專利名稱：一種利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)獲得高烷烴含量牛角瓜的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)獲得高烷烴含量牛角瓜的方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
牛角瓜(Calotropis gigantea)屬于蘿蘑科,直立灌木,可高達(dá)3米,全株有乳汁， 幼枝被灰白色絨毛。零星分布于我國廣東、廣西、云南、海南等地。其乳汁可提煉樹膠原料， 還可制鞣料及黃色染料。莖皮纖維堅(jiān)韌，可制人造棉、造紙、制繩索、織麻布和麻袋等。種毛可作絲絨原料及填充物。牛角瓜為傳統(tǒng)藥用植物，在其分布的熱帶和亞熱帶地區(qū)有悠久的藥用歷史。到19 世紀(jì)80年代科學(xué)家在牛角瓜中發(fā)現(xiàn)含有烴類成分，由此牛角瓜作為能源植物逐漸得到重視。在早期對(duì)能源植物的篩查過程中發(fā)現(xiàn)牛角瓜可以生產(chǎn)生物原油，其主要成分為碳?xì)浠衔铩Ｈ绻?0000株每公頃的種植密度下，其產(chǎn)量可以達(dá)到6. 6桶/公頃。這些生物原油經(jīng)過分析已經(jīng)證明是和石油主要成分相同的碳?xì)浠衔?，而且，這些物質(zhì)的成分及含量并不隨季節(jié)和土壤條件不同而產(chǎn)生明顯變化。但是牛角瓜中烴類成分含量較低，無法滿足工業(yè)利用的要求，因此提高牛角瓜中烷烴含量成為迫切需求。分子育種由于具有周期短、目標(biāo)明確等特點(diǎn)，適用于高烷烴含量牛角瓜品種的培育。目前，生物合成烷烴的代謝途徑的闡明主要來自對(duì)蠟質(zhì)合成的研究結(jié)果。蠟質(zhì)合成的代謝途徑主要包括兩個(gè)不同的代謝途徑乙酰還原途徑和脫羰基途徑(Kunst L et al. Progress in Lipid Research, 2003,42, 51-80),其中燒烴就是脫羰基途徑的一個(gè)重要的中間代謝產(chǎn)物。經(jīng)過研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)一些烷烴合成的關(guān)鍵酶，這些酶負(fù)責(zé)脂肪酸到烷烴的轉(zhuǎn)化，具體的代謝途徑為脂肪酸在?；鵆oA還原酶的作用下生成脂肪醛，再進(jìn)一步由脂肪醛脫羰基酶催化形成烷烴。Aarts 等(Aarts et al. The Plant Cell 1995，7，2115-2127)克隆了擬南芥的CERl基因，CERl主要在莖、花和果實(shí)中表達(dá)，在葉中表達(dá)水平較低。CERl蛋白與膜內(nèi)在蛋白有相似性，是高度疏水性分子。因?yàn)镃ERl突變體中醛大量積累，而烴的含量卻降低，所以推測(cè)CERl蛋白為脫羧酶，催化長鏈醛到烴的轉(zhuǎn)化。Chen等(Chen X et al. The Plant Cell，2003，15，1170-1185)從擬南芥中克隆并鑒定了第一個(gè)能同時(shí)影響上表皮蠟質(zhì)層和角質(zhì)膜層組成和結(jié)構(gòu)的基因WAX2，WAX2突變體與野生型相比具有以下變異角質(zhì)層較野生型輕20%但厚36% ;蠟質(zhì)組分總量降低78%以上；葉面水分蒸發(fā)顯著增強(qiáng)；對(duì)除草劑的耐受力降低。通過對(duì)WAX2基因突變體的研究發(fā)現(xiàn)WAX2基因的突變封閉了醛類物質(zhì)及其代謝物的合成，因此WAX2可能通過影響長鏈乙酰CoA的還原發(fā)揮作用，另外，WAX2突變體的表皮膜的瓦解現(xiàn)象說明WAX2可能在角質(zhì)合成過程也是必須的基因。Kurata等(Kurata T et al. The Plant Journal，2003，36，55-66)隨后也報(bào)道了 WAX2基因(另命名為 Y0RE-Y0RE)的克隆與基因表達(dá)部位的研究，WAX2 (Y0RE-Y0RE)只在莖表皮分生組織和嫩葉、莖、果實(shí)和根的形成初期的細(xì)胞中有特定表達(dá)，在生長的表面毛上有高表達(dá)，WAX2 (Y0RE-Y0RE)可能控制從酰基CoA向醒類和角質(zhì)層組分的轉(zhuǎn)化。Sturaro等(Sturaro M et al. Plant physiology,2005，138,478-489)在玉米中克隆了 WAX2的同源基因命名為GL0SSY1，該基因與玉米表皮的發(fā)育及蠟質(zhì)的積累有關(guān)。另外，Pierre 等(Broun P et al. PNAS，2004，101，4706-4711) 在擬南芥中克隆了 WINl基因，研究發(fā)現(xiàn)該基因?yàn)橐粋€(gè)乙烯誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄因子，一些蠟質(zhì)合成過程中的關(guān)鍵基因例如CERl，KCSl和CER2等均受到該基因的控制，利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)使該基因在擬南芥中過量表達(dá)發(fā)現(xiàn)植物葉表皮蠟質(zhì)的含量達(dá)到對(duì)照組的4. 5倍，并且烷烴占到其中的85 %高于對(duì)照組的65 %。本發(fā)明利用發(fā)根農(nóng)桿菌的介導(dǎo)將烷烴合成過程中涉及的一些關(guān)鍵基因轉(zhuǎn)入牛角瓜中，獲得牛角瓜轉(zhuǎn)基因毛狀根，經(jīng)過在芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基和生根培養(yǎng)基中的培養(yǎng)，最終獲得了轉(zhuǎn)基因牛角瓜，檢測(cè)結(jié)果表明，本發(fā)明中獲得的轉(zhuǎn)基因牛角瓜的烷烴含量得到了明顯提高。 目前尚未見到有關(guān)利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)提高牛角瓜烷烴含量的報(bào)道。發(fā)明目的及內(nèi)容為了解決野生牛角瓜植株中烷烴含量較低的問題，本發(fā)明提供了一種通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)提高牛角瓜中烷烴含量的方法。該方法通過發(fā)根農(nóng)桿菌的介導(dǎo)將烷烴合成過程中涉及的一些關(guān)鍵基因轉(zhuǎn)入牛角瓜中，獲得牛角瓜轉(zhuǎn)基因毛狀根，經(jīng)過在芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基和生根培養(yǎng)基中的培養(yǎng)，最終獲得了轉(zhuǎn)基因牛角瓜。本發(fā)明主要包括以下步驟I.提取擬南芥總RNA并反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生cDNA，以cDNA為模板，利用表I中的三對(duì)引物分別擴(kuò)增WAX2、CERl和WINl基因，并將PCR產(chǎn)物插入T載體，然后進(jìn)行DNA序列分析；2.將測(cè)序正確的WAX2、CER1和WINl基因用BamH I和Sac I從T載體上切下，分別插入植物表達(dá)載體PCAMBIA-1301，構(gòu)建含外源基因的植物表達(dá)載體(圖I)。為了使外源基因能夠順利表達(dá)在該載體的多克隆位點(diǎn)的Xba I和Sal I之間插入了 35S CAMV啟動(dòng)子， Sac I和EcoR I間插入了 NOS終止子。3.采用凍融法將構(gòu)建的含外源基因的植物表達(dá)載體導(dǎo)入發(fā)根農(nóng)桿菌ATCC15834 中，涂布含卡那霉素50mg/L的YEB平板后，在28°C恒溫培養(yǎng)箱，培養(yǎng)2天后，挑取單菌落， 用PCR方法進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)為陽性的克隆用于感染牛角瓜無菌苗的葉片；感染后的外植體在黑暗條件下共培養(yǎng)2天，然后轉(zhuǎn)至含有300mg/L頭孢霉素的MS培養(yǎng)基，25± 1°C，16h/8h 光/暗培養(yǎng)，每隔2周轉(zhuǎn)接一次，共轉(zhuǎn)接3-5次，感染后約3-4周后產(chǎn)生毛狀根，待毛狀根長至2-3cm，用PCR方法分別對(duì)烷烴合成基因進(jìn)行檢測(cè)。4.將檢測(cè)為陽性的發(fā)根切下轉(zhuǎn)至芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選，待獲得的芽長至
l-2cm高時(shí)，轉(zhuǎn)入MS培養(yǎng)基，經(jīng)過2-3周培養(yǎng)，轉(zhuǎn)化植株生根并長成完整再生植株；5.提取轉(zhuǎn)基因牛角瓜的基因組DNA，利用表I中的引物，以獲得的基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測(cè)轉(zhuǎn)基因植株中是否有外源基因的轉(zhuǎn)入；6.提取轉(zhuǎn)基因牛角瓜植株的總RNA并反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生cDNA，利用表I中的引物，以 cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測(cè)外源基因是否在轉(zhuǎn)基因植株中表達(dá)；7.對(duì)獲得的轉(zhuǎn)基因牛角瓜進(jìn)行烷烴含量的分析，篩選烷烴含量高的轉(zhuǎn)基因牛角瓜植株。表I烷烴合成過程關(guān)鍵基因的克隆引物
權(quán)利要求
1.一種利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)獲得高烷烴含量牛角瓜的方法，其特征在于包括以下步驟(1)烷烴合成過程關(guān)鍵基因的克?。惶崛M南芥總RNA并反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生CDNA，以CDNA為模板，根據(jù)烷烴合成過程關(guān)鍵基因的序列設(shè)計(jì)引物，對(duì)其進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將獲得的目的片段插入T載體，然后進(jìn)行DNA序列分析；(2)植物表達(dá)載體的構(gòu)建；將測(cè)序正確的基因用BamH I和Sac I從T載體上切下，插入植物表達(dá)載體，構(gòu)建成含外源基因的植物表達(dá)載體；(3)通過發(fā)根農(nóng)桿菌的介導(dǎo)進(jìn)行植物轉(zhuǎn)化；采用凍融法將含外源基因的植物表達(dá)載體導(dǎo)入發(fā)根農(nóng)桿菌，涂布在含卡那霉素50mg/L 的YEB平板上，在28°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2天后，挑取單菌落，用PCR方法進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)為陽性的克隆用于感染牛角瓜無菌苗的葉片；感染后的牛角瓜葉片在黑暗條件下共培養(yǎng)2 天，然后轉(zhuǎn)至含有300mg/L頭孢霉素的MS培養(yǎng)基，25 ± I °C，16h/8h光/暗培養(yǎng)，每隔2周轉(zhuǎn)接一次，共轉(zhuǎn)接3-5次，感染后約3-4周產(chǎn)生毛狀根，待毛狀根長至2-3cm，用PCR方法進(jìn)行檢測(cè)；(4)轉(zhuǎn)基因植株再生；將檢測(cè)為陽性的毛狀根切下后轉(zhuǎn)至芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進(jìn)行生芽培養(yǎng)，待獲得的芽長至 l-2cm高時(shí)，將獲得的再生芽轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基，經(jīng)過2-3周培養(yǎng)，再生芽生根長成完整再生植株；(5)轉(zhuǎn)基因植株的檢測(cè)和篩選；對(duì)轉(zhuǎn)基因植株采取三步法篩選，第一步，采用PCR方法擴(kuò)增轉(zhuǎn)基因植株的目的基因，檢測(cè)外源基因是否轉(zhuǎn)入；第二步，對(duì)PCR檢測(cè)為陽性的轉(zhuǎn)基因株系進(jìn)行RT-PCR分析，判斷外源基因是否在轉(zhuǎn)基因植株中表達(dá)；第三步，對(duì)獲得的陽性轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行烷烴含量的分析，篩選高產(chǎn)烷烴的轉(zhuǎn)基因牛角瓜。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于步驟I)所述的烷烴合成過程關(guān)鍵基因?yàn)?WAX2、CERl 和 WINl 中的一種。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于所述的烷烴合成過程關(guān)鍵基因的克隆引物是根據(jù)Genbank中擬南芥WAX2、CER1和WINl的mRNA序列進(jìn)行設(shè)計(jì),其序列如表I所示。表I烷烴合成過程關(guān)鍵基因的克隆引物基因引物CERlcerR cerF 5 ’-CGGGATCCATGGCCACAAAACCAGGAGTCCT-3 ’ 5 ’-GCGAGCTCTCACAGGAGTGGACATCCACCAGA-3 ’WAX2waxR 5 ^cgggatccatggttgcttttttatcag-s ’ WaxF 5 ’-GCGAGCTCTCAATTTGTGAGTGAAGAAACA-3 ’WINlwinR: winF:5 ^cgggatccatggtacagacgaagaagttc-s ’ 5 ’-GCGAGCTCTTAGTTTGTATTGAGAAGC-3 ’
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于步驟2)所述的植物表達(dá)載體為pCAMBIA-1301，該載體多克隆位點(diǎn)的Xba I和Sal I之間插入了 35S CAMV啟動(dòng)子，Sac I和 EcoR I間插入了 NOS終止子。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于步驟3)所述的發(fā)根農(nóng)桿菌為ATCC15834。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于步驟3)所述的檢測(cè)轉(zhuǎn)基因發(fā)根所用的 PCR引物如表I所示。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征是步驟4)所述的芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基是MS+0.Img/ L NAA+0. lmg/L 6-BA 或 MS+0. 5mg/L NAA+4. Omg/L 6-BA，生根培養(yǎng)基為 MS。
8.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于步驟5)所述的轉(zhuǎn)基因植株P(guān)CR和RT-PCR 所用的引物如表I所示。
9.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于步驟5)所述的牛角瓜轉(zhuǎn)基因植株中烷烴的提取及檢測(cè)方法如下牛角瓜轉(zhuǎn)基因植株在50°C下干燥至恒重，粉碎后過40目篩，按液固比20 I向粉碎的樣品中加入正己燒，劇烈混合IOmin后，5000rpm離心IOmin進(jìn)行液固分離,取上層液相到一新容器中；按上述方法重復(fù)提取兩次，合并三次正己烷相，50°C減壓蒸餾回收正己烷，膏狀物即為烷烴物質(zhì)粗提物；得到的烷烴提取物用正己烷溶解后用氣相色譜進(jìn)行檢測(cè)；檢測(cè)條件如下進(jìn)樣口 250°C，分流比40 I檢測(cè)器350°C柱溫升溫速率。C /分溫度。C保持時(shí)間(分)-50O. 5103505.0根據(jù)樣品中各烷烴色譜峰的保留時(shí)間與C8-C4tl alkane window標(biāo)準(zhǔn)品中各烷烴的保留時(shí)間進(jìn)行比較，確定牛角瓜轉(zhuǎn)基因植株中烷烴種類；分別利用烷烴標(biāo)準(zhǔn)品建立牛角瓜轉(zhuǎn)基因植株中含有的各種烷烴的標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計(jì)算牛角瓜轉(zhuǎn)基因植株中各種烷烴的含量；牛角瓜轉(zhuǎn)基因植株中含有的各種烷烴的含量總和即為牛角瓜轉(zhuǎn)基因植株的烷烴含量。
全文摘要
本發(fā)明提供一種利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)獲得高烷烴含量牛角瓜的方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。該方法通過將植物烷烴合成過程中涉及的一些關(guān)鍵基因構(gòu)建到植物表達(dá)載體pCAMBIA1301中，得到的嵌合體DNA通過發(fā)根農(nóng)桿菌的介導(dǎo)轉(zhuǎn)化牛角瓜無菌苗的葉片，得到的毛狀根經(jīng)誘導(dǎo)分化后得到轉(zhuǎn)基因牛角瓜植株。通過對(duì)獲得的轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行PCR及RT-PCR分析，結(jié)合氣相色譜對(duì)烷烴含量的檢測(cè)，篩選出高烷烴含量的牛角瓜轉(zhuǎn)基因植株，規(guī)?；庇筮M(jìn)行人工種植。本發(fā)明獲得的轉(zhuǎn)基因牛角瓜植株烷烴含量較野生植株提高30％以上，且具有耐鹽堿、耐干旱、耐瘠薄等特性，在生物能源等領(lǐng)域具有巨大應(yīng)用潛力。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102586271SQ20121000726
公開日2012年7月18日 申請(qǐng)日期2012年1月11日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月11日
發(fā)明者孫健, 王曉東, 趙兵 申請(qǐng)人:中國科學(xué)院過程工程研究所