)定整合到生殖細(xì)胞中，并獲得了轉(zhuǎn)基因株系。近幾年，國(guó)內(nèi)外許多實(shí)驗(yàn)室在多種動(dòng)物精子介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)中獲得成功，使得這一技術(shù)在較短的時(shí)間里得到較快發(fā)展。精子介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移技術(shù)因其操作簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)、易于推廣等優(yōu)點(diǎn)，在醫(yī)學(xué)、藥物學(xué)、畜牧業(yè)等領(lǐng)域中顯示出了誘人的應(yīng)用前景和開(kāi)發(fā)價(jià)值。最近幾年，有許多研究人員借助該項(xiàng)技術(shù)建立了各種具有特定目的和用途的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。人們雖然對(duì)外源DNA如何整合到受精卵的過(guò)程仍有諸多不清楚，但許多實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明精子具有潛在的結(jié)合外源DNA并在受 精過(guò)程中將其轉(zhuǎn)入到卵內(nèi)的能力。因此，如果精子為載體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移技術(shù)能夠發(fā)展到完善的程度，理論上就可以運(yùn)用到所有由精卵結(jié)合產(chǎn)生下一代的動(dòng)物。研究認(rèn)為，精子轉(zhuǎn)染外源DNA的過(guò)程包括質(zhì)膜結(jié)合和內(nèi)化轉(zhuǎn)運(yùn)兩個(gè)密切相關(guān)而又相互獨(dú)立的基本過(guò)程。在各種動(dòng)物研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)合是一個(gè)快速發(fā)生的過(guò)程，大約在45min內(nèi)基本完成。結(jié)合的外源DNA首先在精子膜表面，隨后被內(nèi)化轉(zhuǎn)運(yùn)到精細(xì)胞內(nèi)或/和核內(nèi)，內(nèi)化轉(zhuǎn)運(yùn)相對(duì)滯后，需要60min左右達(dá)到飽和[5]。精子內(nèi)化對(duì)于精子介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因非常關(guān)鍵，因?yàn)橹挥袃?nèi)化的外源DNA才有機(jī)會(huì)進(jìn)入卵母細(xì)胞，也才可能得到轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。目前應(yīng)用精子為載體介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移獲得轉(zhuǎn)基因動(dòng)物主要通過(guò)以下途徑來(lái)實(shí)現(xiàn):體外精子轉(zhuǎn)染法和體內(nèi)精子轉(zhuǎn)染法。體內(nèi)精子轉(zhuǎn)染法又可以分為睪丸內(nèi)注射法、輸精管注射法、曲細(xì)精管注射法。體外精子轉(zhuǎn)染法又可以分為精子與外源DNA直接共孵育法、體外電穿孔導(dǎo)入法、二甲基亞砜(DMSO)處理法和脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染法等。外源DNA與精子共孵育，將已獲能的精子與外源DNA直接混合孵育，部分精子能吸附外源DNA并且吸附DNA后的精子仍然保持較好的活力，通過(guò)體外受精或人工授精及胚胎移植等方法，可以得到轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。DNA與豬精子結(jié)合牢固，每個(gè)精子可結(jié)合3.SXlO2ADNA分子，且運(yùn)動(dòng)精子比不活動(dòng)的精子捕捉DNA的效率高，但用此法制備轉(zhuǎn)基因小鼠成功率很低。
脂質(zhì)體介導(dǎo)法外源DNA，陽(yáng)離子脂質(zhì)體是廣泛應(yīng)用的轉(zhuǎn)移DNA的有效手段之一，月旨質(zhì)體自發(fā)地與DNA相互作用形成脂質(zhì)體-DNA復(fù)合體。這種復(fù)合體較易與精子細(xì)胞質(zhì)膜融合，從而進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，同時(shí)脂質(zhì)體的包裹還可以防止核酸酶的降解以及防止DNA被稀釋。Rottmann等將DNA用脂質(zhì)體包裹后，與精子共處理，人工受:精的后代中63%為轉(zhuǎn)基因兔。該方法不僅提高DNA轉(zhuǎn)運(yùn)效率，而且可保護(hù)核酶對(duì)DNA的降解，已在雞、兔、小鼠上獲得轉(zhuǎn)基因后代，但外源DNA多以附加體形式存在，傳代尚有困難。
電穿孔法是促進(jìn)DNA與動(dòng)物精子結(jié)合的一種重要方法，它利用高壓電場(chǎng)使精子質(zhì)膜產(chǎn)生暫時(shí)性孔洞，從而使外源DNA比較容易地進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的一種物理方法。目前研究認(rèn)為，電刺激可能引起精子大量死亡，降低受精能力，為了顧及精子的受精能力，需要通過(guò)實(shí)驗(yàn)選擇得到一種適用于各種動(dòng)物精子的最佳脈沖，從而達(dá)到提高載體精子活力的目的。Rieth等對(duì)牛精子電穿孔結(jié)果表明，電穿孔使精子俘獲了更多的外源DNA分子，且結(jié)果經(jīng)PCR分析電穿孔精子獲得的同源重組率為46.5%，遠(yuǎn)比非電穿孔處理組(5% )高。Tsai等用電穿孔導(dǎo)入法處理鮑魚(yú)精子，電擊電壓為2 10kV，周期為6 12次，PCR和Southernblot都顯示陽(yáng)性結(jié)果，并且用Southernblot進(jìn)一步在子代鮑魚(yú)中檢測(cè)到外源基因的整合。
用二甲基亞砜(DMSO)處理精子能有效促進(jìn)外源性DNA進(jìn)入精子的頂部，而且對(duì)精子的活力影響較小，Kuznetsov首次用此方法獲得了轉(zhuǎn)基因兔，魏紳等用此方法獲得了轉(zhuǎn)基因兔和小鼠。目前報(bào)道的DMSO介導(dǎo)的精子基因轉(zhuǎn)染效率變動(dòng)范圍很大(O 97.3%)，提示影響因素很多，如基因構(gòu)件的大小、濃度以及DMSO的濃度、處理時(shí)間、溫度等。
綜上所述，上述以精子為載體制備轉(zhuǎn)基因小鼠技術(shù)仍很不成熟，主要表現(xiàn)在研究結(jié)果不穩(wěn)定，轉(zhuǎn)基因效率波動(dòng)很大，在不同動(dòng)物、不同實(shí)驗(yàn)室或同一實(shí)驗(yàn)室不同批次間差異極大，甚至相互矛盾，其結(jié)果存在著很大的隨機(jī)性和不確定性，其中很多可控環(huán)節(jié)和轉(zhuǎn)染機(jī)制仍值得實(shí)驗(yàn)研究。還必須研發(fā)一種高效、穩(wěn)定的以精子為載體制備轉(zhuǎn)基因小鼠的方法。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的上述不足，提供一種用于制備轉(zhuǎn)基因小鼠的精子處理方法。
本發(fā)明的目的可·通過(guò)如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):
一種用于制備轉(zhuǎn)基因小鼠的精子處理方法，將小鼠附睪精子于5% CO2培養(yǎng)箱37°C孵育8 10分鐘，然后將含有目的基因的線性DNA片段與精子混合，2°C 5°C冰浴25 30分鐘，40 45°C熱休克I 3分鐘，2°C 5°C冰浴3 5分鐘，5% CO2培養(yǎng)箱37°C孵育50 70分鐘獲能。
該方法優(yōu)選將小鼠附睪精子于5% CO2培養(yǎng)箱37°C孵育10分鐘,然后將含有目的基因的線性DNA片段與精子混合，4°C冰浴30分鐘，42°C熱休克I分鐘，4°C冰浴3分鐘，5%CO2培養(yǎng)箱37°C孵育60分鐘獲能。
其中，所述的含有目的基因的線性DNA片段是將目的基因插入表達(dá)載體后雙酶切得到的包括特異性啟動(dòng)子、目的基因在內(nèi)的線性DNA片段。
所述的含有目的基因的線性DNA片段是將目的基因插入重組表達(dá)載體pTH-CB后經(jīng)Pvul、Smal雙酶切得到的包括特異性啟動(dòng)子、目的基因在內(nèi)的線性DNA片段。所述的重組表達(dá)載體pTH-CB是通過(guò)如下方法獲得:克隆小鼠酪氨酸羥化酶啟動(dòng)子序列和鈣結(jié)合蛋白D-28K基因cDNA序列，用BamH1、HindIII內(nèi)切酶雙酶切小鼠酪氨酸羥化酶啟動(dòng)子序列和質(zhì)粒PCDAN3.1 (+)，回收連接酶切序列，使得小鼠酪氨酸羥化酶啟動(dòng)子序列替換pcDAN3.1 (+)中的CMV啟動(dòng)子序列；在此基礎(chǔ)上，用HindII1、NotI內(nèi)切酶雙酶切上述重組質(zhì)粒和鈣結(jié)合蛋白D-28K基因cDNA序列，將鈣結(jié)合蛋白D-28K基因cDNA序列插入上述重組質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)即得所述的重組表達(dá)載體PTH-CB。有益效果:本發(fā)明精子處理方法即冰浴熱休克法保證了處理后精子的活力，提高精子膜的通透性，同時(shí)便于外源基因片段能夠進(jìn)入精子內(nèi)部，提高了轉(zhuǎn)基因小鼠的轉(zhuǎn)基因效率，使轉(zhuǎn)基因結(jié)果更加可靠可控，解決了以精子為載體制備轉(zhuǎn)基因小鼠效率低、穩(wěn)定性差、傳代困難的問(wèn)題，為轉(zhuǎn)基因小鼠制備提供一種有效的方法。


圖1含有目的基因CaBP的線性DNA片段圖2出生后小鼠目的基因PCR檢測(cè)電泳圖，其中，I泳道為 Mark，2、5、6、7、8為陽(yáng)性鼠，3、4為陰性鼠，9為陰性對(duì)照，10為陽(yáng)性對(duì)照。圖3Western blotting測(cè)定正常鼠和轉(zhuǎn)基因小鼠腦不同部位的CaBP量(η = 3)A:正常鼠腦黑質(zhì)部；Β:轉(zhuǎn)基因鼠腦黑質(zhì)部；C:正常鼠腦腹側(cè)被蓋區(qū)；D:轉(zhuǎn)基因鼠腦腹側(cè)被蓋區(qū)；E:正常鼠腦海馬；F:轉(zhuǎn)基因鼠腦海馬；G:正常鼠大腦皮層；H:轉(zhuǎn)基因鼠大腦皮層。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1、含有目的基因的線性DNA片段以成年C57BL/6J小鼠尾巴為實(shí)驗(yàn)材料，提取其基因組DNA并以其為模板，根據(jù)GenBank中小鼠酪氨酸羥化酶(TH)啟動(dòng)子DNA序列(基因序列號(hào)X 53503)，設(shè)計(jì)特異的PCR引物，由于序列為3650bp，采用重疊延伸PCR法，設(shè)計(jì)2對(duì)引物，分別擴(kuò)增上游1870bp的上游序列和下游ISOObp的下游序列，然后再重疊延伸擴(kuò)增全片段，其序列為SEQ ID N0.7。THFl:5-CATGGATCCAATGATTGGTATGGCTGGGGTCC~3 (SEQ ID N0.L^IABamH I 酶切位點(diǎn))TH R I:5-AGCAAGCTTAGCTGGTGGTCCCGAGTTCTGTC~3 (SEQ I D N0.2,引入 HindIII酶切位點(diǎn))THF2:5-GTTGCTGACCCAGGAAGAGTTC-3(SEQ ID N0.3)THR2:5-GAACTCTTCCTGGGTCAGCAAC-3(SEQ ID N0.4)上、下游片段PCR 擴(kuò)增采用 TaKaRa 公司的 PrimeSTAR HS DNA Polymerase。PCR 反應(yīng)體系為 50ul:5XPrimeSTAR Buffer (Mg2+plus) IOul、dNTP Mixture 4ul、Primerl (IOuM) Iul、Primer2 (IOuM) Iul、DAN 模板 0.5ul、PrimeSTAR HS 0.5ul、雙蒸水35ul o擴(kuò)增上游序列時(shí)Primerl和Primer2分別是:THF1和THR2,擴(kuò)增下游序列時(shí)Primerl和 Primer2 分別是:THF2 和 THR1。PCR 反應(yīng)循環(huán)參數(shù):98 °C 2min，98 °C 10S、50°C 15S、68°C 2min，進(jìn)行 30 個(gè)循環(huán)，68°C 10min，4°C保存。
上、下游片段擴(kuò)增產(chǎn)物回收產(chǎn)物經(jīng)I %瓊脂糖(含0.lug/ml的溴化乙錠)在IXTAE緩沖液以50V電壓電泳Ih,紫外燈下切下目的條帶。用Qiagen膠回收試劑盒回收，其步驟按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。
TH啟動(dòng)子全片段延伸重疊PCR擴(kuò)增PCR反應(yīng)體系為50ul:5XPrimeSTAR Buffer(Mg2+plus) IOul、dNTP Mixture 4ul、引物 THFl (IOuM) Iul、引物 THRl (IOuM) Iul、PrimeSTAR HS 0.5ul、上游序列回收片段0.1ul、下游序列回收片段0.1ul、雙蒸水35.3ul。PCR 反應(yīng)循環(huán)參數(shù):98°C 2min,98°C 10S、53°C 15S、68°C 4min，進(jìn)行 30 個(gè)循環(huán)，68°C IOmin0Qiagen膠回收試劑盒回收，回收產(chǎn)物送上海生工公司測(cè)序部測(cè)定。
根據(jù)GenBank中令丐結(jié)合蛋白D_28k基因cDNA序列(基因序列號(hào)AK002635)序列設(shè)計(jì)PCR引物，采用RT-PCR方法從小鼠腦組織中擴(kuò)增出此序列(CB):取小鼠腦組織提取總mRNA(Trizol —步法)，Promega公司二步法試劑盒進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增出Ca/bindinD-28k基因cDNA序列，送上海生工公司測(cè)序，其序列為SEQ ID N0.8。RT-PCR反應(yīng)體系:5 X Buffer8 μ 1、dNTPs 4 μ 1、上游引物(IOuM) Iul、下游引物(IOuM) Iul、RT 反應(yīng)產(chǎn)物I μ l、Taq 聚合酶(λ 5μ 1、無(wú)酶水 34.5 μ I。反應(yīng)循環(huán)參數(shù):98°C 2min ；98°C 15s，57°C 15s,68°C Imin ;循環(huán) 30 次；68°C 10min，4°C保存。其中個(gè),上游引物:5-AGCAAGCTTTATCCACCCATTTATAGGTGCAGAAG-3 (SEQ I D N0.5，引入 HindIII 酶切位點(diǎn))，下游引物:5~ACGCGGCCGCCTAGTTGTCTCCAGCAGAAAGAATAAG-3 (SEQ ID N0.6 引入 NotI 酶切位點(diǎn))。
用BamH1、HindIII內(nèi)切酶雙酶切(TH)序列和質(zhì)粒pcDAN3.1 (+)(上海生工生物有限公司)，回收連接酶切序列，使得TH啟動(dòng)子序列替換pcDAN3.1 (+)中CMV啟動(dòng)子序列；在此基礎(chǔ)上，用Hindlll、NotI內(nèi)切酶雙酶切上述重組質(zhì)粒和鈣結(jié)合蛋白D-28K基因cDNA序列，將鈣結(jié)合蛋白D-28K基因cDNA序列插入pcDAN3.1的多克隆位點(diǎn)，得到重組質(zhì)粒pTH-CB。
將重組質(zhì)粒pTH-CB經(jīng)Pvul、Smal雙酶切后進(jìn)行I %瓊脂糖凝膠電泳，用QIAquickGel extraction Kit試劑盒純化回收約6000bp目的片段(圖1)，純化DNA片段溶于HTF中，并核酸測(cè)定儀測(cè)定濃度。
實(shí)施例2、精子處理與DNA共孵育
取小鼠的附睪精液，用巴氏吸管吸取精液于平衡好的HTF微滴培養(yǎng)液中。分別按照如下方法進(jìn)行處理:
2.1DMS0處理法:精液中分別加入DMSO和DNA片段，調(diào)節(jié)精子濃度為IO7個(gè)精子/毫升，同時(shí)使精液中DMSO濃度為2%、pTH-CB線性片段量為20微克/毫升，調(diào)整后精液置40C lOmin，然后用平衡后HTF稀釋10倍，37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中獲能lh。
2.2直接孵育法:精液中分別加入pTH-CB片段，濃度為0.01 lug/106精子，37°C>5% CO2培養(yǎng)箱中獲能Ih。
2.3脂質(zhì)體處理法:200uL精液(精子濃度7*105個(gè)/ml)LipofectaminTM2000Reagent0.5uL、0.5ug pTH-CB 片段，37°C、5% CO2 培養(yǎng)箱中獲能 lh。
2.4本發(fā)明冰浴熱休克法:小鼠附 睪精子5% CO2培養(yǎng)箱37°C孵育10分鐘，然后將線性pTH-CB片段與精子混合，濃度為0.0l Iug線性pTH-CB片段/IO6精子，4°C冰浴30分鐘，42°C熱休克I分鐘，4°C冰浴3分鐘，5% CO2培養(yǎng)箱37°C孵育60分鐘獲能。實(shí)施例3、體外授精將超排處理后C57BL/6J小鼠卵丘團(tuán)轉(zhuǎn)移到另外一個(gè)HTF培養(yǎng)基中，分別加入實(shí)施例2中不同方法處理、獲能后的精液，加入精液前，檢測(cè)各種處理方法處理后精子活力。并調(diào)整受精時(shí)精子濃度為7*105個(gè)/ml。37°C、5%的C02培養(yǎng)箱中受精5h。受精后在顯微鏡下將受精卵吸出，用HTF清洗3遍，檢查受精情況，有第二極體的判定為受精卵。計(jì)算受精率，見(jiàn)表1:表I四種方法處理后精子活力比較和體外受精率
權(quán)利要求
1.一種用于制備轉(zhuǎn)基因小鼠的精子處理方法，其特征在于將小鼠附睪精子于5% CO2培養(yǎng)箱37°C孵育8 10分鐘，然后將含有目的基因的線性DNA片段與精子混合，2°C 5°C冰浴25 30分鐘，40 45°C熱休克I 3分鐘，2°C 5°C冰浴3 5分鐘，5% CO2培養(yǎng)箱37°C孵育50 70分鐘獲能。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的精子處理方法，其特征在于將小鼠附睪精子于5% CO2培養(yǎng)箱37°C孵育10分鐘，然后將含有目的基因的線性DNA片段與精子混合，4°C冰浴30分鐘，42°C熱休克I分鐘，4°C冰浴3分鐘，5% CO2培養(yǎng)箱37°C孵育60分鐘獲能。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的精子處理方法，其特征在于所述的含有目的基因的線性DNA片段是將目的基因插入表達(dá)載體后經(jīng)雙酶切得到的包括特異性啟動(dòng)子、目的基因在內(nèi)的線性DNA片段。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的精子處理方法，其特征在于所述的含有目的基因的線性DNA片段是將目的基因插入重組表達(dá)載體PTH-CB后經(jīng)Pvul、Smal雙酶切得到的包括特異性啟動(dòng)子、目的基因在內(nèi)的線性DNA片段。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的精子處理方法，其特征在于所述的重組表達(dá)載體pTH-CB是通過(guò)如下方法獲得:克隆小鼠酪氨酸羥化酶啟動(dòng)子序列和鈣結(jié)合蛋白D-28K基因cDNA序列，用BamH1、HindIII內(nèi)切酶雙酶切小鼠酪氨酸羥化酶啟動(dòng)子序列和質(zhì)粒pcDAN3.1 (+)，回收連接酶切序列，使得小鼠酪氨酸羥化酶啟動(dòng)子序列替換pcDAN3.1(+)中的CMV啟動(dòng)子序列；在此基礎(chǔ)上，用Hindlll、NotI內(nèi)切酶雙酶切上述重組質(zhì)粒和鈣結(jié)合蛋白D-28K基因cDNA序列，將鈣結(jié)合蛋白D-28K基因cDNA序列插入上述重組質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)即得所述的重組表達(dá)載體 pTH-CB。
全文摘要
本發(fā)明屬于轉(zhuǎn)基因領(lǐng)域，涉及一種用于制備轉(zhuǎn)基因小鼠的精子處理方法。一種用于制備轉(zhuǎn)基因小鼠的精子處理方法，將小鼠附睪精子于5％CO2培養(yǎng)箱37℃孵育8～10分鐘，然后將含有目的基因的線性DNA片段與精子混合，2℃～5℃冰浴25～30分鐘，40～45℃熱休克1～3分鐘，2℃～5℃冰浴3～5分鐘，5％CO2培養(yǎng)箱37℃孵育50～70分鐘獲能。該方法能夠提高精子膜的通透性，便于基因片段進(jìn)入精子內(nèi)部，提高轉(zhuǎn)基因效率。解決了以精子為載體制備轉(zhuǎn)基因小鼠效率低、穩(wěn)定性差、傳代困難的問(wèn)題。將為轉(zhuǎn)基因小鼠制備提供一種有效的方法。
文檔編號(hào)C12N5/10GK103243076SQ201210026458
公開(kāi)日2013年8月14日 申請(qǐng)日期2012年2月7日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月7日
發(fā)明者朱孝榮, 袁紅華, 彭長(zhǎng)凌 申請(qǐng)人:朱孝榮, 徐州醫(yī)學(xué)院