專利名稱：一種提高埃博霉素b產(chǎn)率的生物合成方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種埃博霉素的生物合成方法，具體地說是一種工業(yè)化生產(chǎn)提高埃博霉素B產(chǎn)率的生物合成方法，屬于抗生素微生物發(fā)酵培養(yǎng)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
埃博霉素B屬于大環(huán)內(nèi)脂類抗生素新成員，埃博霉素是一類具有獨特結(jié)構(gòu)和獨特生物活性的抗生素。其分子結(jié)構(gòu)如下
權(quán)利要求
1.一種提高埃博霉素B產(chǎn)率的生物合成方法，其特征在于包括如下步驟(1)、生產(chǎn)出發(fā)菌種，Soce90-G15:通過3000rpm離心搖瓶菌液選取生長健壯的粘細菌作為生產(chǎn)出發(fā)菌種；(2)、固體斜面擴培培養(yǎng)基的組分按質(zhì)量％計為，葡萄糖0.5 1%、蛋白胨O.3 0.5%、淀粉O.5 I %、氯化鈉O. I 0.5%、赤霉素O. 002%和瓊脂粉2%，余量為水；培養(yǎng)基在120°C、30分鐘滅菌冷卻后布置成斜面，24小時后把生產(chǎn)出發(fā)菌種涂布于斜面上，在 30±2°C、相對濕度55%，7 9天可見生長豐滿、金黃色的菌苔，冷藏待用；(3)、搖瓶擴培搖瓶培養(yǎng)基為淀粉5 8g/L、酵母提取物2 4g/L、葡萄糖O.5 1.5g/L、MgS04 lg/L,CaCl2 lg/L、甘油 O. 5 lg/L、磷酸二氫鈉 O. 05g/L、豆餅粉 2 4g/L， 飲用水I升，調(diào)PH為7. 20、在120°C、30分鐘滅菌；把固體斜面的菌苔輕輕刮下接入搖瓶培養(yǎng)基，在29°C ± 1°C、轉(zhuǎn)速150rpm下，生長5 6天；選取菌體生長健壯的搖瓶菌種液轉(zhuǎn)接入一級種子罐；(4)、一級種子培養(yǎng)一級種子培養(yǎng)基的組成與搖瓶培養(yǎng)基相同，也在120°C、30分鐘滅菌；把生長好的搖瓶菌種液通過壓差法接入一級種子罐中擴培，培養(yǎng)溫度29±2°C、轉(zhuǎn)速 120rpm、空氣流量比I比O. 4、罐壓O. 04kg/cm2，培養(yǎng)5 6天，將生長旺盛的菌種液轉(zhuǎn)接入二級種子罐；(5)、二級種子罐培養(yǎng)二級種子培養(yǎng)基的組成與搖瓶培養(yǎng)基相同，也在120°C、30分鐘滅菌；把生長好的一級菌種液通過壓差法接入二級種子罐中擴培，培養(yǎng)溫度29±2°C、轉(zhuǎn)速 120rpm、空氣流量比I比O. 5、罐壓O. 04kg/cm2，培養(yǎng)2 3天，將生長旺盛的菌種液轉(zhuǎn)接入發(fā)酵罐；(6)、發(fā)酵罐培養(yǎng)發(fā)酵培養(yǎng)基的組成與搖瓶培養(yǎng)基相同，但外加前體誘導物O.2 O.5g/L、大孔吸附樹脂20g/L ;PH調(diào)整至7. 30，120°C >30分鐘滅菌；把生長好的二級菌種液通過壓差法接入發(fā)酵罐中擴培，培養(yǎng)產(chǎn)品的溫度29±2°C、轉(zhuǎn)速150rpm、空氣流量比I比O.8、罐壓 O. 04kg/cm2、培養(yǎng) 10 11 天;(7)、洗滌、洗脫發(fā)酵至殘?zhí)堑陀?.2%，在代謝活性物質(zhì)產(chǎn)出高點時終止發(fā)酵，將發(fā)酵液中的的樹脂分離出來淘洗干凈裝入樹脂床內(nèi)；用50%甲醇洗滌I倍柱床量、流速25ml/ min，脫色、除雜；再用6倍柱床量乙酸乙酯，流速15ml/min洗脫埃博霉素A、埃博霉素B活性物質(zhì)，收集洗脫液；(8 )、真空濃縮把收集的含活性物質(zhì)的洗脫液真空濃縮，溫度4 O 4 5 °C、真空度-O. 085 -O. 095MPa，濃縮至原始體積量的1/15以下；(9)、液相制備柱分離把濃縮液通過液相制備柱分離收集埃博霉素B部份分離液；(10)、萃取把收集的含埃博霉素B分離液真空濃縮至剩余水相，加入有機溶劑進行萃取分離收集有機相；(11)、結(jié)晶把收集的有機相真空濃縮，溫度40 45°C、真空度-O.085 -O. 09MPa、濃縮至原始體積量的1/10以下；把濃縮液放入潔凈的結(jié)晶器中_20°C低溫結(jié)晶；(12)、真空干燥；收集結(jié)晶體放入潔凈的真空干燥箱，溫度45 50°C、真空度-O. 085 -O. 09MPa ;干燥得到含量99. 5%以上的活性產(chǎn)物埃博霉素B成品。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種提高埃博霉素B產(chǎn)率的生物合成方法，其特征在于所述的擴培可采用搖瓶振蕩培養(yǎng)或攪拌沉沒培養(yǎng)方式，工業(yè)化生產(chǎn)首選攪拌沉沒方式。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種提高埃博霉素B產(chǎn)率的生物合成方法，其特征在于所述在發(fā)酵培養(yǎng)基中外加的前體誘導物為苯丙氨酸，或是它的有機鹽，其加入培養(yǎng)基的方法為一次投入或是間歇流加。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種提高埃博霉素B產(chǎn)率的生物合成方法，其步驟是采用離心法選出健壯的產(chǎn)埃博霉素B菌種接種于滅菌的種子培養(yǎng)基中，在30℃的搖床振蕩培養(yǎng)后再發(fā)酵；并向發(fā)酵培養(yǎng)基中添加前體誘導物苯丙氨酸；在30℃培養(yǎng)10～11天后收獲培養(yǎng)液；再經(jīng)大孔樹脂收集吸附飽和，乙酸乙酯洗脫，分離純化、真空濃縮、萃取、低溫結(jié)晶、真空干燥。本發(fā)明將動態(tài)洗脫法用于埃博霉素B的工業(yè)化生產(chǎn)，使規(guī)?；a(chǎn)成為可能。通過液相制備柱可有效地提純埃博霉素B的純度，其純度可達99.5％以上，同時采用甲醇進行萃取分離，使埃博霉素B在甲醇中結(jié)晶，成品能達到醫(yī)藥級水平。本方法大幅度提高埃博霉素B產(chǎn)率達到30～45％，具有良好的工業(yè)化生產(chǎn)前景。
文檔編號C12P17/18GK102586358SQ20121000693
公開日2012年7月18日 申請日期2012年1月11日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月11日
發(fā)明者何福彪, 張文凱, 陳慶源 申請人:湖北宏中藥業(yè)有限公司