專利名稱：用于在玉米中增強玉米大斑病抗性的組合物和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本公開涉及用于在玉米植株中增強玉米大斑病抗性的組合物和方法。
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背景技術(shù)：
由真菌病原體大斑突臍螺孢菌(Exserohilum turcicum)(以前稱為大斑長螺孢菌(Helminthosporium turcicum))引起的玉米大斑病(NLB)是玉米在許多熱帶和溫帶環(huán)境中的嚴重的葉枯萎病害。癥狀能夠從下部葉片上雪茄狀的病變直到葉的完全破壞，從而減少了能夠用于光合作用的葉片表面積。光合作用能力的降低導(dǎo)致灌漿所需的碳水化合物的不足，影響作物產(chǎn)量。由于露時長并且溫度適中，熱帶地區(qū)大約海平面以上大約900-1600m的中等海拔高度地區(qū)具有尤其適合玉米大斑病的氣候。然而，玉米大斑病在溫帶環(huán)境(例如在美國)中也能夠在雨季導(dǎo)致30-50%的損失，尤其是當(dāng)植株的上部葉片上在抽絲期已被感染時。真菌大斑突臍蠕孢菌(Et)以菌絲和分生孢子的形式在留在土壤表面的玉米殘留物上越冬。分生孢子轉(zhuǎn)變成休眠孢子，在溫暖潮濕的天氣，產(chǎn)生新的分生孢子，然后由風(fēng)或雨搬運至玉米幼苗的下部葉片上。感染需要水在葉片表面存在6-18小時以及介于66° F和80° F之間的溫度。如果發(fā)生感染，病變會在7-12天內(nèi)發(fā)展，并產(chǎn)生新的分生孢子，新的分生孢子將感染轉(zhuǎn)播至次級位點。病害治理策略包括輪作、通過耕耘破壞舊的玉米殘留物、以及施用殺真菌劑，所有這些策略均旨在減少真菌種菌。然而，控制玉米大斑病的最有效和最優(yōu)選的方法是種植抗性雜交種。自然中存在大斑突臍蠕孢菌的多個品種或小種，這留給了種植者兩種雜交選擇部分抗性的雜交種，其提供針對多個小種的低水平、廣譜的防護和小種特異性抗性雜交種，其針對特定小種進行防護。對大斑突臍蠕孢菌的抗性的遺傳來源已被描述，并且四種大斑突臍蠕孢菌(以前稱為大斑長蠕孢菌)抗性基因座已被鑒定Htl、Ht2、Ht3和Htnl0基因Htl定位在2號染色體的長臂上，其與umc36(Coe，E. H.等人(1988) Corn andCornImprovement,第 3 版，第 81-258 頁)、sgcr506 (Gupta, Μ.等人(1989)Maize Genet.Coop. Newsl. 63,112) > umcl50B (Bentolila, S.等人(1991) Theor. Appl. Genet. , 82 393-398)、以及 picl8a(Collins 等人(1998)Molecular Plant-Microbe Interactions,11 :968-978)緊密連鎖，并且其緊密兩側(cè)為umc22和umcl22(Li等人(1998)Hereditas,129 =101-106) ο基因Ht2定位在8號染色體的長臂上，位于umc48-umc89區(qū)間(Zaitlin等人(1992) Maize Genet. Coop. Newsl.，66，69-70)，并且基因Ht3定位在7號染色體上，位于bnlgl666 (Van Staden,D 等人(2001) Maize GeneticsConferenceAbstracts43 :第 134 頁)附近。Htnl基因定位在8號染色體上,大約位于Ht2遠端IOcM和RFLP標(biāo)記umcll7 (Simcox和 Bennetzen(1993)Maize Genet. Coop. Newl. ,67,118-119 ；Simcox 和 Bennetzen(1993)Phytopathology, 83 1326-1330 ;Chung 等人(2010) Theor AppGen Epub)遠端 0. 8cM 處。通過減少真菌種菌控制玉米大斑病的方法需要農(nóng)民付出額外的時間和物力，此處，還能夠具有對環(huán)境的有害效應(yīng)。這使得種植抗性雜交種對農(nóng)民和公眾甚至更加具有吸引力。因此，希望提供用于鑒定和選擇具有增強的玉米大斑病抗性的玉米植株的組合物和方法。這些植株能夠被用于育種程序中以產(chǎn)生具有玉米大斑病抗性的高產(chǎn)雜交種。發(fā)明概沭本發(fā)明提供了用于鑒定和選擇具有增強的玉米大斑病抗性的玉米植株的組合物和方法。在一個實施方案中，介紹了選擇具有增強的玉米大斑病抗性的玉米植株的方法。所述方法包括在所述玉米植株中檢測一個或多個標(biāo)記等位基因，所述標(biāo)記等位基因與下列單倍型連鎖并關(guān)聯(lián)在NLB17_A處的PH26N單倍型，在NLB17_E處的PH26N單倍型，在NLB17_3處的PH26N單倍型，在NLB18_A處的PH26N單倍型，在NLB18_E處的PH26N單倍型，在NLB18_A處的PH99N單倍型，或在NLB18_E處的PH99N單倍型。然后，具有與以上所列的任何單倍型連鎖并關(guān)聯(lián)的一個或多個標(biāo)記等位基因的玉米植株被選擇為具有增強的玉米大斑病抗性。在另一個實施方案中，所述標(biāo)記等位基因能夠以30cM、25cM、20cM、15cM、10cM、9cM、8cM、7cM、6cM、5cM、4cM、3cM、2cM、lcM、0. 9cM、0. 8cM、0. 7cM、0. 6cM、0. 5cM、0. 4cM、0. 3cM、0. 2cM、或0. IcM的距離與下列任何單倍型連鎖在NLB17_A處的PH26N單倍型，在NLB17_E處的PH26N單倍型，在NLB17_3處的PH26N單倍型，在NLB18_A處的PH26N單倍型，在NLB18_E處的PH26N單倍型，在NLB18_A處的PH99N單倍型，或在NLB18_E處的PH99N單倍型。在另一個實施方案中，介紹了選擇具有增強的玉米大斑病抗性的玉米植株的方法。所述方法包括在所述玉米植株中檢測單倍型，其中所述單倍型能夠是下列中的任一個在NLB17_A處的PH26N單倍型，在NLB17_E處的PH26N單倍型，在NLB17_3處的PH26N單倍型，在NLB18_A處的PH26N單倍型，在NLB18_E處的PH26N單倍型，在NLB18_A的PH99N單倍型，或在NLB18_E處的PH99N單倍型。然后，具有所述單倍型的玉米植株被選擇為具有增強的玉米大斑病抗性。在另一個實施方案中，提供了通過在玉米植株的種質(zhì)中檢測與增強的抗性關(guān)聯(lián)的至少一個標(biāo)記等位基因來鑒定具有增強的玉米大斑病抗性的玉米植株的方法。所述標(biāo)記基因座能夠選自下列標(biāo)記基因座中的任一個PHM2798、b0302Hl、b0611N13、2717_3、2717_4、108f!6_2、31004、pco642297_3、bl09.m6、PHM18979、b0507L21、2_2、156K16、b0318il3、PHM4757、PHM13395-27、PHM4677-11、PHM3418-12、PHM15992-3、NLB5A、NLB3A、PHM4582、9gl3-3、K、6_7、6_8、N、R、S、U、PHM2817-26、PHM7446-6、PHM13395-16、NLB17_A、NLB17_E、NLB17_3、NLB18_A、或NLB18_E ;以及與這些標(biāo)記連鎖的任何其他標(biāo)記。所述標(biāo)記基因座包含與增強的玉米大斑病抗性關(guān)聯(lián)的至少一個等位基因。用該方法鑒定的玉米植株也是受關(guān)注的。在另一個實施方案中，提供了通過在玉米植株的種質(zhì)中檢測單倍型來鑒定具有增強的玉米大斑病抗性的玉米植株的方法，其中所述單倍型與增強的玉米大斑病抗性關(guān)聯(lián)。所述單倍型在一個或多個標(biāo)記基因座處包含等位基因，其中所述一個或多個標(biāo)記基因座位于8號染色體區(qū)間內(nèi)，所述染色體區(qū)間包含并且兩側(cè)為i.標(biāo)記 PHM4582 和 R，或
ii.標(biāo)記 6_8 和 R。在另一個實施方案中，所述單倍型是在NLB17_A處的PH26N單倍型，在NLB17_E處的PH26N單倍型，在NLB17_3處的PH26N單倍型，在NLB18_A處的PH26N單倍型，在NLB18_E處的PH26N單倍型，在NLB18_A處的PH99N單倍型，或在NLB18_E處的PH99N單倍型。在另一個實施方案中，提供了選擇具有增強的玉米大斑病抗性的植株的方法。在一個方面，獲得第一玉米植株，所述第一玉米植株具有在NLB17_A處的PH26N單倍型，在NLB17_E處的PH26N單倍型，在NLB17_3處的PH26N單倍型，在NLB18_A處的PH26N單倍型，在NLB18_E處的PH26N單倍型，在NLB18_A處的PH99N單倍型，或在NLB18_E處的PH99N單倍型。然后，所述第一玉米植株能夠與第二玉米植株雜交，并且能夠就所述單倍型的存在，對得自所述雜交的子代植株進行評估。具有所述第一玉米植株的單倍型的子代植株能夠被選擇為具有增強的玉米大斑病抗性。用該方法選擇的子代植株也是受關(guān)注的。在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及分離的多核苷酸，所述多核苷酸包括(a)編碼能夠賦予或增強玉米大斑病抗性的多肽的至少一種核苷酸序列，其中基于Clustal V比對方法，在與SEQ ID NO :93、95、或97進行比較時，所述多肽具有至少90%序列同一性的氨基酸序列；或(b)所述核苷酸序列的全長互補序列，其中該全長互補序列與該核苷酸序列由相同數(shù)目的核苷酸組成并且是100%互補的。所述多肽可以包含SEQ ID N0:93、95、或97的氨基酸序列。所述核苷酸序列可以包含SEQ ID N0:92、94、或96的核苷酸序列。在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及載體，所述載體包含受權(quán)利要求書保護的分離的多核苷酸。在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及重組DNA構(gòu)建體，所述重組DNA構(gòu)建體包含可操作地連接至至少一種調(diào)控序列的本發(fā)明的分離的多核苷酸。在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及玉米細胞，所述玉米細胞包含本發(fā)明的重組DNA構(gòu)建體或分離的多核苷酸。在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及用于生產(chǎn)玉米植株的方法，所述方法包括用本發(fā)明的重組DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化植株細胞以及從轉(zhuǎn)化的植株細胞再生植株。在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及玉米植株，所述玉米植株包含本發(fā)明的重組DNA構(gòu)建體。在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及玉米種子，所述玉米種子包含本發(fā)明的重組DNA構(gòu)建體。在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及賦予或提高玉米大斑病抗性的方法，所述方法包括用本發(fā)明的重組DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化植株，從而賦予或提高玉米大斑病抗性。在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及確定本發(fā)明的多核苷酸在玉米植株中是否存在的方法，所述方法包括下列中的至少一個(a)從所述玉米植株中分離核酸分子并擴增與本發(fā)明的多核苷酸同源的序列，或(b)從所述玉米植株中分離核酸分子并進行DNA雜交，或(c)從所述玉米植株中分離蛋白質(zhì)并利用該蛋白質(zhì)的抗體進行蛋白質(zhì)印跡，或(d)從所述玉米植株中分離蛋白質(zhì)并利用該蛋白質(zhì)的抗體進行ELISA測定，或
(e)證明來源于mRNA轉(zhuǎn)錄物、并且為玉米大斑病抗性基因座所特有的mRNA序列的存在，從而確定本發(fā)明的多核苷酸在所述玉米植株中的存在。在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及確定玉米大斑病抗性基因座在玉米植株中是否存在的方法，所述方法包括下列中的至少一個(a)從所述玉米植株中分尚核酸分子并擴增本發(fā)明的多核苷酸所特有的序列,或(b)從所述玉米植株中分離蛋白質(zhì)并利用該蛋白質(zhì)的抗體進行蛋白質(zhì)印跡，或(c)從所述玉米植株分離蛋白質(zhì)并利用該蛋白質(zhì)的抗體進行ELISA測定，或(d)證明來源于mRNA轉(zhuǎn)錄物、并且為玉米大斑病抗性基因座所特有的mRNA序列的 存在，從而確定所述玉米大斑病抗性基因座在所述玉米植株中的存在。在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及改變能賦予玉米細胞玉米大斑病抗性的蛋白質(zhì)的表達水平的方法，所述方法包括(a)用本發(fā)明的重組DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化玉米細胞；以及(b)使所述轉(zhuǎn)化的玉米細胞在適于所述重組DNA構(gòu)建體表達的條件下生長，其中所述重組DNA構(gòu)建體的表達引起能在所述轉(zhuǎn)化的玉米細胞中賦予玉米大斑病抗性的蛋白質(zhì)的表達且其表達水平與該蛋白質(zhì)在具有玉米大斑病抗性的野生型玉米植株中的表達水平相比發(fā)生改變。在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及改變能賦予玉米細胞玉米大斑病抗性的蛋白質(zhì)的表達水平的方法，所述方法包括(a)用本發(fā)明的重組DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化玉米細胞；以及(b)使所述轉(zhuǎn)化的玉米細胞在適于所述重組DNA構(gòu)建體表達的條件下生長，其中所述重組DNA構(gòu)建體的表達引起能在所述轉(zhuǎn)化的玉米細胞中賦予玉米大斑病抗性的蛋白質(zhì)的表達且其表達水平與該蛋白質(zhì)在具有玉米大斑病抗性的野生型玉米植株中的表達水平相比發(fā)生改變。在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及改變能賦予玉米植株玉米大斑病抗性的蛋白質(zhì)的表達水平的方法，所述方法包括(a)用本發(fā)明的重組DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化玉米植株細胞；以及(b)從所述轉(zhuǎn)化的玉米植株細胞再生轉(zhuǎn)化的玉米植株；以及(c)使所述轉(zhuǎn)化的玉米植株在適于所述重組DNA構(gòu)建體表達的條件下生長，其中所述重組DNA構(gòu)建體的表達引起能在所述轉(zhuǎn)化的玉米植株中賦予玉米大斑病抗性的蛋白質(zhì)的表達且其表達水平與該蛋白質(zhì)在具有玉米大斑病抗性的野生型玉米植株中的表達水平相比發(fā)生改變。在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及改變能賦予玉米植株玉米大斑病抗性的蛋白質(zhì)的表達水平的方法，所述方法包括(a)用本發(fā)明的重組DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化玉米植株細胞；以及(b)從所述轉(zhuǎn)化的玉米植株細胞再生轉(zhuǎn)化的玉米植株；以及(c)使所述轉(zhuǎn)化的玉米植株在適于所述重組DNA構(gòu)建體表達的條件下生長，其中所述重組DNA構(gòu)建體的表達引起能在所述轉(zhuǎn)化的玉米植株中賦予玉米大斑病抗性的蛋白質(zhì)的表達且其表達水平與該蛋白質(zhì)在具有玉米大斑病抗性的野生型玉米植株中的表達水平相比發(fā)生改變。附圖
和序列表簡沭根據(jù)以下的詳細描述和附圖以及序列清單，可以更全面地理解本發(fā)明，以下的詳細描述和附圖以及序列清單形成本申請的一部分。此序列表中以單個字母表示核苷酸，以三個字母表不氛基酸，如 Nucleic Acids Researchl3 :3021-3030 (1985)和 BiochemicalJournal 219(2) :345-373(1984)所描述的IUPAC-IUBMB標(biāo)準(zhǔn)中所規(guī)定，它們以引用方式全文并入本文。用于核苷酸和氨基酸序列數(shù)據(jù)的符號和格式遵循如37C. F. R. § I. 822所示的規(guī)定。圖I顯示了測序的BAC(酵母人工染色體)(得自玉米基因組測序計劃)在與玉米大斑病關(guān)聯(lián)的QTL (數(shù)量性狀基因座)所位于的8號染色體區(qū)域中的物理圖譜排列方式。標(biāo)示了能夠被用于標(biāo)記輔助的選擇(MAS)的本文所述的標(biāo)記的位置。
圖2顯示了 mRNA和Fgenesh預(yù)測的開放閱讀框在帶注釋的PH26NBAC中的排列方式。標(biāo)示了代表推定的蛋白激酶的Fgenesh預(yù)測的NLB17和NLB18開放閱讀框。圖3顯示了被用作對玉米大斑病感染評分的指南的圖表。序列描述以及所附序列表遵循如37C. F. R. § I. 821-1. 825所示的關(guān)于專利申請中核苷酸和/或氨基酸序列公開的規(guī)定。此序列表中以單個字母表示核苷酸，以三個字母表示氨基酸，如 Nucleic Acids Res. 13 :3021-3030 (1985)和 Biochemical J. 219(2)345-373 (1984)所描述的，它們以引用方式并入本文。用于核苷酸和氨基酸序列數(shù)據(jù)的符號和格式遵循如37C. F. R. § I. 822所示的規(guī)定。SEQ ID NO :1是PHM2798正向引物的序列。SEQ ID NO : 2是PHM2798反向引物的序列。SEQ ID NO :3是b0302Hl正向引物的序列。SEQ ID NO :4是b0302Hl反向引物的序列。SEQ ID NO :5是b0611N13正向引物的序列。SEQ ID NO :6是b0611N13反向引物的序列。SEQ ID NO :7是2717_3正向引物的序列。SEQ ID NO :8是2717_3反向引物的序列。SEQ ID NO :9是2717_4正向引物的序列。SEQ ID NO :10是2717_4反向引物的序列。SEQ ID NO : 11 是 108fl6_2 正向引物的序列。SEQ ID NO 12 是 108fl6_2 反向引物的序列。SEQ ID NO :13是31004正向引物的序列。SEQ ID NO :14是31004反向引物的序列。SEQ ID NO :15 是 pco642297_3 正向引物的序列。SEQ ID NO :16 是 pco642297_3 反向引物的序列。SEQ ID NO :17是bl09. m6正向引物的序列。SEQ ID NO :18是bl09. m6反向引物的序列。SEQ ID NO :19 是 PHM18979 正向引物的序列。
SEQIDNO :20 是 PHM18979 反向引物的序列。SEQIDNO 21 是 b0507L21 正向引物的序列。SEQIDNO : 22 是 b0507L21 反向引物的序列。SEQIDNO :23是22正向引物的序列。SEQIDNO : 24是2_2反向引物的序列。SEQIDNO 25是156K16正向引物的序列。SEQIDNO :26是156K16反向引物的序列。SEQIDNO :27 是 b0318il3 正向引物的序列。 SEQIDNO :28 是 b0318il3 反向引物的序列。SEQIDNO :29是PHM4757正向引物的序列。SEQIDNO :30是PHM4757反向引物的序列。SEQIDNO 31是NLB5A正向引物的序列。SEQIDNO : 32是NLB5A反向引物的序列。SEQIDNO : 33 是 NLB5A 探針的序列。SEQIDNO : 34是NLB3A正向引物的序列。SEQIDNO : 35是NLB3A反向引物的序列。SEQIDNO : 36 是 NLB3A 探針的序列。SEQIDNO :37 是 PHM2817-26 正向引物的序列。SEQIDNO :38 是 PHM2817-26 反向引物的序列。SEQIDNO :39 是 PHM7446-6 正向引物的序列。SEQIDNO :40 是 PHM7446-6 反向引物的序列。SEQIDNO :41是PHM4582正向引物的序列。SEQIDNO :42是PHM4582反向引物的序列。SEQIDNO :43是9gl3_3正向引物的序列。SEQIDNO :44是9gl3_3反向引物的序列。SEQIDNO :45是K正向引物的序列。SEQIDNO :46是K反向引物的序列。SEQIDNO :47是6_7正向引物的序列。SEQIDNO :48是6_7反向引物的序列。SEQIDNO :49是6_8正向引物的序列。SEQIDNO : 50是6_8反向引物的序列。SEQIDNO :51是N正向引物的序列。SEQIDNO :52是N反向引物的序列。SEQIDNO :53是R正向引物的序列。SEQIDNO :54是R反向引物的序列。SEQIDNO :55是S正向引物的序列。SEQIDNO :56是S反向引物的序列。SEQIDNO :57是U正向引物的序列。SEQIDNO :58是U反向引物的序列。
SEQIDNO :59 是 PHM13395-16 正向引物的序列。SEQIDNO :60 是 PHM13395-16 反向引物的序列。SEQIDNO :61 是 PHM3418-12 正向引物的序列。SEQIDNO :62 是 PHM3418-12 反向引物的序列。SEQIDNO :63 是 PHM13395-27 正向引物的序列。SEQIDNO :64 是 PHM13395-27 反向引物的序列。SEQIDNO :65 是 PHM4677-11 正向引物的序列。
SEQIDNO :66 是 PHM4677-11 反向引物的序列。
SEQIDNO :67 是 PHM15992-3 正向引物的序列。SEQIDNO :68 是 PHM15992-3 反向引物的序列。SEQIDNO :69是NLB17_A正向引物的序列。SEQIDNO :70是NLB17_A反向引物的序列。SEQIDNO :71是NLB17_E正向引物的序列。SEQIDNO :72是NLB17_E反向引物的序列。SEQIDNO :73是NLB17_3正向引物的序列。SEQIDNO :74是NLB17_3反向引物的序列。SEQIDNO :75是NLB18_A正向引物的序列。SEQIDNO :76是NLB18_A反向引物的序列。SEQIDNO :77是NLB18_E正向引物的序列。SEQIDNO :78是NLB18_E反向引物的序列。SEQIDNO 79是添加至NLB17和NLB18標(biāo)記組的正向引物的尾巴的序列。SEQIDNO 80是添加至NLB17和NLB18標(biāo)記組的反向引物的尾巴的序列。SEQIDNO :81 是 PHM13395 參考序列。SEQIDNO :82 是 PHM4677 參考序列。SEQIDNO :83 是 PHM3418 參考序列。SEQIDNO :84 是 PHM15992 參考序列。SEQIDNO :85 是 PHM2817 參考序列。SEQIDNO 86 是 PHM7446 參考序列。SEQIDNO :87 是 NLB17_A 參考序列。SEQIDNO 88 是 NLB17_E 參考序列。SEQIDNO :89 是 NLB17_3 參考序列。SEQIDNO 90 是 NLB18_A 參考序列。SEQIDNO 91 是 NLB18_E 參考序列。SEQIDNO 92 是來自 PH26N 的 NLB17 cDNA 序列。SEQIDNO 93是由SEQ ID NO 92編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列。SEQIDNO 94 是來自 PH99N 的 NLB18 cDNA 序列。SEQIDNO 95是由SEQ ID NO 94編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列。SEQIDNO 96 是來自 PH26N 的 NLB18 cDNA 序列。SEQIDNO 97是由SEQ ID NO 96編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列。
發(fā)明詳沭本發(fā)明提供了玉米中的等位基因組合物以及鑒定和選擇具有增強的玉米大斑病抗性的玉米植株的方法。提供以下定義以利于理解本發(fā)明。術(shù)語“等位基因”指在特定基因座處發(fā) 生的兩個或更多個不同核苷酸序列的其中一個。“等位基因頻率”指等位基因存在于個體、品系、或一組品系中的基因座上的頻率(比例或百分比)。例如，就等位基因“A”而言，基因型“AA”、“Aa”、或“aa”的二倍體個體分別具有I. 0,0. 5、或O. O的等位基因頻率。人們能夠通過平均化來自品系的個體樣品的等位基因頻率來估計該品系中的等位基因頻率。同樣地，人們能夠通過平均化構(gòu)成種群的品系的等位基因頻率來計算該種群品系中的等位基因頻率。就一組限定數(shù)目的個體或品系而言，可將所有等位基因頻率表示為包含等位基因的個體或品系(或任何其他指定組)的計數(shù)?！皵U增子”是被擴增的核酸，例如使用任何可用的擴增方法(例如PCR、LCR、轉(zhuǎn)錄等)通過擴增模板核酸制備的核酸。在核酸擴增的情況下術(shù)語“擴增”是其中產(chǎn)生附加拷貝的選擇核酸(或其轉(zhuǎn)錄形式)的任何過程。一般的擴增方法包括基于多種聚合酶的復(fù)制方法，包括聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)、連接酶介導(dǎo)的方法如連接酶鏈反應(yīng)(LCR)、以及基于RNA聚合酶的擴增(例如通過轉(zhuǎn)錄)方法。術(shù)語“裝配”應(yīng)用于BAC以及它們聚集以形成鄰接DNA片段的傾向。BAC基于序列比對“裝配”成重疊群，如果BAC進行測序，或者經(jīng)由它的BAC指紋與其他BAC指紋的比對“裝配”成重疊群?？墒褂靡蛱鼐W(wǎng)上公開可用的Maize Genome Browser找到所述裝配。當(dāng)?shù)任换蚺c性狀連鎖時，以及當(dāng)存在的等位基因是期望的性狀或性狀形式將發(fā)生在包含等位基因的植株中的指示時，等位基因與性狀“關(guān)聯(lián)”。“BAC”或細菌人工染色體是來源于大腸桿菌(Escherichia coli)天然存在的F因子的克隆載體。BAC能夠接受DNA序列的較大插入序列。在玉米中，已經(jīng)將許多BAC或細菌人工染色體裝配成重疊群(重疊的鄰接基因片段，或“鄰接DNA”)，它們每個包含玉米基因組DNA的較大插入序列?！盎亟弧敝钙渲须s交子代反復(fù)與其中一個親本回交的過程。在一個回交方案中，“供體”親本指具有將被滲入的期望基因或基因座的親本植株?！笆荏w”親本(使用一次或多次)或“輪回”親本(使用兩次或多次)指將基因或基因座滲入其中的親本植株。例如參見Ragot,M.等人(1995)Marker-assisted backcrossing a practical example,Techniqueset Utilisations desMarqueurs Moleculaires Les Colloques,第 72 卷，第 45-56 頁，以及 Openshaw 等人(1994)Marker-assisted Selection in Backcross Breeding, AnalysisofMolecular Marker Data，第41-43頁。初始雜交產(chǎn)生Fl代；然后，術(shù)語“BC1”指輪回親本的第二次使用，“BC2”指輪回親本的第三次使用等等。厘摩(“CM”)是重組頻率的量度單位。IcM等于經(jīng)過單代雜交在一個基因座上的標(biāo)記將與在第二基因座上的標(biāo)記分離的I%的概率。如本文所用，術(shù)語“染色體區(qū)間”指位于植株單個染色體上的基因組DNA的鄰接線性區(qū)域。位于單染色體間隔上的遺傳因子或基因是物理上連鎖的。不特別限定染色體區(qū)間的大小。在一些方面，位于單個染色體區(qū)間內(nèi)的基因元件在遺傳上連鎖，遺傳重組距離通常為例如小于或等于20cM，或者小于或等于10cM。即，位于單個染色體區(qū)間內(nèi)的兩個基因元件以小于或等于20%或10%的頻率進行重組?！叭旧w”也可稱為“連鎖群”。在本專利申請中，短語“緊密連鎖”指兩個連鎖基因座間重組的發(fā)生頻率為等于或小于約10% (即在基因圖譜上的分離頻率不超過IOcM)。換句話說，緊密連鎖的基因座至少90%的情況下共分離。當(dāng)標(biāo)記基因座顯示與期望性狀(例如病原體抗性)共分離(連鎖)的顯著概率時，它們在本發(fā)明中尤其有用。緊密連鎖的基因座如標(biāo)記基因座和第二基因座可顯示10 %或更低，優(yōu)選約9 %或更低，更優(yōu)選約8 %或更低，更優(yōu)選約7 %或更低，更優(yōu)選約6 %或更低，更優(yōu)選約5 %或更低，更優(yōu)選約4 %或更低，更優(yōu)選約3 %或更低，更優(yōu)選約2%或更低的基因座內(nèi)重組頻率。在高度優(yōu)選的實施方案中，關(guān)聯(lián)基因座顯示約1%或更低的重組頻率，例如約O. 75%或更低，更優(yōu)選約O. 5%或更低，更優(yōu)選約O. 25%或更低的重組頻率。位于相同染色體上，并且它們間的距離使得兩個基因座間的重組發(fā)生頻率小于 10% (例如約9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0· 75%,O. 5%,O. 25%、或更低)的兩個基因座也稱為彼此“接近”。在某些情況下，兩個不同標(biāo)記能夠具有相同的基因圖譜坐標(biāo)。在那種情況下，兩個標(biāo)記彼此足夠接近使得它們之間的重組發(fā)生頻率低至無法檢測。術(shù)語“互補序列”指與給定核苷酸序列互補的核苷酸序列，即所述序列通過堿基配對原則連鎖。術(shù)語“鄰接DNA”指重疊的鄰接基因片段。當(dāng)涉及兩個遺傳因子間的關(guān)系時，例如有助于抗性的遺傳因子和鄰近的標(biāo)記，“耦合”相連鎖指示下述狀態(tài)其中在抗性基因座上的“有利”等位基因與相應(yīng)連鎖的標(biāo)記基因座的“有利”等位基因物理上關(guān)聯(lián)在相同染色體鏈上。在耦合相中，兩個有利等位基因被繼承了該染色體鏈的子代一起繼承。術(shù)語“雜交的”或“雜交”指經(jīng)由授粉產(chǎn)生子代的配子融合(例如細胞、種子或植株)。該術(shù)語包括有性雜交(一株植株被另一株植株授粉)和自交(自花授粉，例如當(dāng)花粉和胚珠來自相同植株時)。術(shù)語“雜交”指經(jīng)由授粉產(chǎn)生子代的配子融合行為。相對于具有單組染色體的“單倍體”，本文稱為“二倍體”的植株具有成對的染色體的組。本文稱為“雙單倍體”的植株通過倍增單倍體染色體組進行生長。認為雙單倍體植株是純合植株。“優(yōu)良品系”是源自育種并選擇優(yōu)異農(nóng)學(xué)性能的任何品系。如本文所用，術(shù)語“編碼”或“編碼的”當(dāng)用于特定的核酸時，意指該核酸包含用以指導(dǎo)從其核苷酸序列向特定蛋白質(zhì)的翻譯的必要信息。蛋白質(zhì)被編碼所用的信息通過密碼子的使用而具體化。編碼蛋白質(zhì)的核酸可在所述核酸的翻譯區(qū)之間包含非翻譯序列(即內(nèi)含子)，或者可沒有此類居間的非翻譯序列(例如，如在cDNA中)?！巴鈦碛衩灼贩N”或“外來玉米種質(zhì)”是來源于不屬于可利用優(yōu)良玉米品系或品種的種質(zhì)的玉米的品種或種質(zhì)。在雜交發(fā)生在兩個玉米植株或品種的種質(zhì)之間的情況下，夕卜來種質(zhì)的子代不與它雜交的優(yōu)良種質(zhì)密切相關(guān)。最常見的是外來種質(zhì)不來源于任何已知的玉米優(yōu)良品系，而是選擇將新遺傳因子(通常新等位基因)導(dǎo)入育種程序。
“有利等位基因”是在特定位點的等位基因，它賦予或有助于農(nóng)學(xué)上所期望的表型，例如提高的玉米大斑病抗性，并允許對具有農(nóng)學(xué)上所期望表型的植株的鑒定。標(biāo)記的“有利”等位基因是與有利表型共分離的標(biāo)記等位基因?！捌巍敝荚诒硎竞塑账嵝蛄械囊徊糠?。使用本文所公開的方法，片段可用作雜交探針或PCR引物。“基因圖譜”是對給定物種中一個或多個染色體(或染色體)上的基因座間的基因連鎖關(guān)系的描述，一般以圖表或表格形式描述。就每個基因圖譜而言，基因座之間的距離通過它們間的重組頻率進行測量，并且基因座之間的重組可使用多種標(biāo)記進行檢測?；驁D譜是作圖的種群、使用的標(biāo)記的類型、以及不同種群間各個標(biāo)記的多態(tài)性潛力的產(chǎn)物。一個基因圖譜與另一個基因圖譜在基因座之間的順序和遺傳距離可能不同。例如，在內(nèi)部來源的基因圖譜上(本文也將Pioneer Hi-Bred稱為“PHB”)的IOcM大概等同于在IBM22005鄰接框圖譜(在玉米⑶B上可用的高分辨率圖譜)上的25-30cM。然而，使用常見標(biāo)記的通用框能夠?qū)⒁粋€圖譜與另一個圖譜的信息關(guān)聯(lián)。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可使用常見標(biāo)記的框架來鑒定在各個個體基因圖譜上的標(biāo)記位置和受關(guān)注的基因座。 “基因圖譜位置”是在相同連鎖群上，相對于圍繞的遺傳標(biāo)記在基因圖譜上的位置，其中能夠在給定種群中發(fā)現(xiàn)指定標(biāo)記?！盎蜃鲌D”是限定基因座的連鎖關(guān)系的方法，該方法通過使用遺傳標(biāo)記、標(biāo)記的種群分離、以及重組頻率的標(biāo)準(zhǔn)遺傳原則進行?！斑z傳標(biāo)記”是種群中的多態(tài)核酸，并且其中可通過一種或多種分析方法檢測并區(qū)分出它們的等位基因，例如RFLP、AFLP、同功酶、SNP、SSR等。該術(shù)語也指與基因組序列互補的核酸序列，如用作探針的核酸。對應(yīng)于種群成員之間的遺傳多態(tài)性的標(biāo)記能夠通過本領(lǐng)域已建立的方法進行檢測。這些方法包括例如基于PCR的序列特異性擴增方法、限制性片段長度多態(tài)性檢測(RFLP)、同功酶標(biāo)記檢測、通過等位基因特異性雜交進行的多核苷酸多態(tài)性檢測(ASH)、植株基因組的擴增可變序列檢測、自主序列復(fù)制檢測、簡單重復(fù)序列檢測(SSR)、單核苷酸多態(tài)性檢測(SNP)、或擴增片段長度多態(tài)性檢測(AFLP)。已經(jīng)建立的方法也已知用于檢測表達序列標(biāo)簽(EST)和來源于EST序列的SSR標(biāo)記以及隨機擴增的多態(tài)性 DNA(RAPD)?！斑z傳重組頻率”是兩個基因座之間的交換事件(重組)的頻率。在標(biāo)記和/或減數(shù)分裂后性狀的分離后可觀察到重組頻率?！盎蚪M”指總DNA或整套基因，由染色體或染色體組攜帶。術(shù)語“基因型”是個體(或個體組)在一個或多個基因座上的基因組成，它與可觀察到的性狀(表型)形成對照?；蛐陀梢粋€或多個已知基因座的等位基因限定，個體已經(jīng)從其親本中繼承了所述基因座。術(shù)語基因型可被用于指個體在單個基因座上的基因組成，在多個基因座上的基因組成，或者更一般的，術(shù)語基因型可被用于指個體在其基因組中的所有基因的基因組成?！胺N質(zhì)”指個體(例如植株)、一組個體(例如植株品系、品種或家族)、或來源于品系、品種、物種、或培養(yǎng)物的克隆的或從其中得到的遺傳物質(zhì)。種質(zhì)可為生物或細胞的部分，或者可從生物或細胞中分離得到。種質(zhì)通常提供遺傳物質(zhì)與特異性分子構(gòu)成，該分子構(gòu)成提供生物或細胞培養(yǎng)物的一些或全部遺傳性狀的物理基礎(chǔ)。如本文所用，種質(zhì)包括可從中生長出新植株的細胞、種子或組織，或者植株部分如葉、莖、花粉、或細胞，它們能夠被培養(yǎng)成整個植株。稱為“單倍體”的植株具有一組染色體(基因組)。“單倍型”是個體在多個基因座上的基因型，即等位基因組合。單倍型描述的基因座通常是物理上和遺傳上連鎖的，即在相同染色體片段上。術(shù)語“單倍型”可指在特定基因座的多態(tài)性，如單標(biāo)記基因座，或者在沿染色體片段的多個基因座上的多態(tài)性。前者也可被稱為“標(biāo)記單倍型”或“標(biāo)記等位基因”，而后者能夠被稱為“遠程單倍型”。術(shù)語“異質(zhì)”用于指明一組內(nèi)的個體在一個或多個特定基因座上基因型不同?！半s種優(yōu)勢群”包含一組基因型，它們當(dāng)與來自不同雜種優(yōu)勢群的基因型雜交時表現(xiàn)良好(Hallauer 等人(1998) Corn breeding,第 463-564 頁，G. F. Sprague 和J. W. Dudley (編輯)，Corn and corn improvement)。將近交系歸類為雜種優(yōu)勢群,并且將 其進一步細分為雜種優(yōu)勢群內(nèi)的家族，所述分類基于若干個標(biāo)準(zhǔn)如家譜、基于分子標(biāo)記的關(guān)聯(lián)、以及雜交體組合的性能(Smith等人(1990)Theor. Appl. Gen. 80 :833-840)。美國兩個最廣泛使用的雜種優(yōu)勢群稱為“Iowa Stiff Stalk Synthetic”(BSSS)和“Lancaster”或“Lancaster Sure Crop”(有時稱為 NSS 或非 Stiff Stalk)。術(shù)語“雜合子”指其中不同等位基因位于同源染色體上的對應(yīng)基因座的基因條件。術(shù)語“同質(zhì)”指一組成員在一個或多個特定基因座上具有相同基因型。術(shù)語“純合子”指其中相同等位基因位于同源染色體上的對應(yīng)基因座的基因條件。術(shù)語“雜交體”指至少兩個基因相異的親本間雜交獲得的子代?！半s交”或“核酸雜交”指互補RNA和DNA鏈配對以及互補DNA單鏈配對。術(shù)語“雜交”指核酸鏈的互補區(qū)域之間形成堿基對?！癐BM基因圖譜”能夠指任何下列圖譜:IBM、IBM2、IBM2鄰接、IBM2 FPC0507、IBM2 2004 鄰接、IBM2 2005 鄰接、IBM2 2005 鄰接框、IBM22008 鄰接、IBM22008 鄰接框、或maizeGDB網(wǎng)站的最新版本。IBM基因圖譜基于B73XMol7種群，其中來自初始雜交的子代在構(gòu)建重組近交系用于作圖前隨機交配產(chǎn)生多代。較新的版本反映了遺傳的或BAC作圖的基因座的添加，以及由于從其他遺傳或物理圖譜、經(jīng)過清理的數(shù)據(jù)、或用以從各個圖譜產(chǎn)生綜合圖譜的新算法的使用獲得的信息的整合而提高的圖譜精度。術(shù)語“近交”指已經(jīng)進行育種以獲得遺傳同質(zhì)性的品系。術(shù)語“插入缺失(indel)”指插入或缺失，其中可將一個品系相對于第二品系稱為插入，或者可將第二品系相對于第一品系稱為具有缺失。術(shù)語“滲入”指基因座的期望等位基因從一種遺傳背景傳遞到另一種遺傳背景的現(xiàn)象。例如在特定基因座的期望等位基因通過滲入、經(jīng)由相同物種的兩個親本間的有性雜交可被傳遞到至少一個子代，其中至少一個親本在其基因組中具有期望的等位基因。作為另外一種選擇，例如等位基因的傳遞能夠通過兩個供體基因組之間的重組而發(fā)生，例如在融合原生質(zhì)體中，其中至少其中一個供體原生質(zhì)體在其基因組中具有期望的等位基因。期望的等位基因可為例如標(biāo)記的選擇等位基因、QTL、轉(zhuǎn)基因等。在任何情況下，能夠?qū)谕任换虻淖哟c具有期望遺傳背景的品系反復(fù)回交并選擇期望的等位基因以產(chǎn)生固定在選擇遺傳背景中的等位基因。例如，本文所述的2號染色體基因座可以被基因滲入至對Et和/或玉米大斑病無抗性或僅部分抗性的輪回親本中。帶有所滲入基因或基因座的輪回親本品系于是具有增強的對Et和/或玉米大斑病的抗性。當(dāng)重復(fù)“基因滲入”過程兩次或更多次時，該過程常被稱為“回交”。“品系”或“品種”是一組具有相同親本的個體，它們一般是某種程度的近交體，并且一般在大多數(shù)基因座是純合的和同質(zhì)的(同基因的或接近同基因的)?！皝喯怠敝缸哟慕惑w亞群，它們與相同祖先來源的其他相似近交體亞群遺傳上不同。如本文所用，術(shù)語“連鎖”用于描述一個標(biāo)記基因座與另一個標(biāo)記基因座或一些其他基因座(例如，玉米大斑病抗性基因座)關(guān)聯(lián)的程度。分子標(biāo)記和表型之間的連鎖關(guān)系用“概率”或“調(diào)整概率”表示。連鎖可以用期望的限度或范圍表達。例如在一些實施方案中，當(dāng)標(biāo)記分離距離為小于50、40、30、25、20、或15圖譜單位(或cM)時,任何標(biāo)記與任何其他標(biāo)記連鎖(基因上和物理上)。在一些方面，限定加括號的連鎖范圍是有利的，例如介于IOcM和20cM之間，介于IOcM和30cM之間，或者介于IOcM和40cM之間。標(biāo)記與第二基因座的連鎖越緊密，標(biāo)記對第二基因座的指示效果越好。因此，“緊密連鎖的基因座”如標(biāo)記基因座和第二基因座顯示10 %或更低，優(yōu)選約9 %或更低，更優(yōu)選約8 %或更低，更優(yōu)選約7 % 或更低，更優(yōu)選約6 %或更低，更優(yōu)選約5 %或更低，更優(yōu)選約4 %或更低，更優(yōu)選約3 %或更低，更優(yōu)選約2%或更低的基因座內(nèi)重組頻率。在高度優(yōu)選的實施方案中，關(guān)聯(lián)基因座顯示約1%或更低的重組頻率，例如約O. 75%或更低，更優(yōu)選約O. 5%或更低，更優(yōu)選約O. 25%或更低的重組頻率。位于相同染色體上，并且它們間的距離使得兩個基因座間的重組發(fā)生頻率小于 10% (例如約 9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0· 75%,O. 5%,O. 25%,或更低)的兩個基因座也稱為彼此“接近”。因為IcM是顯示出1%的重組頻率的兩個標(biāo)記之間的距離，任何標(biāo)記與接近的任何其他標(biāo)記緊密連鎖(基因上和物理上)，例如等于或小于IOcM的距離。在相同染色體上的兩個緊密連鎖的標(biāo)記可被彼此定位于9cM、8cM、7cM、6cM、5cM、4cM、3cM、2cM、lcM、0. 75cM、0. 5cM 或 O. 25cM 或更小。術(shù)語“連鎖不平衡”指基因座或性狀(或者兩者都有)非隨機地分離。在任一情況下，連鎖不平衡意味著相關(guān)的基因座沿著一段染色體在物理上足夠接近，以便它們以大于隨機(即非隨機)的頻率一起分離(在共分離性狀的情況下，產(chǎn)生該性狀的基因座彼此足夠接近)。顯示連鎖不平衡的標(biāo)記被認為是連鎖的。連鎖基因座在超過50%的情況下共分離，例如約51%至約100%的情況。換句話說，共分離的兩個標(biāo)記具有小于50% (并且根據(jù)定義，在相同染色體上分離距離小于50cM)的重組頻率。如本文所用，連鎖可存在于兩個標(biāo)記或者標(biāo)記和表型之間。標(biāo)記基因座可與性狀，例如玉米大斑病抗性相“關(guān)聯(lián)”(連鎖)。測量分子標(biāo)記與表型性狀的連鎖程度，例如分子標(biāo)記與表型共分尚的統(tǒng)計學(xué)概率。連鎖不平衡最常見地用量度r2測量，它通過Hill，W.G.和Robertson，A, Theor.Appl. Genet. 38 :226-231(1968)所述的公式計算。當(dāng)r2 = I時，兩個標(biāo)記基因座間存在完全的LD，意味著標(biāo)記還未進行重組分離并且具有相同的等位基因頻率。r2值大于1/3指示足夠強的 LD 將被用于作圖(Ardlie 等人，Nature Reviews Genetics 3:299-309(2002))。因此，當(dāng)成對標(biāo)記基因座間的r2值大于或等于O. 33、0. 4、0. 5、0. 6、0. 7、0. 8、0. 9、或I. O時，等位基因處于連鎖不平衡。如本文所用，“連鎖平衡”描述其中兩個標(biāo)記獨立地分離的情況，S卩，在子代中隨機分離。認為顯示連鎖平衡的標(biāo)記不連鎖(無論它們是否位于相同染色體上)?！盎蜃笔腔蚧驑?biāo)記位于染色體上的位點。
“優(yōu)勢對數(shù)(LOD)值”或“L0D 評分” (Risch, Science 255 :803-804(1992))用于區(qū)間作圖以描述兩個標(biāo)記基因座之間的連鎖程度。兩個標(biāo)記間LOD評分為三指示連鎖概率比無連鎖的概率高1000倍，而LOD評分為二指示連鎖概率比無連鎖的概率高100倍。大于或等于二的LOD評分可用于檢測連鎖?！坝衩住敝赣衩讓?Zea mays L. ssp. mays)植株，也稱為“玉蜀黍”。術(shù)語“玉米植株”包括整個玉米植株、玉米植株細胞、玉米植株原生質(zhì)體、可從其中再生玉米植株的玉米植株細胞或玉米組織培養(yǎng)物、玉米植株愈傷組織、玉米植株中的完整玉米植株細胞或玉米植株部分，如玉米種子、玉米芯、玉米花、玉米子葉、玉米葉、玉米莖、玉米芽、玉米根、玉米根尖等?！皹?biāo)記”是用作參考點的核苷酸序列或其編碼產(chǎn)物(例如蛋白)。對于用于檢測重組的標(biāo)記，它們需要在被監(jiān)測的種群內(nèi)檢測差異、或多態(tài)性。對于分子標(biāo)記，這意味著DNA水平的差異是由于多核苷酸序列差異(例如SSR、RFLP, FLP和SNP)?；蚪M可變性可為 任何一種起源，例如插入、缺失、復(fù)制、重復(fù)元件、點突變、重組事件、或轉(zhuǎn)座因子的存在和序列。分子標(biāo)記可來源于基因組或表達的核酸(例如EST)，并且也可指用作探針或引物對的核酸，所述引物對能夠通過使用基于PCR的方法擴增序列片段。很多玉米分子標(biāo)記是本領(lǐng)域已知的，并且被公布于或得自多個來源，例如Maize⑶B因特網(wǎng)資源和University ofArizona 運營的 ArizonaGenomics Institute 因特網(wǎng)資源。對應(yīng)于種群成員之間的遺傳多態(tài)性的標(biāo)記能夠通過本領(lǐng)域已建立的方法進行檢測。這些方法包括例如DNA測序、基于PCR的序列特異性擴增方法、限制性片段長度多態(tài)性檢測(RFLP)、同功酶標(biāo)記檢測、通過等位基因特異性雜交進行的多核苷酸多態(tài)性檢測(ASH)、植株基因組的擴增可變序列檢測、自主序列復(fù)制檢測、簡單重復(fù)序列檢測(SSR)、單核苷酸多態(tài)性檢測(SNP)、或擴增片段長度多態(tài)性檢測(AFLP)。已經(jīng)建立的方法也已知用于檢測表達序列標(biāo)簽(EST)和來源于EST序列的SSR標(biāo)記以及隨機擴增的多態(tài)性DNA(RAPD)?！皹?biāo)記等位基因”或者“標(biāo)記基因座的等位基因”可以指種群中位于標(biāo)記基因座的多個多態(tài)性核苷酸序列的其中一個，它就標(biāo)記基因座而言是多態(tài)的?！皹?biāo)記輔助的選擇”(或MAS)是一種基于標(biāo)記基因型進行表型選擇的方法。“標(biāo)記輔助的反選擇”是一種通過它將標(biāo)記基因型用于鑒定植株的方法，所述植株將不被選擇，使得它們被從育種程序或種植中去除。“標(biāo)記單倍型”是指在標(biāo)記基因座的等位基因的組合。“標(biāo)記基因座”是物種基因組中的特定染色體位點，其中可存在特定標(biāo)記?！皹?biāo)記基因座”可用于追蹤存在的第二連接基因座，例如編碼或有助于表達表型性狀的連接基因座。例如標(biāo)記基因座能夠用于監(jiān)控等位基因在某一基因座的分離，例如QTL或單基因，它們與標(biāo)記基因座在遺傳上或在物理上連鎖?！皹?biāo)記探針”是可用于通過核酸雜交鑒定標(biāo)記基因座存在與否的核酸序列或分子，例如與標(biāo)記基因座序列互補的核酸分子探針。包含標(biāo)記基因座的30個或更多鄰接核苷酸(“所有或部分”標(biāo)記基因座序列)的標(biāo)記探針可用于核酸雜交。作為另外一種選擇，在某些方面分子探針指能夠區(qū)別(即基因型)存在于標(biāo)記基因座上的特定等位基因的任何類型的探針。
如上所述，當(dāng)鑒定連鎖基因座時，術(shù)語“分子標(biāo)記”可用于指遺傳標(biāo)記，或其用作參照點的編碼產(chǎn)物(例如，蛋白質(zhì))。標(biāo)記能夠來源于基因組核苷酸序列或來源于表達的核苷酸序列(例如來源于剪接的RNA、cDNA等)，或來源于編碼的多肽。該術(shù)語也指與標(biāo)記序列互補或兩側(cè)為標(biāo)記序列的核酸序列，如用作探針或能夠擴增標(biāo)記序列的引物對的核酸?！胺肿訕?biāo)記探針”是可用于鑒定標(biāo)記基因座存在與否的核酸序列或分子，例如與標(biāo)記基因座序列互補的核酸探針。作為另外一種選擇，在某些方面分子探針指能夠區(qū)別(即基因型)存在于標(biāo)記基因座上的特定等位基因的任何類型的探針。當(dāng)核酸在溶液中特異性雜交時，例如根據(jù)Watson-Crick堿基配對原則雜交,核酸是“互補的”。當(dāng)位于插入缺失區(qū)域，例如本文所述的非共線區(qū)域時，本文所述的一些標(biāo)記也稱為雜交標(biāo)記。這是因為，根據(jù)定義，插入?yún)^(qū)域是關(guān)于無插入的植株的多態(tài)性。因此，標(biāo)記僅需要指明插入缺失區(qū)域是否存在。任何合適的標(biāo)記檢測技術(shù)都可用于鑒定此類雜交標(biāo)記，例如SNP技術(shù)用于本文提供的實例。當(dāng)?shù)任换蚺c性狀連鎖時，以及當(dāng)存在的等位基因是期望的性狀或性狀形式將不發(fā)生在包含等位基因的植株中的指示時，等位基因與性狀“負”相關(guān)?！昂塑账嵝蛄小?、“多核苷酸”、“核酸序列”和“核酸片段”可互換使用，并且指作為單 鏈或雙鏈的RNA或DNA聚合物，任選含有合成的、非天然的或改變的核苷酸堿基?！昂塑账帷笔菢?gòu)成DNA或RNA聚合物的單體單元，它們由嘌呤或嘧啶堿基、戊糖和磷酸基組成。核苷酸(通常以它們的5'-單磷酸形式存在)可以用它們的單字母名稱指代如下“A”為腺苷酸或脫氧腺苷酸(分別對應(yīng)RNA或DNA)，“C”表示胞苷酸或脫氧胞苷酸，“G”表示鳥苷酸或脫氧鳥苷酸，“U”表示尿苷酸，“T”表示脫氧胸苷酸，“R”表示嘌呤(A或G)，“Y”表示嘧啶(C或T)，“K”表示G或T，“H”表示A或C或T，“ I ”表示肌苷，并且“N”表示任意核苷酸。術(shù)語“表型”或“表型性狀”或“性狀”指生物的一個或多個性狀。表型可用肉眼或者本領(lǐng)域已知的任何其他評估手段觀察到，例如顯微鏡法、生物化學(xué)分析、或電裝置檢測分析法。在某些情況下，表型由單個基因或基因座直接控制，即“單基因性狀”。在其他情況下，表型是若干個基因的結(jié)果。基因組的“物理圖譜”是顯示染色體DNA上可辨認的界標(biāo)(包括基因、標(biāo)記等)的線性順序的圖譜。然而與基因圖譜相比，界標(biāo)間的距離是絕對的(例如以堿基對測量的或分離的或重疊的鄰接基因片段)并且不基于基因重組。“植株”可為整個植株、其任何部分、或來源于植株的細胞或組織培養(yǎng)物。因此，術(shù)語“植株”可指代以下任何一種材料整個植株、植株部分或器官(例如葉、莖、根等)、植株組織、種子、植株細胞、和/或子代的相同材料。植株細胞是從植株中獲取的細胞或來源于從植株中所獲取細胞經(jīng)培養(yǎng)出的細胞?！岸鄳B(tài)性”是DNA中的變型，它過于常見而不僅僅由突變產(chǎn)生。多態(tài)性在種群中必須具有至少1%的頻率。多態(tài)性可以是單核苷酸多態(tài)性或SNP、或插入/缺失多態(tài)性，所述插入/缺失多態(tài)性本文也稱為“插入缺失”。術(shù)語“多肽”、“肽”和“蛋白質(zhì)”在本文中可互換使用，指氨基酸殘基的聚合物。該術(shù)語適用于其中一個或多個氨基酸殘基是相應(yīng)的天然存在的氨基酸的人工化學(xué)類似物的氨基酸聚合物，以及適用于天然存在的氨基酸聚合物。本發(fā)明實施方案的多肽既可從本文所公開的核酸產(chǎn)生，也可通過使用標(biāo)準(zhǔn)的分子生物學(xué)技術(shù)而產(chǎn)生。例如，本發(fā)明實施方案的截短的蛋白質(zhì)可通過在適當(dāng)?shù)乃拗骷毎斜磉_本發(fā)明實施方案的重組核酸而產(chǎn)生，或者通過離體過程的組合，例如蛋白酶消化和純化而產(chǎn)生。當(dāng)?shù)任换蚺c性狀連鎖時，以及當(dāng)存在的等位基因是期望的性狀或性狀形式將發(fā)生在包含等位基因的植株中的指示時，等位基因與性狀“正”相關(guān)?！案怕手怠被颉癙值”是表型的特定組合和特定標(biāo)記等位基因的存在或不存在是否隨機的統(tǒng)計學(xué)概率。因此，概率評分越低，表型和特性標(biāo)記將共分離的可能性越大。在某些方面，認為概率評分是“顯著的”或“不顯著的”。在一些實施方案中，認為隨機分離的概率評分為0.05(p = 0.05，或5%的概率)是共分離的顯著性指示。然而，可接受的概率可為小于50% (P = O. 5)的任何概率。例如，顯著概率可小于O. 25、小于O. 20、小于O. 15、小于O. I、小于O. 05、小于O. 01、或小于O. 001。
“生產(chǎn)標(biāo)記”或“生產(chǎn)SNP標(biāo)記”是已經(jīng)為高通量目的而開發(fā)的標(biāo)記。生產(chǎn)SNP標(biāo)記被開發(fā)用于檢測特異性多態(tài)性，并且被設(shè)計用于多種化學(xué)反應(yīng)和平臺。本文所使用的標(biāo)記名稱，以前綴PHM表示“先導(dǎo)雜交標(biāo)記(Pioneer Hybrid Marker) ”,然后是針對其所被設(shè)計針對的序列的數(shù)字，之后是”或然后是針對DNA多態(tài)性的后綴。標(biāo)記的版本也能夠按照(A、B、C等)表示針對該特異性多態(tài)性的標(biāo)記的版本的方式。術(shù)語“子代”指雜交產(chǎn)生的后代?！白哟仓辍睆膬蓚€植株間的雜交生成。術(shù)語“數(shù)量性狀基因座”或“QTL”指在至少一種遺傳背景下(例如在至少一個育種種群或子代中)，具有與表型性狀的差異表達關(guān)聯(lián)的至少一個等位基因的多態(tài)基因座。QTL能夠通過單基因機制或多基因機制發(fā)揮作用?！皡⒖夹蛄小笔怯米餍蛄斜葘鶞?zhǔn)的限定序列。參考序列通過基因分型在該基因座的多個品系、在序列比對程序(例如Sequencher)、然后獲取比對的共有序列而獲得。因此，參考序列鑒定在基因座等位基因中的多態(tài)性。參考序列可以不是實際DNA序列的拷貝；然而，設(shè)計引物和探針用于基因座中的實際多態(tài)性是有用的。在“相斥”相連鎖中，在受關(guān)注基因座上的“有利”等位基因與在鄰近的標(biāo)記基因座上的“不利”等位基因物理上連鎖，并且兩個“有利”等位基因不被一起繼承(即這兩個基因座彼此“異相”)。“頂交測試”是通過將每一親本與相同測試者(通常是純合品系)雜交而進行的子代測試。測試親本可為自由授粉的品種、雜交系或近交系。序列比對和同一性百分比可用設(shè)計用于檢測同源序列的多種比較方法來測定，這些方法包括但不限于LASERGENE 生物信息計算包(DNASTAR Inc.，Madison,WI)的Megalignf程序。除非另外說明，本文提供的序列的多重比對用Clustal V比對方法(Higgins 和 Sharp, CABI OS. 5 :151-153(1989))采用默認參數(shù)(GAP PENALTY = 10，GAPLENGTHPENALTY = 10)執(zhí)行。用Clustal V方法進行逐對比對和蛋白質(zhì)序列的百分比同一性計算的默認參數(shù)為 KTUPLE = 1,GAP PENALTY = 3, WINDOW = 5，以及 DIAGONALS SAVED =5。對于核酸,這些參數(shù)為 KTUPLE = 2, GAP PENALTY = 5, WINDOW = 4，以及 DIAGONALSSAVED=4。用Clustal V程序比對序列后，可以通過查看同一程序中的“序列距離”表來獲得“百分比同一性”和“趨異”值。除非另外說明，本文提供的和申明的同一性百分比和趨異度是以該方式計算的。標(biāo)記的“不利等位基因”是與不利植株表型共分離的標(biāo)記等位基因，因此提供鑒定能從育種程序或栽培中移除的植株的有益效果。術(shù)語“產(chǎn)量”指具有商業(yè)價值的特定植株產(chǎn)品每單位面積的產(chǎn)量。例如玉米產(chǎn)量一般以每季每英畝種子蒲式耳數(shù)或每季每公頃種子公噸數(shù)來測量。產(chǎn)量受遺傳和環(huán)境因素的影響?！稗r(nóng)學(xué)”、“農(nóng)學(xué)特性”和“農(nóng)學(xué)性能”指給定植株品種的性狀(以及產(chǎn)生性狀的遺傳因子)，所述性狀有助于經(jīng)過生長期的產(chǎn)量。單個農(nóng)學(xué)特性包括出苗活力、營養(yǎng)勢、脅迫耐受性、病害抗性或耐受性、除草劑抗性、發(fā)生分枝、開花、結(jié)實率、種子大小、種子密度、抗倒伏性、脫粒率等等。因此產(chǎn)量是所有農(nóng)學(xué)特性的最終結(jié)果。序列比對和同一性百分比可用設(shè)計用于檢測同源序列的多種比較方法來測定，這些方法包括但不限于LASERGENEis生物信息計算包(DNASTAR Inc.，Madison,WI)的Megalignis程序。除非另外說明，本文提供的序列的多重比對用Clustal V比對方法(Higgins 和 Sharp, CABI OS. 5 :151-153(1989))采用默認參數(shù)(GAP PENALTY = 10，GAPLENGTHPENALTY = 10)執(zhí)行。用Clustal V方法進行逐對比對和蛋白質(zhì)序列的百分比同一性計算的默認參數(shù)為 KTUPLE = 1,GAP PENALTY = 3, WINDOW = 5，以及 DIAGONALS SAVED =5。對于核酸,這些參數(shù)為 KTUPLE = 2, GAP PENALTY = 5, WINDOW = 4，以及 DIAGONALSSAVED =4。用Clustal V程序比對序列后，可以通過查看同一程序中的“序列距離”表來獲得“百分比同一性”和“趨異”值。除非另外說明，本文提供的和申明的同一性百分比和趨異度是以該方式計算的。本文使用的標(biāo)準(zhǔn)重組DNA和分子克隆技術(shù)是本領(lǐng)域所熟知的并且在如下文獻中有更全面的描述Sambrook, J. , Fritsch, E. F.和 Maniatis, T. Molecular Cloning A Laboratory Manual；Cold Spring Harbor LaboratoryPress Cold Spring Harbor,1989 (下文稱為 “Sambrook”)。在詳述本發(fā)明之前，應(yīng)當(dāng)了解本發(fā)明不受特定實施方案的限制。也應(yīng)當(dāng)了解本文所用的術(shù)語僅是為了描述特定實施方案，而不旨在進行限制。當(dāng)在本文和所附權(quán)利要求中使用時，除非內(nèi)容清楚地表明，單數(shù)和單數(shù)形式的術(shù)語包括復(fù)數(shù)指代。因此，例如術(shù)語“植株”也包括多個植株；取決于上下文，使用的術(shù)語“植株”也可包括該植株遺傳相似或相同的子代；使用的術(shù)語“核酸”任選地包括該核酸分子的多個拷貝。現(xiàn)在來看實施方案玉米大斑病抗件玉米大斑病(NLB)，有時被稱為玉米葉枯病(NCLB)，是由病原體大斑突臍蠕孢菌導(dǎo)致的病害。這種以葉片組織上的雪茄狀病變?yōu)樘卣鞯牟『?，能夠?qū)Ξa(chǎn)量造成嚴重影響，尤其是在熱帶氣候下或者是在溫帶氣候的雨季。本發(fā)明實施方案的核酸和多肽可用于賦予或增強植株真菌抗性的方法中。抗性的來源可以是天然存在的遺傳的抗性基因座，所述基因座通過育種實現(xiàn)向缺少該抗性基因座的敏感型玉米種群的基因滲入，或者，賦予抗性的基因可作為轉(zhuǎn)基因異位表達，所述轉(zhuǎn)基因當(dāng)在敏感型種群中表達時賦予抗性。因此，本文所公開的組合物和方法對于保護植株免受真菌病原體損害是有用的?！安≡剐浴?、“真菌抗性”和“疾病抗性”意指植株避免了作為植株-病原體相互作用結(jié)果的疾病癥狀。即，防止了病原體導(dǎo)致植株疾病和相關(guān)的疾病癥狀，或者，病原體導(dǎo)致的疾病癥狀被最小化或減弱了，例如壓力和相關(guān)的產(chǎn)量損失的降低。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將會知道，本文所公開的組合物和方法可與本領(lǐng)域中可用的其他組合物和方法一起被用于保護植株免受病原體攻擊。因此，本發(fā)明實施方案的方法可被用于保護植株免受疾病，尤其是由植株病原真菌導(dǎo)致的疾病的侵害。如本文所用，“真菌抗性”是指與野生型植株的對應(yīng)性質(zhì)相比，對真菌病原體增強的抗性或耐受性。效果可以從對病原真菌的影響的耐受性的略微增加(例如部分抑制)，直至使得植株不受病原真菌存在的影響這樣的完全抗性。針對特定真菌病原體或者針對廣譜的真菌病原體的提高水平的抗性構(gòu)成了 “增強的”或改善的真菌抗性。本發(fā)明的實施方案將增強或提高植株病原真菌抗性，使得植株對一種或多種真菌病原體的抗性增力口，繼而增加了對真菌病原體引起的病害的抗性。術(shù)語“增強”是指提高、增加、擴大、倍增、提升、上升等。本文中，本發(fā)明的植株被描述為由于本發(fā)明的抗性基因座而對大斑長蠕孢菌的感染具有抗性或?qū)Υ蟀唛L蠕孢菌的感染具有增強的抗性。相應(yīng)地，與因缺少所述抗性基因座而對大斑長蠕孢菌的感染敏感的相應(yīng)植株相比，它們通常表現(xiàn)出對該疾病(玉米大斑病)提高的抗性。與玉米大斑病抗性關(guān)聯(lián)的分子標(biāo)記和分子標(biāo)記的等位基因的鑒定允許抗性的正選擇僅基于子代的遺傳組成。本文提供了通過基因組成評估(如使用分子標(biāo)記及其等位基 因評估)來鑒定和選擇具有增強的玉米大斑病抗性的玉米植株的方法。在其他方面，賦予或增強植株真菌抗性的方法也能夠被實施，所述方法包括將至少一種表達盒轉(zhuǎn)入植株，其中所述表達盒包括編碼本發(fā)明實施方案的抗真菌多肽的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列可操作地連接至在所述植株中驅(qū)動表達的啟動子。在這些方法中，植株表達所述多肽，從而賦予了該植株真菌抗性，或提高了該植株抗性的固有水平。在特定實施方案中，所述基因或多種基因賦予對真菌病原體大斑長蠕孢菌的抗性。所述實施方案的抗真菌多肽的表達可定位于對病原體的抗性在其處尤其重要的特定的植株組織，例如葉、根、莖或維管組織。此類組織優(yōu)選的表達可通過根優(yōu)選的、葉優(yōu)選的、維管組織優(yōu)選的、莖優(yōu)選的或種子優(yōu)選的啟動子而實現(xiàn)。某因作圖-與增強的大斑長蠕孢菌杭件關(guān)聯(lián)的某因座的鑒定在很長一段時間里，人們已經(jīng)認識到能夠?qū)εc特定表型例如玉米大斑病抗性關(guān)聯(lián)的特定基因座在生物的基因組中作圖。有利的是，植物育種人員可使用分子標(biāo)記通過檢測標(biāo)記等位基因鑒定期望的個體，所述標(biāo)記等位基因顯示與期望表型共分離的統(tǒng)計意義上顯著的概率，表現(xiàn)為連鎖不平衡。通過鑒定與受關(guān)注的性狀共分離的分子標(biāo)記或分子標(biāo)記簇，植物育種人員能夠?qū)线m的分子標(biāo)記等位基因進行正選擇(該過程稱為標(biāo)記輔助選擇或MAS)從而迅速選擇期望表型。育種人員也可使用此類標(biāo)記通過計算機設(shè)計基因型并實施全基因組選擇。本領(lǐng)域熟知的多種方法可用于檢測與受關(guān)注的性狀例如玉米大斑病抗性共分離的分子標(biāo)記或分子標(biāo)記簇。這些方法的基本原理是檢測具有顯著不同平均表型的供選擇基因型(或等位基因)的標(biāo)記。因此，比較標(biāo)記基因座之間的供選擇基因型(或等位基因)之間的差異大小或差異顯著性水平。推斷性狀基因位于最靠近一個或多個標(biāo)記的位置，所述標(biāo)記與基因型差異具有最大的關(guān)聯(lián)性。兩種用于檢測所關(guān)注的性狀基因座的此類方法是1)基于種群的關(guān)聯(lián)分析和2)傳統(tǒng)的連鎖分析。在基于種群的關(guān)聯(lián)分析中，從具有多個創(chuàng)始者(例如優(yōu)良育種品系)的已有種群中獲取品系。基于種群的關(guān)聯(lián)分析依靠連鎖不平衡(LD)的弱化和以下觀點在非結(jié)構(gòu)化的種群中，在如此多代隨機交配之后，僅有控制受關(guān)注性狀的基因和與這些基因緊密連鎖的標(biāo)記之間的關(guān)聯(lián)將保存下來。實際上，大多數(shù)已有種群具有種群亞結(jié)構(gòu)。因此，通過把個體分配到種群中，使用得自無規(guī)分布于基因組的標(biāo)記的數(shù)據(jù)，采用結(jié)構(gòu)關(guān)聯(lián)方法有助于控制種群結(jié)構(gòu)，從而最小化由于單個種群(也稱為亞種群)內(nèi)的種群結(jié)構(gòu)帶來的不平衡。表型值與在亞群中每個品系的每個標(biāo)記基因座上基因型(等位基因)進行比較。顯著的標(biāo)記-性狀關(guān)聯(lián)指示標(biāo)記基因座和涉及該性狀表達的一個或多個基因座接近。
傳統(tǒng)的連鎖分析使用相同的原則；然而，LD通過從少量創(chuàng)始者產(chǎn)生種群生成。選擇創(chuàng)始者以最大化結(jié)構(gòu)化種群內(nèi)的多態(tài)性水平，并且評估多態(tài)性位點與給定表型的共分離水平。許多統(tǒng)計學(xué)方法已經(jīng)用于鑒定顯著的標(biāo)記-性狀關(guān)聯(lián)。一種此類方法是區(qū)間作圖方法(Lander 和 Botstein，Geneticsl21 :185-199 (1989)，其中測試沿基因圖譜(IcM 的區(qū)間)的許多位點中的每一個位點控制受關(guān)注性狀的基因位于該位點的概率?；蛐?表型數(shù)據(jù)用于計算每個測試位點的LOD評分(概率比率的對數(shù))。當(dāng)LOD評分大于閾值時，存在控制受關(guān)注性狀的基因位點位于基因圖譜上的該位點上的顯著證據(jù)(它將位于兩個特定標(biāo)記基因座之間)。本發(fā)明提供了展示出統(tǒng)計上顯著的與玉米大斑病抗性的共分離的分子標(biāo)記基因座，如通過傳統(tǒng)的連鎖作圖技術(shù)所確定的。對這些標(biāo)記基因座或附加的連鎖的標(biāo)記基因座的檢測能夠被用于標(biāo)記輔助的玉米育種程序中，以產(chǎn)生具有增強的玉米大斑病抗性的植株或從育種程序或種植中排除不具有增強的玉米大斑病抗性的植株。與玉米大斑病抗性關(guān)聯(lián)的標(biāo)記本文中鑒定了與玉米大斑病抗性關(guān)聯(lián)的標(biāo)記。方法涉及檢測玉米植株的種質(zhì)中與增強的抗性關(guān)聯(lián)的一個或多個標(biāo)記等位基因的存在。玉米植株可以是雜交體或近交體。標(biāo)記基因座能夠選自本文提供的任何標(biāo)記基因座，包括但不限于PHM2798、b0302Hl、b0611N13、2717_3、2717_4、108fl6_2、31004、pco642297_3、bl09. m6、PHM18979、b0507L21、2_2、156K16、b0318il3、PHM4757、PHM13395-27、PHM4677-11、PHM3418-12、PHM15992-3、NLB5A、NLB3A、PHM4582、9gl3-3、K、6_7、6_8、N、R、S、U、PHM2817-26、PHM7446-6、PHM13395-16、NLB17_A、NLB17_E、NLB17_3、NLB18_A、或 NLB18_E ;以及與這些標(biāo)記連鎖的任何其他標(biāo)記(連鎖的標(biāo)記能夠從MaizeGDB資源確定)。物理圖譜位置基因元件或位于單個染色體上的基因組DNA的鄰接線性片段上的基因是物理上連鎖的。與玉米大斑病抗性關(guān)聯(lián)的QTL區(qū)間能夠見于圖I中，并且包括BACc0435bl8、c0009gl3、c0043il0、c0108fl6、c0117i01、c0010kl2、c0125i21 和 c0064116。裝配至 BACc0435bl8和c0064116之間(包括c0435bl8和c0064116)的連續(xù)DNA的任何多核苷酸(匡口，基于 Clustal V 比對方法，與 BAC c0435bl8 和 c0064116 之間(包括 c0435bl8 和 c0064116)的連續(xù)DNA序列相比具有95%同一性)能夠覆蓋與玉米大斑病抗性性狀關(guān)聯(lián)的標(biāo)記基因座。連鎖關(guān)系連鎖的常見量度是性狀共分離的頻率。這可以共分離百分比(重組頻率)表示，或者以厘摩(CM)表示。CM是基因重組頻率的量度單位。IcM等于由于在一代中的交換導(dǎo)致的在一個基因座上的性狀將與在另一個基因座上的性狀分離的概率為1% (意味著性狀99%的情況下共分離)。因為染色體距離與性狀間交換事件的頻率大約成比例，有與重組頻率關(guān)聯(lián)的近似物理距離。標(biāo)記基因座本身是性狀，并且在分離期間能夠通過跟蹤標(biāo)記基因座、根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)連鎖分析進行評估。因此，IcM等于經(jīng)過單代雜交的標(biāo)記基因座將與另一個基因座分離的1%的概率。標(biāo)記距離控制受關(guān)注性狀的基因越近，則標(biāo)記作為期望性狀的指示越有效和有利。緊密連鎖的基因座顯示約10%或更低，優(yōu)選約9%或更低，更優(yōu)選約8%或更低，更優(yōu)選約7 %或更低，更優(yōu)選約6 %或更低，更優(yōu)選約5 %或更低，更優(yōu)選約4 %或更低，更優(yōu)選約3%或更低，更優(yōu)選約2%或更低的基因座內(nèi)交換頻率。在高度優(yōu)選的實施方案中，相關(guān)基因座(例如標(biāo)記基因座和靶基因座)顯示約1%或更低的重組頻率，例如約O. 75%或更低，更優(yōu)選地約O. 5%或更低，或更優(yōu)選地約O. 25%或更低的重組頻率。因此，所述基因座 分開距離為約 10cM、9cM、8cM、7cM、6cM、5cM、4cM、3cM、2cM、lcM、0. 75cM、0. 5cM 或 O. 25cM 或更低。換句話說，位于相同染色體上，并且它們間的距離使得兩個基因座間的重組發(fā)生頻率小于 10% (例如約 9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0· 75%,O. 5%,O. 25%、或更低)的兩個基因座稱為彼此“接近”。盡管特定標(biāo)記等位基因能夠表現(xiàn)出與玉米大斑病抗性表型共分離，但重要的是注意到標(biāo)記基因座不一定負責(zé)表達玉米大斑病抗性表型。例如，不要求標(biāo)記多核苷酸序列是賦予增強的玉米大斑病抗性的基因的部分(例如是基因開放閱讀框的部分)。特定標(biāo)記等位基因與增強的玉米大斑病抗性表型的關(guān)聯(lián)，是由于在等位基因從中起源的祖先玉米品系中，標(biāo)記等位基因和等位基因之間最初的“耦合”相連鎖。最后通過反復(fù)重組，標(biāo)記和基因座間的交換事件能夠改變這種取向。正是因為這個原因，有利標(biāo)記等位基因可根據(jù)存在于耐受性親本中的相連鎖發(fā)生改變，所述耐受性親本用于制備分離種群。這不改變可使用標(biāo)記監(jiān)控表型分離的事實。它僅僅改變在給定分離種群中認為哪個標(biāo)記等位基因是有利的。本文鑒定的能夠被用于鑒定和選擇具有增強的玉米大斑病抗性的玉米植株的標(biāo)記包括PHM2798、b0302Hl、b0611N13、2717_3、2717_4、108fl6_2、31004、pco642297_3、bl09. m6、PHM18979、b0507L21、2_2、156K16、b0318il3、PHM4757、PHM13395-27、PHM4677-ll、PHM3418-12、PHM15992-3、NLB5A、NLB3A、PHM4582、9gl3_3、K、6_7、6_8、N、R、S、U、PHM2817-26、PHM7446-6、PHM13395-16、NLB17_A、NLB17_E、NLB17_3、NLB18_A、*NLB18_E。任何位于 PHM2798、b0302Hl、b0611N13、2717_3、2717_4、108fl6_2、31004、pco642297_3、bl09. m6、PHM18979、b0507L21、2_2、156K16、b0318il3、PHM4757、PHM13395-27、PHM4677-ll、PHM3418-12、PHM15992-3、NLB5A、NLB3A、PHM4582、9gl3_3、K、6_7、6_8、N、R、S、U、PHM2817-26、PHM7446-6、PHM13395-16、NLB17_A、NLB17_E、NLB17_3、NLB18_A、或 NLB18_E 的50cM以內(nèi)的標(biāo)記也能夠被用作針對玉米大斑病抗性的標(biāo)記。染色體區(qū)間提供了與玉米大斑病抗性關(guān)聯(lián)的染色體區(qū)間。本領(lǐng)域熟知的多種方法可用于鑒定染色體區(qū)間。此類染色體區(qū)間的邊界擴展到涵蓋將與控制受關(guān)注性狀的基因連鎖的標(biāo)記。換句話說，擴展染色體區(qū)間使得位于區(qū)間內(nèi)的任何標(biāo)記(包括限定區(qū)間邊界的末端標(biāo)記)能夠被用作玉米大斑病抗性標(biāo)記。每個區(qū)間包含至少一個QTL，此外甚至可包含多于一個的QTL。相同區(qū)間中非常接近的多個QTL可攪亂特定標(biāo)記與特定QTL的關(guān)聯(lián)，因為一個標(biāo)記可顯示與多于一個的QTL連鎖。相反地，例如如果非常接近的兩個標(biāo)記顯示與期望表型性狀共分離，有時分不清楚是否那些標(biāo)記中的每一個鑒定相同QTL或兩個不同的QTL。無論如何，完成或?qū)嵤┍景l(fā)明不需要了解在特定區(qū)間中有多少Q(mào)TL。8號染色體上包含一個或多個與玉米大斑病抗性關(guān)聯(lián)的QTL的區(qū)間能夠被下列標(biāo)記限定并包括下列標(biāo)記a. PHM13395-27 和 PHM4677-11 ；b. PHM13395-27 和 PHM3418-12 ；c. 2717_4 和 b0507L21 ；d. 108fl6_2 和 pco642297_3 ； e. PHM2817-26 和 PHM7446-6 ；f. PHM4582 和 R ;和g.6_8 和 R。位于任何這些區(qū)間內(nèi)的任何標(biāo)記在玉米中被用作玉米大斑病抗性的標(biāo)記。染色體區(qū)間也能夠通過與所關(guān)注的標(biāo)記連鎖(表現(xiàn)出連鎖不平衡)的標(biāo)記限定，r2是關(guān)聯(lián)性研究中連鎖不平衡(LD)的常見量度。如果本文鑒定的任何標(biāo)記基因座和上述8號染色體區(qū)間中的另一個標(biāo)記(也描述于本文中)之間LD的r2值大于1/3 (Ardlie等人，Nature Reviews Genetics 3 :299-309 (2002))，則所述基因座是連鎖的。標(biāo)記等位基因和單倍型組合本發(fā)明的標(biāo)記也能夠是一個或多個標(biāo)記基因座上的等位基因的組合，或者稱為單倍型。本文所述的任何標(biāo)記等位基因能夠被單獨地或組合地用于鑒定或選擇具有增強的玉米大斑病抗性的玉米植株。這包括表3和6中顯示(條帶大小)的酶切擴增多態(tài)性序列(CAPS)標(biāo)記 PHM2798、b0302Hl、b0611N13、2717_3、2717_4、108fl6_2、31004、pco642297_3、bl09. m6、PHM18979、b0507L21、2_2、156K16、b0318il3、PHM4757、PHM4582、9gl3_3、K、67、68、N、R、S和U以及它們預(yù)期的等位基因，以及單核苷酸多態(tài)性(SNP)標(biāo)記等位基因位于PHM13395-27 的“G”、位于 PHM4677-11 的“T”、位于 PHM3418-12 的“A”、位于 PHM15992-3 的“T”、位于 PHM2817-26 的 “C”、位于 PHM7446-6 的 “A” 和位于 PHM13395-16 的 “G”(表 4 和7)。有利的單倍型包括但不限于在NLB17_A處的PH26N單倍型，在NLB17_E處的PH26N單倍型，在NLB17_3處的PH26N單倍型，在NLB18_A處的PH26N單倍型，在NLB18_E處的PH26N單倍型，在NLB18_A處的PH99N單倍型和在NLB18_E處的PH99N單倍型。技術(shù)人員將期望可能存在附加的多態(tài)性位點，所述位點位于本文鑒定的8號染色體標(biāo)記內(nèi)部的以及周圍的標(biāo)記基因座上，其中一個或多個多態(tài)性位點與單倍型的一個或多個多態(tài)性位點上的等位基因連鎖不平衡(LD)。在不同多態(tài)性位點上的兩個特定等位基因據(jù)稱是LD，如果在其中一個位點上存在等位基因，則易于推測在相同染色體上的其他位點上存在等位基因(Stevens, Mol. Diag. 4 :309-17 (1999))。標(biāo)記輔助的詵擇(MAS)分子標(biāo)記可用于多種植株育種應(yīng)用(如參見Staub等人(1996) Hortscience 31:729-741 ；Tanksley (1983)Plant Molecular Biology Reporter. I :3_8)。受關(guān)注的主要領(lǐng)域之一是使用標(biāo)記輔助選擇(MAS)增加回交和基因滲入的效率。展示出與影響期望表型性狀的基因座連鎖的分子標(biāo)記提供了在植株種群中選擇性狀的有用工具。當(dāng)表型難以測定(例如很多病害抗性性狀)，或表型發(fā)生在植株發(fā)育的晚期(例如籽粒特征)時，尤其如此。由于DNA標(biāo)記測定比田間表型分析更省力并且占用的物理空間更小，可測定更大的種群，增加了發(fā)現(xiàn)具有從供體品系移動至受體品系的靶片段的重組體的概率。連鎖越緊密，標(biāo)記越有用，這是因為重組不太可能發(fā)生于標(biāo)記和引起性狀的基因之間，所述重組可導(dǎo)致假陽性。由于需要雙重組事件，兩側(cè)標(biāo)記減少了假陽性選擇發(fā)生的概率。理想情況是基因本身具有標(biāo)記，使得標(biāo)記和基因之間的重組不能發(fā)生。此類標(biāo)記稱為“完美標(biāo)記”。當(dāng)基因通過MAS滲入時，不僅引入了基因而且引入了兩側(cè)區(qū)域(G印ts. (2002)Crop Sci ;42 :1780-1790)。這稱為“連鎖累贅”。在供體植株與受體植株極不相關(guān)的情況下，這些兩側(cè)區(qū)域攜帶可編碼農(nóng)學(xué)上不良性狀的附加基因。該“連鎖累贅”也可導(dǎo)致產(chǎn)量減少或其他負面農(nóng)學(xué)特性，即便與優(yōu)良玉米品系回交多個周期后。這有時也稱為“產(chǎn)量累贅”。兩側(cè)區(qū)域的大小可通過附加的回交而減小，雖然這并不總是成功的，因為育種人員不 能控制該區(qū)域或重組斷點的大小(Young等人(1998)Genetics 120:579-585)。在經(jīng)典育種中，通常只是單憑偶然因素選取有助于減小供體片段大小的重組(Tanksley等人(1989)Biotechnology :257-264)。即使在此類回交次數(shù)達20次后，可預(yù)期找到的仍與所選基因連鎖的供體染色體還是具有相當(dāng)大的片段。然而如果使用標(biāo)記的話，就可能選取那些在受關(guān)注的基因附近經(jīng)歷了重組的稀有個體。在150株回交植株中，至少一株植株經(jīng)歷交換有95%的概率，所述交換在基于單次減數(shù)分裂圖距的IcM基因內(nèi)進行。標(biāo)記使得能夠明確鑒定這些個體。對于300株植株的一次附加回交，在基因另一側(cè)的IcM單次減數(shù)分裂圖距內(nèi)有95%的交換概率，從而產(chǎn)生在基于單次減數(shù)分裂圖距小于2cM的靶基因附近的片段。用標(biāo)記時在兩代就可實現(xiàn)，而不用標(biāo)記時則需要平均100代(參見Tanksley等人，同上)。當(dāng)基因的確切位置已知時，圍繞基因的兩側(cè)標(biāo)記可用于在不同的種群大小中對重組進行正選擇。例如，在更小的種群中，預(yù)期重組可進一步遠離基因，因此需要更遠端的兩側(cè)標(biāo)記來檢測重組。包含增強密度的公開玉米標(biāo)記的玉米基因組整合連鎖圖譜的可用性促進了玉米基因作圖和MAS。參見如IBM2鄰接圖譜，該圖譜可在Maize⑶B網(wǎng)站上在線獲取。具體實施MAS的關(guān)鍵是(i)限定標(biāo)記-性狀的關(guān)聯(lián)在其中將被測定的群體，其能夠是分離群體、或隨機的或結(jié)構(gòu)化的群體；( )監(jiān)測多態(tài)性標(biāo)記相對于性狀的分離或關(guān)聯(lián)，并使用統(tǒng)計學(xué)方法確定連鎖或關(guān)聯(lián)；(iii)基于統(tǒng)計學(xué)分析的結(jié)果限定一組所期望的標(biāo)記，和(iv)運用和/或外推該信息至當(dāng)前的育種種質(zhì)，以使得能夠作出基于標(biāo)記的選擇決定。本公開中描述的標(biāo)記，以及其他標(biāo)記類型例如SSR和FLP，可用于標(biāo)記輔助的選擇方案。簡單重復(fù)序列(SSR)能夠被定義為相對少量的6bp或更短的DNA的串聯(lián)重復(fù)(Tautz (1989) Nucleic Acid Research 17 :6463-6471 ;Wang 等人(1994) Theoretical andApplied Genetics,88 :1_6)。多態(tài)性由于重復(fù)單元數(shù)量的變化而增加,這種變化很可能是由 DNA 復(fù)制過程中的滑移導(dǎo)致的(Levinson 和 Gutman (1987) Mol Biol Evol 4:203-221)。重復(fù)長度的變化可通過在保守的非重復(fù)兩側(cè)區(qū)域設(shè)計PCR引物來檢測(Weber和May (1989)Am J Hum Genet. 44 :388-396)。SSR非常適于作圖和MAS，因為它們是多等位基因的、共顯性的、可再現(xiàn)的，并且適合高通量自動化(Rafalski等人(1996) Generating and using DNAmarkers in plants, Non-mammalian genomic analysis a practical guide. Academicpress,第 75-135 頁)。可生成各種類型的SSR標(biāo)記，并且來自抗性品系的SSR特征圖可通過擴增產(chǎn)物的凝膠電泳獲取。標(biāo)記基因型的評分基于擴增片段的大小。由位于Saint-Jean-sur-Richelieu, Quebec, Canada 的 DNA Landmarks 依據(jù)合同規(guī)定向公眾提供玉米的SSR服務(wù)。也可生成各種類型的FLP標(biāo)記。最常見地，擴增引物用于生成片段長度多態(tài)性。此類FLP標(biāo)記在很多方面類似于SSR標(biāo)記，不同的是由引物擴增的區(qū)域通常不是高度重復(fù)區(qū)域。通常由于插入或缺失，擴增區(qū)域或擴增子在種質(zhì)間還具有足夠的可變性，使得由擴增引物產(chǎn)生的片段能夠在多態(tài)性個體中區(qū)分開，并且已知此類插入缺失常常發(fā)生于玉米中(Bhattramakki 等人(2002) Plant Mol Biol 48，539-547 ;Rafalski (2002b，同上))。SNP標(biāo)記檢測單堿基對核苷酸取代。在所有分子標(biāo)記類型當(dāng)中，SNP是最多的， 因此具有提供最高基因圖譜分辨率的能力(Bhattramakki等人2002，Plant MolecularBiology 48:539-547)。SNP可在甚至比SSR更高的通量水平上進行檢測，即以所謂的“超高通量”模式進行檢測，因為它們不需要大量DNA，并且可直接進行自動化檢測。SNP也具有成為相對低成本系統(tǒng)的前景。這三個因素一起使得SNP對在MAS中的應(yīng)用具有高度吸引力。若干種方法可用于SNP基因分型，包括但不限于雜交、引物延伸、寡核苷酸連接、核酸酶酶解、微測序和編碼球。此類方法已經(jīng)被以下文獻敘述Gut (2001) Hum Mutat 17，第475-492 頁；Shi (2001) Clin Chem 47，第 164-172 頁；Kwok(2000)Pharmacogenomics 1，第 95-100 頁；Bhattramakki 和 Rafalski (2001)Discovery and application of singlenucleotidepolymorphism markers in plants, R. J. Henry 編輯，Plant Genotyping The DNAFingerprinting of Plants, CABI Publishing, Wallingford。多種可商購獲得的技術(shù)利用這些方法和其他方法檢查SNP,包括Masscode. TM. (Qiagen), Invader. RTM.(Third Wave Technologies),SnapShot. RTM. (AppliedBiosystems),Taqman. RTM. (AppliedBiosystems),以及 Beadarrays. TM. (Illumina)。許多一起在單條序列內(nèi)、或跨越連鎖序列的SNP可用于描述任何特定基因型的單倍型(Ching 等人(2002) BMC Genet. 3 :19 ；Gupta 等人 2001 ；Rafalski (2002b) PlantScience 162:329-333)。單倍型可比單個的SNP提供更多信息，并且可描述較多的任何特定基因型。例如，單個的SNP可以是具有玉米大斑病抗性的特定品系或品種的等位基因“T”，但是等位基因“T”也可發(fā)生在用于輪回親本的玉米育種種群中。在這種情況下，單倍型例如在連鎖SNP標(biāo)記上的等位基因組合可提供較多的信息。一旦已經(jīng)將唯一的單倍型分配給供體染色體區(qū)域，該單倍型可用于種群或其任何亞群以確定是否個體具有特定基因。參見例如W02003054229。使用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的那些自動化高通量標(biāo)記檢測平臺使得這一方法高效和有效。除了如上所述的SSR、FLP和SNP以外，其他類型的分子標(biāo)記也廣泛使用，包括但不限于表達序列標(biāo)簽(EST)、來源于EST序列的SSR標(biāo)記、隨機擴增多態(tài)性DNA (RAPD)、以及其他基于核酸的標(biāo)記。在一些情況下，同功酶特征圖和連鎖的形態(tài)學(xué)特征也可間接用作標(biāo)記。盡管它們不直接檢測DNA差異，它們通常也受特定的遺傳差異影響。然而，檢測DNA變異的標(biāo)記遠遠多于同功酶或形態(tài)學(xué)標(biāo)記并且更具多態(tài)性(Tanksley(1983)Plant Molecular BiologyReporter I :3_8)。序列比對或重疊群也可用于查找本文列出的特定標(biāo)記的上游或下游序列。這些新序列靠近本文所述的標(biāo)記，然后被用于發(fā)現(xiàn)和開發(fā)功能等同的標(biāo)記。例如將不同的物理和/或基因圖譜進行比對以定位等同標(biāo)記，所述標(biāo)記不在所述公開中描述，但是位于相似區(qū)域內(nèi)。這些圖譜可在玉米物種中，或者甚至包括已經(jīng)與玉米進行了遺傳上或物理上的比對的其他物種，如大米、小麥、大麥或高粱。一般來講，MAS使用的多態(tài)性標(biāo)記是經(jīng)鑒定具有與玉米大斑病抗性共分離的顯著概率的那些。推測此類標(biāo)記在圖譜上接近賦予植株玉米大斑病抗性表型的一個或多個基因，并且認為此類標(biāo)記是期望性狀的指示、或標(biāo)記。測試植株是否在標(biāo)記中存在期望的等位基因，并且期望在一個或多個基因座上包含期望基因型的植株將期望基因型與期望表型一起轉(zhuǎn)移到它們的子代。 PHM2798、b0302Hl、b0611N13、2717_3、2717_4、108fl6_2、31004、pco642297_3、bl09. m6、PHM18979、b0507L21、2_2、156K16、b0318il3、PHM4757、PHM13395-27、PHM4677-ll、PHM3418-12、PHM15992-3、NLB5A、NLB3A、PHM4582、9gl3_3、K、6_7、6_8、N、R、S、U、PHM2817-26、PHM7446-6、PHM13395-16、NLB17_A、NLB17_E、NLB17_3、NLB18_A、和 NLB18_E，以及其他遺傳上或物理上被作圖至相同染色體片段的標(biāo)記，可以被用于選擇具有增強的玉米大斑病抗性的玉米植株。然而，并非所有在遺傳上和物理上作圖至相同染色體片段的標(biāo)記都可用于對具有增強的玉米大斑病抗性的玉米植株進行正選擇，因為標(biāo)記可能在特定種群內(nèi)無法提供足夠的信息。本文提供的區(qū)間用于MAS中，以選擇表現(xiàn)出增強的玉米大斑病抗性的植株。例如，被作圖至8號染色體區(qū)間內(nèi)的任何標(biāo)記能夠被用于此目的，所述區(qū)間由如下標(biāo)記限定并且包括它們a. PHM13395-27 和 PHM4677-11 ；b. PHM13395-27 和 PHM3418-12 ；c. 2717_4 和 b0507L21 ；d. 108fl6_2 和 pco642297_3 ；e. PHM2817-26 和 PHM7446-6 ；f. PHM4582 和 R ；以及g.6_8 和 R。用于選擇的方法能夠涉及檢測與同增強的玉米大斑病抗性關(guān)聯(lián)的標(biāo)記等位基因或單倍型連鎖并關(guān)聯(lián)的一種或多種標(biāo)記等位基因在玉米植株或種質(zhì)中的存在，然后基于所檢測的標(biāo)記等位基因選擇玉米植株或種質(zhì)。所述單倍型能夠是在NLB17_A處的PH26N單倍型，在NLB17_E處的PH26N單倍型，在NLB17_3處的PH26N單倍型，在NLB18_A處的PH26N單倍型，在NLB18_E處的PH26N單倍型，在NLB18_A處的PH99N單倍型，或在NLB18_E處的PH99N單倍型。用于MAS的方法還能夠包括獲得第一玉米植株，所述第一玉米植株在其基因組中包含與增強的玉米大斑病抗性關(guān)聯(lián)的單倍型，所述單倍型例如在NLB17_A處的PH26N單倍型，在NLB17_E處的PH26N單倍型，在NLB17_3處的PH26N單倍型，在NLB18_A處的PH26N單倍型，在NLB18_E處的PH26N單倍型，在NLB18_A處的PH99N單倍型，或在NLB18_E處的PH99N單倍型；將所述第一玉米植株與具有較低水平抗性的第二玉米植株雜交；以及就所述第一玉米植株的單倍型的存在對子代進行基因分型。然后，具有所述第一玉米植株的單倍型(即與增強的玉米大斑病抗性關(guān)聯(lián)的單倍型)的子代植株能夠被選擇為具有增強的玉米大斑病抗性。通過轉(zhuǎn)基因的異位表達的增強的抗性本發(fā)明的實施方案還包括分離的或充分純化的多核苷酸或蛋白質(zhì)組合物。“分離的”或“純化的”多核苷酸或蛋白質(zhì)，或其生物活性部分，是充分地或基本上不含那些在天然存在環(huán)境中伴隨所述多核苷酸或蛋白質(zhì)或與其相互作用的組分的。因此，分離的或純化的多核苷酸或蛋白質(zhì)，當(dāng)其是通過重組技術(shù)(例如PCR擴增)產(chǎn)生的時，基本上不含其他細 胞物質(zhì)，或者當(dāng)其是化學(xué)合成的時，基本上不含化學(xué)前體或其他化學(xué)品。最理想的情況，“分離的”多核苷酸不含在該多核苷酸所來源于的生物的基因組DNA中天然地存在于所述多核苷酸兩側(cè)(即，位于所述多核苷酸的5'和3'端)的序列(例如，蛋白質(zhì)編碼序列)。例如,在不同的實施方案中，所述分離的多核苷酸可包含少于約5kb、約4kb、約3kb、約2kb、約lkb、約O. 5kb、或約O. Ikb的在該多核苷酸所來源于的細胞的基因組DNA中天然地存在于所述多核苷酸兩側(cè)的核苷酸序列。基本上不含細胞物質(zhì)的蛋白質(zhì)包括制備含有少于約30%、約20%、約10%、約5%或約I % (以干重計)的雜蛋白的蛋白質(zhì)。當(dāng)所述實施方案的蛋白質(zhì)或其生物活性部分為重組生產(chǎn)的時，最佳的培養(yǎng)基包含少于約30%、約20%、約10%、約5%或約1% (以干重計)的化學(xué)前體或非目標(biāo)蛋白質(zhì)的化學(xué)品。所公開的核苷酸序列片段和突體，以及由此編碼的蛋白質(zhì)也包括在本發(fā)明的實施方案內(nèi)?！捌巍敝荚诒硎竞塑账嵝蛄械牟糠只虬被嵝蛄械牟糠忠约坝纱司幋a的蛋白質(zhì)。核苷酸序列的片段可編碼保留了天然蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性的蛋白質(zhì)片段，所述蛋白質(zhì)片段因此具有賦予植株真菌抗性的能力。作為另外一種選擇，作為雜交探針起作用的核苷酸序列的片段不必編碼保留了生物學(xué)活性的片段蛋白質(zhì)。因此，核苷酸序列片段的長度范圍可以是至少約15個核苷酸、約50個核苷酸、約100個核苷酸、以及最多為編碼本發(fā)明實施方案的多肽的全長核苷酸序列。編碼本發(fā)明實施方案的多肽的生物活性部分的核苷酸序列片段，將編碼至少約15個、約25個、約30個、約40個或約50個連續(xù)的氨基酸，或最多存在于本發(fā)明實施方案的全長多肽中的總的數(shù)量的氨基酸。用作雜交探針或PCR引物的核苷酸序列片段一般不需要編碼蛋白質(zhì)的生物活性部分。如本文所用，就所指定的多核苷酸而言的“全長序列”意指具有天然序列的完整核酸序列?！疤烊恍蛄小敝荚诒硎緝?nèi)源性序列，即，存在于生物基因組中的非工程化的序列。因此，本發(fā)明實施方案的核苷酸序列的片段可編碼多肽的生物活性部分，或者它可以是能用作使用下文所公開方法的雜交探針或PCR引物的片段。抗病原體的多肽的生物活性部分，可通過分離本發(fā)明實施方案的核苷酸序列之一的一個部分、表達所述蛋白質(zhì)的編碼部分、以及評估所述蛋白質(zhì)的編碼部分賦予或增強植株的真菌抗性的能力進行制備。作為本發(fā)明實施方案的核苷酸序列的片段的核酸分子，包含至少約15個、約20個、約50個、約75個、約100個或約150個核苷酸，或最多存在于本文所公開的全長核苷酸序列中的總的數(shù)量的核苷酸?！白凅w”旨在表示基本上類似的序列。就多核苷酸而言，變體包括在天然多核苷酸的一個或多個內(nèi)部位點有一個或多個核苷酸的缺失和/或插入，和/或在天然多核苷酸的一個或多個位點有一個或多個核苷酸的取代 。如本文所用，“天然”多核苷酸或多肽分別包含天然存在的核苷酸序列或氨基酸序列。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將認識到，本發(fā)明實施方案的核酸的變體將被構(gòu)建為使得開放閱讀框被保持。就多核苷酸而言，保守的變體包括那些由于遺傳密碼的簡并性，編碼本發(fā)明實施方案的多肽之一的氨基酸序列的序列。天然存在的等位變體如這些能通過使用熟知的分子生物學(xué)技術(shù)鑒定的變體，所述技術(shù)例如下文所列出的聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)和雜交技術(shù)。變體多核苷酸還包括合成得到的多核苷酸，例如，那些通過利用例如定點誘變產(chǎn)生的多核苷酸，但其仍然編碼本發(fā)明實施方案的蛋白質(zhì)。一般來講，如通過序列比對程序和本文其他地方所述的參數(shù)所測定的，本發(fā)明實施方案的特定多核苷酸的變體與該特定多核苷酸之間將至少具有約40%、約45%、約50%、約55%、約 60%、約 65%、約 70%、約 75%、約 80%、約 85%、約 90%、約 91%、約 92%、約 93%、約
94%、約95 %、約96 %、約97 %、約98 %、約99 %或更高的序列同一性。本發(fā)明實施方案的特定多核苷酸(即參考多核苷酸)的變體，還可通過比較變體多核苷酸所編碼的多肽和參考多核苷酸所編碼的多肽之間的序列同一性百分比來加以評估。因此，例如，本文公開了所編碼的多肽與SEQID NO :93、95、或97的多肽具有給定的序列同一性百分比的分離的多核苷酸。任何兩種多肽之間的序列同一性百分比可利用序列比對程序和本文其他地方所述的參數(shù)計算出。當(dāng)通過比較本發(fā)明實施方案的任何一對給定的多核苷酸所編碼的兩種多肽之間的序列同一性百分比，來評估所述任何一對給定的多核苷酸時，上述兩種編碼的多肽之間的序列同一性百分比為至少約40%、約45%、約50%、約 55%、約 60%、約 65%、約 70%、約 75%、約 80%、約 85%、約 90%、約 91%、約 92%、約93%、約 94%、約 95%、約 96%、約 97%、約 98%、約 99%或更高?！白凅w”蛋白質(zhì)旨在表示通過在天然蛋白質(zhì)的一個或多個內(nèi)部位點有一個或多個氨基酸的缺失或插入，和/或在天然蛋白質(zhì)的一個或多個位點有一個或多個氨基酸的取代而源自于所述天然蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)。本發(fā)明實施方案所包括的變體蛋白質(zhì)是具有生物活性的，也就是說它們?nèi)匀粨碛刑烊坏鞍踪|(zhì)所擁有的所期望的生物活性，即賦予或增強植株病原真菌抗性的能力，如本文所述。此類變體可得自例如遺傳多態(tài)性或得自人工操縱。如通過序列比對程序和本文其他地方所述的參數(shù)所測定的，本發(fā)明實施方案的天然蛋白質(zhì)的具生物活性的變體與該天然蛋白質(zhì)的氨基酸序列之間將至少具有約40%、約45%、約50%、約 55%、約 60%、約 65%、約 70%、約 75%、約 80%、約 85%、約 90%、約 91%、約 92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%或更高的序列同一性。本發(fā)明實施方案的蛋白質(zhì)的具生物活性的變體與該蛋白質(zhì)之間，可以在少至約1-15個氨基酸殘基、少至約1-10個,例如約6-10個、少至約5個、少至4個、3個、2個或甚至I個氨基酸殘基上存在不同。本發(fā)明實施方案的蛋白質(zhì)可用多種方法進行改變，包括氨基酸取代、缺失、截短和插入。此類操縱方法是本領(lǐng)域一般已知的。例如，抗病蛋白質(zhì)的氨基酸序列變體和片段能夠通過DNA中的突變制備。用于突變生成和多核苷酸改變的方法是本領(lǐng)域中所熟知的。參見例如 Kunkel (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 :488-492 ；KunkeI 等人(1987)Methods inEnzymoI. 154 :367-382 ;美國專利 4，873，192 ；ffalker 和 Gaastra 編輯(1983)Techniquesin Molecular Biology (MacMillan Publishing Company, NewYork),以及它們引用的文獻。關(guān)于不影響受關(guān)注蛋白質(zhì)的生物活性的適當(dāng)氨基酸取代的指導(dǎo)可參見Dayhoff等人的模型(1978)Atlas of ProteinSequence and Structure(Natl. Biomed. Res. Found.,Washington,D. C.),其以引用方式并入本文?？蓛?yōu)選保守取代，如用一個具有相似性質(zhì)的氨基酸取代另一個氨基酸。因此，本發(fā)明實施方案的基因和多核苷酸既包括天然存在的序列也包括突變形式。同樣的，本發(fā)明實施方案的蛋白質(zhì)既包括天然存在的蛋白質(zhì)也包括其變體和修飾形式。此類變體將繼續(xù)擁有所期望的賦予或增強植株病原真菌抗性的能力。顯然，在編碼變體的DNA中制造的突變不應(yīng)將所述序列置于閱讀框之外，并且優(yōu)選地將不產(chǎn)生能導(dǎo)致產(chǎn)生mRNA二級結(jié)構(gòu)的互補區(qū)域。參見EP專利0075444。不期望本文包括的蛋白質(zhì)序列的缺失、插入和取代導(dǎo)致所述蛋白質(zhì)的特性產(chǎn)生巨大的改變。然而，考慮到取代、缺失或插入的確切效果在進行這些操作之前難以預(yù)料，本領(lǐng)域的技術(shù)人員將會知道，將通過篩選用變體蛋白轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植株對所述效果進行評估， 以確定對植株抵御病原真菌攻擊的能力的影響。變體多核苷酸和蛋白質(zhì)也包括來源于誘變或重組過程(包括且不限于例如DNA改組這樣的過程)的序列和蛋白質(zhì)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠設(shè)想那些將會改變蛋白質(zhì)相應(yīng)的病原體的范圍的修飾。通過此類過程，一種或多種不同的蛋白質(zhì)編碼序列可被操作，以產(chǎn)生擁有所期望的性質(zhì)的新蛋白質(zhì)。如此，從一組包含具有基本的序列同一性、并且能在體外或體內(nèi)進行同源重組的序列區(qū)域的相關(guān)多核苷酸序列，產(chǎn)生了重組多核苷酸文庫。例如，采用這一途徑，編碼一個受關(guān)注的結(jié)構(gòu)域的序列基序，可以在本發(fā)明實施方案的蛋白質(zhì)基因和其他已知的蛋白質(zhì)基因之間重排，以得到編碼具有改良的受關(guān)注特性的蛋白質(zhì)的新基因，所述特性例如提高的賦予或增強植株病原真菌抗性的能力。用于此類DNA改組的策略是本領(lǐng)域中已知的。參見例如 Stemmer (1994)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 :10747-10751 ；Stemmer (1994)Nature 370 :389-391 ；Crameri 等人(1997)Nature Biotech. 15 :436-438 ；Moore 等人(1997) J. Mol. Biol. 272 :336-347 ；Zhang 等人(1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA
94:4504-4509 ；Crameri 等人(1998) Nature 391 :288-291 ;以及美國專利 5，605，793 和5，837，458。本發(fā)明實施方案的多核苷酸可被用于從其他生物(尤其是其他植株)分離相應(yīng)的序列。如此,能使用例如PCR、雜交等方法基于此類序列與本文所述序列的序列同源性鑒定此類序列?；谄渑c本文所述的完整序列之間或與它們的變體和片段之間的序列同一性而被分離的序列，被包括在本發(fā)明實施方案之內(nèi)。此類序列包括公開序列的直系同源物?！爸毕低次铩敝荚诒硎緛碓从诠餐淖嫦然虿⒆鳛槲锓N形成的結(jié)果存在于不同物種的基因。當(dāng)存在于不同物種中的基因的核苷酸序列和/或它們編碼的蛋白質(zhì)序列至少具有約 60%、約 70%、約 75%、約 80%、約 85%、約 90%、約 91%、約 92%、約 93%、約 94%、約
95%、約96 %、約97 %、約98 %、約99 %、或更高的序列同一性時，這些基因被認為是直系同源體。直系同源物的功能在物種之間經(jīng)常是高度保守的。因此，編碼賦予或增強真菌植株病原體抗性的蛋白質(zhì)的、和在嚴格條件下與本文所公開的序列或其變體或片段雜交的分離的多核苷酸，均包括在本發(fā)明的實施方案內(nèi)。
在一個PCR方法中，能設(shè)計寡核苷酸引物用于PCR反應(yīng)以從提取自任何受關(guān)注生物的cDNA或基因組DNA中擴增相應(yīng)的DNA序列。用于設(shè)計PCR引物和PCR克隆的方法是本領(lǐng)域一般已知的，公開于Sambrook等人(1989)Molecular Cloning A Laboratory Manual (第二 版，Cold SpringHarbor Laboratory Press, Plainview,New York)中。也參見 Innis 等人編輯(1990)PCR Protocols A Guide to Methodsand Applications(AcademicPress, New York) ；Innis 和 Gelfand 編輯(1995)PCRStrategies (Academic Press, New York);以及 Innis 和 Gelfand 編輯(1999) PCRMethodsManual (Academic Press, New York)。已知的PCR方法包括且不限于使用成對引物、巢式引物、單個特異引物、簡并引物、基因特異性引物、載體特異性引物、部分錯配引物等的方法。在雜交技術(shù)中，將已知多核苷酸的全部或部分用作探針，探針選擇性地雜交到來自所選擇生物的存在于一組克隆基因組DNA片段或cDNA片段的其他對應(yīng)多核苷酸上(即，基因組或cDNA文庫)。雜交探針可以是基因組DNA片段、cDNA片段、RNA片段、或其他寡核苷酸，并且可以用可檢測的基團如32P、或任何其他可檢測標(biāo)記物標(biāo)記。因此，例如，通過基于本發(fā)明實施方案的多核苷酸標(biāo)記合成的寡核苷酸，可制得用于雜交的探針。用于制備雜 交探針和構(gòu)建cDNA和基因組文庫的方法是本領(lǐng)域一般已知的，并且公開于Sambrook等人所著文獻(1989，同上)中。例如，本文所公開的完整的多核苷酸，或其一個或多個部分，可被用作能特異性地與相應(yīng)的多核苷酸和信使RNA雜交的探針。為了在多種條件下實現(xiàn)特異性雜交，此類探針包括特有的序列，并且所述序列的長度優(yōu)選為至少約10個核苷酸、至少約15個核苷酸或至少約20個核苷酸。此類探針可被用于通過PCR從選定的生物擴增相應(yīng)的多核苷酸?？墒褂么思夹g(shù)分離來自所期望生物的附加編碼序列或作為診斷檢測分析法測定編碼序列在一種生物中的存在。雜交技術(shù)包括雜交篩選置于板上的DNA文庫(噬菌斑或菌落；參見例如，Sambrook 等人(1989,同上))?？稍趪栏駰l件下進行此類序列的雜交?！皣栏駰l件”或“嚴格雜交條件”是指在該條件下探針將以比其他序列更高的可檢測程度雜交到其靶序列上(例如至少2倍于背景)。嚴格條件是序列依賴性的并將因不同的環(huán)境而異。通過控制雜交和/或洗滌條件的嚴格性，可鑒定與探針100%互補的靶序列(同源探測)。作為另一種選擇，可調(diào)節(jié)嚴格條件以允許序列中的一些錯配，以便檢測到更低程度的相似性(異源探測)。通常，探針的長度少于約1000個核苷酸,優(yōu)選長度少于500個核苷酸。通常，嚴格條件將是如下那些條件在pH7. O至8. 3下鹽濃度低于約I. 5M鈉離子，通常約0. OlM至I. OM鈉離子濃度(或其它鹽)，并且對于短探針(例如10個至50個核苷酸)溫度為至少約30°C，而對于長的探針(例如多于50個核苷酸)溫度為至少約60°C。嚴格條件也可以通過加入諸如甲酰胺之類的去穩(wěn)定劑來實現(xiàn)。示例性的低嚴格條件包括在37°C下于含有30%至35%甲酰胺、IM NaCl、I % SDS (十二烷基硫酸鈉)的緩沖液中雜交，以及在50°C至55°C下用IX至2X SSC (20X SSC = 3. OM NaCl/0. 3M檸檬酸三鈉)洗滌。示例性的中等嚴格條件包括在37°C下于40%至45%甲酰胺、I. OM NaClU % SDS中雜交，以及在55°C至60°C下用0. 5X至IXSSC洗滌。示例性的高度嚴格條件包括在37°C下于50%甲酰胺、lMNaCl、l% SDS中雜交，以及最終在60°C至65°C下用0. IX SSC洗滌至少30分鐘。任選地，洗滌緩沖液可包含約0. 1%至約1%的SDS。雜交時間一般小于約24小時，通常為約4小時至約12小時。洗滌時間為至少足夠達到平衡狀態(tài)的一段時間。特異性通常取決于雜交后洗滌，最后的洗滌溶液的離子強度和溫度是關(guān)鍵因素。就DNA-DNA雜交體而言，熱力學(xué)熔點(Tm)可以估算自Meinkoth和Wahl (1984)Anal. Biochem. 138 :267-284 的公式! = 81. 5 °C +16. 6 (log Μ) +0. 41 ( % GC)-O. 61( %form)-500/L ;其中M為單價陽離子的體積摩爾濃度，％ GC為DNA中鳥苷和胞嘧啶核苷酸的百分比，％ form為 雜交溶液中甲酰胺的百分比，而L為以堿基對表示的雜交體的長度。^指(在確定的離子強度和pH下)50%的互補靶序列與完全匹配的探針雜交時的溫度。每出現(xiàn)1%的錯配，Tffl降低約1°C ;因此，可調(diào)節(jié)Tm、雜交和/或洗滌條件以與具有所期望的同一性的序列雜交。例如，如果要尋求具有>90%同一性的序列，則可將Tm降低10°C。通常，在確定的離子強度和PH下，嚴格條件選擇為比特定序列及其互補序列的Tm低約5°C。然而，極嚴格條件可采用在Tm低I °C、2 °C、3 °C或4 °C的溫度下的雜交和/或洗滌；中等嚴格條件可采用在比Tm低6°C、7°C、8°C、9°C或10°C的溫度下的雜交和/或洗滌；低嚴格條件可采用在比Tm低11°C、12°C、13°C、14°C、15°C或20°C的溫度下的雜交和/或洗滌。利用上述公式、雜交和洗滌組合物以及所需的Tm，一般技術(shù)人員將會理解，雜交和/或洗滌溶液的嚴格性的變化已經(jīng)在本質(zhì)上得以描述。如果所需的錯配程度導(dǎo)致^低于45°C (水溶液)或32°C (甲酰胺溶液)，則優(yōu)選提高SSC的濃度以便能使用更高的溫度。對核酸雜交的一個廣泛適用的指導(dǎo)可見于 Tijssen(1993)Laboratory Techniquesin Biochemistry and MolecularBiologyHybridization with Nucleic Acid Probes,第 I 部分，第 2 章(Elsevier, NewYork);以及 Ausubel 等人編輯(1995) Current Protocols in Molecular Biology,第 2 章(Greene Publishing andffiley-Interscience, New York)。參見 Sambrook 等人(1989,同上)。有多種方法可被用于檢測特定序列的DNA、RNA或蛋白質(zhì)是否存在。這些方法包括例如，DNA印跡、RNA印跡、蛋白質(zhì)印跡和ELISA分析。諸如上述這些的技術(shù)為本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知，并且有大量提供了詳細操作規(guī)程的參考文獻存在。此類參考文獻包括Sambrook 等人(1989,同上)，以及 Crowther, J. R. (2001)The ELISA Guidebook, HumanaPress, Totowa, NJ, USA。以下術(shù)語被用于描述在兩種或更多種多核苷酸或多肽之間的序列關(guān)系(a) “參考序列”，(b) “比對窗口”，(C) “序列同一性”和(d) “序列同一性百分比”。(a)如本文所用，“參考序列”是用作序列比對基準(zhǔn)的定義序列。參考序列可以是指定序列的一部分或全部；例如，全長cDNA或基因序列的一個片段，或全長cDNA或基因序列。(b)如本文所用，“比對窗口”比較參考序列和多核苷酸序列的連續(xù)的指定片段，其中在所述比對窗口中的多核苷酸序列與參考序列(不包含插入或缺失)相比可以包含插入或缺失(即間隙)，以獲得兩段多核苷酸之間的最大匹配。一般來講，比對窗口的長度為至少約20個連續(xù)的核苷酸，并且任選地可以為約30個、約40個、約50個、約100個或更長。本領(lǐng)域的技術(shù)人員懂得為了避免由于在多核苷酸序列中包含空位導(dǎo)致的它與參考序列的高度相似，通常導(dǎo)入空位罰分并從匹配數(shù)目中減去空位罰分。用于比對的序列比對方法是本領(lǐng)域熟知的。因此，能使用數(shù)學(xué)算法測定任意兩個序列之間的序列同一性百分比。此類數(shù)學(xué)算法的非限制性實例是Myers和Miller (1988)CABIOS 4 :11-17 的算法;SmUh 等人(1981) Adv. Appl. Math. 2 :482 的局部比對算法；Needleman 和 Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48 :443-453 的全局比對算法；Pearson 和Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85 :2444-2448 的局部搜尋比對方法；Karlin 和Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 872264 的算法，由 Karlin 和 Altschul 改進(1993)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 :5873_5877。能利用計算機實施這些數(shù)學(xué)算法，以比對序列、測定序列同一性。此類具體實施包括且不限于在 PC/Gene 程序中的 CLUSTAL(得自 Intelligenetics, Mountain View,California) ;ALIGN程序(版本2· O)和GCG Wisconsin Genetics Software Package版本10(可得自 Accelrys Inc. ,9685Scranton Road, San Diego, California, USA)中的 GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA。能夠使用默認參數(shù)進行使用這些程序的比對。以下文獻很好地描述了 CLUSTAL 程序Higgins 等人(1988)Gene73 :237-244(1988) ;Higgins 等人(1989) CABIOS 5 :151-153 ;Corpet 等人(1988) Nucleic Acids Res. 16 :10881-90 ;Huang等人(1992)CABI0S8 :155-65 ;以及 Pearson 等人(1994) Meth. Mol. Biol. 24 :307-331。ALIGN程序基于Myers和Miller (1988，同上)的算法。當(dāng)比對氨基酸序列時，PAM120權(quán)重殘基 表、gap length penalty 12、以及 gap penalty 4 能與 ALIGN 程序一起使用。Altschul 等人(1990)J. Mol. Biol. 215 :403 的 BLAST 程序基于 Karlin 和 Altschul 的算法(1990，同上)?？墒褂肂LASTN程序進行BLAST核苷酸搜索，score = 100, wordlength = 12,以獲取與編碼本發(fā)明實施方案的蛋白質(zhì)的核苷酸序列同源的核苷酸序列?？墒褂肂LASTX程序進行BLAST蛋白質(zhì)搜索，score = 50, wordlength = 3,以獲取與本發(fā)明實施方案的多肽同源的氨基酸序列。為了獲取用于比對目的的空位比對，可利用Gapped BLAST (BLAST 2.0)，如Altschul等人(1997)Nucleic Acids Res. 25 :3389中所述。作為另外一種選擇，可使用PSI-BLAST (BLAST 2. O)進行重復(fù)搜索，它檢測分子間的較遠關(guān)系。參見Altschul等人(1997，同上)。當(dāng)利用BLAST、Gapped BLAST、PSI-BLAST時，可使用相應(yīng)程序(例如用于核苷酸序列的BLASTN,用于蛋白的BLASTX)的默認參數(shù)。參見www. ncbi. nlm. nih. gov。也可通過檢查進行手動比對。除非另作說明，本文提供的序列同一性/相似性值指使用GAP版本10獲得的值，使用以下參數(shù)核苷酸序列的％同一'I"生和％相似性使用GAPWeight 50和Length Weight3,以及nwsgapdna. cmp計分矩陣；氨基酸序列的％同一注和％相似性使用Gap Weight 8和Length Weight 2，以及BL0SUM62計分矩陣；或者它們的任何等效程序。“等效程序”是指滿足下列條件的任何序列比對程序就任何正被討論的兩個序列而言，與GAP版本10生成的對應(yīng)比對相比，所述序列比對程序生成具有相同核苷酸或氨基酸殘基匹配和相同序列同一性百分比的比對。GAP 使用 Needleman 和 Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48 :443-453 的算法，以找出兩個完整序列之間使匹配數(shù)最大化和空位數(shù)最小化的比對結(jié)果。GAP考慮所有可能的比對和空位位點，并制備最大數(shù)目的匹配堿基和最少的空位。它允許以匹配堿基單位提供空位形成罰分和空位延伸罰分。GAP必須對它插入的每個空位形成空位形成罰分匹配數(shù)。如果選擇空位延伸罰分大于零，GAP必須另外形成對每個空位延伸罰分的空位次數(shù)的插入長度的空位罰分。蛋白質(zhì)序列的GCG Wisconsin Genetics Software Package版本10默認的空位形成罰分值和空位延伸罰分值分別是8和2。核苷酸序列的默認空位形成罰分是50，而默認空位延伸罰分是3?？瘴恍纬闪P分和空位延伸罰分能用選自O(shè)至200的整數(shù)表達。因此例如空位形成罰分和空位延伸罰分可以是0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65 或更大。GAP提供了比對家族中的其中一個最好的成員。此家族中可能有很多成員，并且其他成員沒有更好的質(zhì)量。GAP顯示了用于比對的四個質(zhì)量因數(shù)質(zhì)量、比率、同一性和相似性。質(zhì)量是比對序列的最大量度。比率是質(zhì)量除以較短片段中的堿基數(shù)。同一性百分比是實際匹配的符號的百分比。百分比相似性是相似符號的百分比。忽略來自空位對面的符號。當(dāng)一對符號的計分矩陣值大于或等于O. 50時(相似性閾值)，對相似性打分。GCGWisconsinGenetics Software Package版本10中使用的計分矩陣是BL0SUM62 (參見Henikoff和Henikoff (1989)Proc. Natl. Acad. Sci. USA89 :10915)。(C)如本文所用，涉及兩種多核苷酸或多肽序列時的“序列同一性”或“同一性”是指兩序列中的殘基當(dāng)在指定比較窗口中比對最大匹配時是相同的。已經(jīng)認識到當(dāng)序列同一性百分比用于蛋白質(zhì)時，不同的殘基位置常常存在保守氨基酸取代的差異，其中氨基酸殘基被取代為具有相似化學(xué)性質(zhì)(例如電荷或疏水性)的其他氨基酸殘基，并因此不 改變該分子的功能特性。當(dāng)序列出現(xiàn)保守取代差異時，可上調(diào)序列同一性百分比進行糾正以保持取代的保守性質(zhì)。存在此類保守取代差異的序列被稱為具有“序列相似性”或“相似性”。進行此類調(diào)整的方法為本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知。通常這涉及給一個保守取代評分為部分而不是完全錯配，因此提高序列同一性百分比。因此例如其中一個相同氨基酸計分為1，而非保守取代計分為零，保守取代計分介于零和I之間。例如在程序PC/GENE (Intelligenetics, Mountain View, California)中進行保守取代的計分計算。(d)如本文所用，“序列同一性百分比”是指通過在比較窗口中比較兩個最優(yōu)化比對的序列而測定的值，其中比較窗口中的多核苷酸序列的部分與參考序列(參考序列不包括插入或缺失)相比可包括插入或缺失(即間隙)以達到兩序列的最佳比對效果。所述百分比的計算方法是，統(tǒng)計相同的核酸堿基或氨基酸殘基在兩段序列中同時出現(xiàn)的位點的數(shù)量以得到匹配位點數(shù)，將此匹配位點數(shù)除以比對窗口中的總位點數(shù)，再將結(jié)果乘以100，從而得到序列同一性百分比。術(shù)語“多核苷酸”的使用并無將實施方案限制于包括DNA在內(nèi)的多核苷酸之意。本領(lǐng)域的一般技術(shù)人員將認識到，多核苷酸可包括核糖核苷酸以及核糖核苷酸和脫氧核糖核苷酸的組合。此類脫氧核苷酸和核糖核苷酸包括天然存在的分子和合成類似物。本發(fā)明實施方案的多核苷酸還包括所有形式的序列，所述形式包括且不限于單鏈形式、雙鏈形式等
坐寸ο可將本發(fā)明實施方案的分離的多核苷酸結(jié)合到能夠?qū)氩⒃谒拗骷毎袕?fù)制的重組DNA構(gòu)建體中。“載體”可以是這樣的一類構(gòu)建體，其包括一套復(fù)制體系和能夠在給定的宿主細胞中轉(zhuǎn)錄和翻譯多肽編碼序列的序列。適用于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染植株細胞或構(gòu)建轉(zhuǎn)基因植株的許多載體，已描述于，例如，Pouwels等人，Cloning Vectors A LaboratoryManual，1985， supp.1987 ；Weissbach 和 Weissbach， Methods for Plant MolecularBiology, AcademicPress，1989 ；以及 Flevin 等人，Plant Molecular Biology Manual，KluwerAcademic Publishers，1990。通常，植株表達載體包括例如，一個或多個處于5,和3'調(diào)控序列的轉(zhuǎn)錄控制下的克隆的植株基因和顯性選擇性標(biāo)記。這樣的植株表達載體還可含有啟動子調(diào)控區(qū)(例如控制著誘導(dǎo)型或組成型、環(huán)境或發(fā)育調(diào)控的、或細胞或組織特異性表達的調(diào)控區(qū))、轉(zhuǎn)錄起始開始位點、核糖體結(jié)合位點、RNA加工信號、轉(zhuǎn)錄終止位點和/或聚腺苷酸化信號。術(shù)語“重組構(gòu)建體”、“表達盒”、“表達構(gòu)建體”、“嵌合構(gòu)建體”、“構(gòu)建體”、“重組DNA構(gòu)建體”和“重組DNA片段”在本文中可互換使用，并且均為核酸片段。重組構(gòu)建體包括人造的核酸片段組合，包括且不限于天然條件下不一起存在的調(diào)控序列和編碼序列。例如，重組DNA構(gòu)建體可包括源于不同來源的調(diào)控序列和編碼序列，或者包括源于同一來源并以不同于天然存在的方式排列的調(diào)控序列和編碼序列。此類構(gòu)建體可獨自使用或與載體組合使用。如果使用載體，則載體的選擇取決于用以轉(zhuǎn)化宿主細胞的方法，該宿主細胞是本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知的。例如可以使用質(zhì)粒載體。技術(shù)人員 熟知為了成功地轉(zhuǎn)化、篩選和繁殖包括本發(fā)明實施方案的任何分離的核酸片段的宿主細胞，必須存在于載體上的遺傳因子。為獲得表現(xiàn)出所期望表達水平和模式的多核苷酸或抗性基因座的品系而進行的篩選，可通過擴增、DNA的Southern印跡分析、mRNA表達的Northern印跡分析、蛋白質(zhì)表達的免疫印跡分析、表型分析等等完成。術(shù)語“重組DNA構(gòu)建體”是指從獲得自不同來源的核酸片段組裝而成的DNA構(gòu)建體。所述核酸片段的類型和來源可以是大為不同的。在一些實施方案中，進一步提供了表達盒，所述表達盒包含可操作地連接至所述實施方案的異源核苷酸序列的啟動子。所述實施方案的表達盒用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)化的植株、植株細胞和微生物，以及用于本文所公開的引起植株病原真菌抗性的方法的實施。所述表達盒將包括可操作地連接至本發(fā)明的實施方案的多核苷酸的5'和3調(diào)控序列?！翱刹僮鞯剡B接”旨在表示兩個或更多個元件之間的功能性連接?！罢{(diào)控序列”指位于編碼序列的上游(5，非編碼序列)、中間或下游(3’非編碼序列)，并且可以影響相關(guān)編碼序列的轉(zhuǎn)錄、RNA加工、穩(wěn)定性或者翻譯的核苷酸。調(diào)控序列可包括且不限于啟動子、翻譯前導(dǎo)序列、內(nèi)含子和多腺苷酸化識別序列。例如，受關(guān)注的多核苷酸和調(diào)控序列(例如一個啟動子)之間的可操作的連接，為允許該受關(guān)注的多核苷酸的表達的功能性連接?？刹僮鞯剡B接的元件可以是連續(xù)的或不連續(xù)的。當(dāng)用于指兩個蛋白質(zhì)編碼區(qū)的連接時，“可操作地連接”意指所述編碼區(qū)處于同一閱讀框。所述盒可附加地包含將被轉(zhuǎn)化到生物體中的至少一個附加基因。作為另外一種選擇，能通過多個表達盒提供附加基因。這樣的表達框具有多個限制性位點和/或重組位點，用以將編碼抗病原體的多肽的多核苷酸插入至使其處于所述調(diào)控區(qū)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控之下的位置。所述表達盒可附加地包含選擇性標(biāo)記基因。所述表達框?qū)⒃?' -3'的轉(zhuǎn)錄方向上包括一個轉(zhuǎn)錄起始區(qū)(即，啟動子)、翻譯起始區(qū)、所述實施方案的多核苷酸、一個翻譯終止區(qū)、以及任選地，一個在宿主生物中有功能的轉(zhuǎn)錄終止區(qū)。所述調(diào)控區(qū)(即，啟動子、轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)和翻譯終止區(qū))和/或所述實施方案的多核苷酸對宿主細胞而言或者對彼此而言可以是天然的/類似的。作為另外一種選擇，所述調(diào)控區(qū)和/或所述實施方案的多核苷酸對宿主細胞而言或者對彼此而言可以是異源的。本文在序列方面所用的“異源”是指，源自外來物種的序列，或者，如果源自相同物種，則為通過蓄意的人為干預(yù)而從其天然形式在組成和/或基因組基因座方面受到充分修飾的序列。例如，可操作地連接至異源多核苷酸的一個啟動子所來自的物種，不同于所述多核苷酸所來源自的物種，或者，如果二者來自相同的/類似的物種，則二者之一或二者均為從其原始形式和/或基因組基因座經(jīng)過充分修飾的，或者所述啟動子并非針對可操作地連接的多核苷酸的天然啟動子。任選地包括的終止區(qū)就轉(zhuǎn)錄起始區(qū)而言可以是天然的、就受關(guān)注的可操作地連接的多核苷酸而言可以是天然的、就植株宿主而言可以是天然的，或者就啟動子、受關(guān)注的所述多核苷酸、宿主或者它們的任意組合而言，可以是源自其他來源的(即，外來的或異源的)。使用方便的終止區(qū)得自根癌農(nóng)桿菌(A. tumefaciens)的Ti質(zhì)粒，例如真蛸堿合酶和胭脂喊合酶終止區(qū)。也參見Guerineau等人(1991)Mol. Gen. Genet. 262 141-144 ；Proudfoot (1991) Cell 64 :671-674 ;Sanfacon 等人(1991)Genes Dev. 5 :141-149 ;Mogen等人(1990)Plant Cell 2 :1261-1272 ;Munroe 等人(1990)Gene 91 :151-158 ;Ballas 等人(1989)Nucleic AcidsRes. 17 :7891-7903 ;以及 Joshi 等人(1987)Nucleic AcidsRes. 15 9627-9639。在特定實施方案中，使用了馬鈴薯蛋白酶抑制劑II基因(PinII)終止子。參見例如，Keil 等人(1986) Nucl. AcidsRes. 14 :5641-5650 ;以及 An 等人(1989) Plant CellI :115-122,它們的全文以引用方式并入本文。有多種啟動子可用于本發(fā)明實施方案的實施中，包括所關(guān)注的多核苷酸序列的天`然啟動子。能基于所需結(jié)果選擇啟動子。Potenza等人最近的綜述(2004) In Vitro CellDev Biol-Plant 40 :1-22中討論了范圍廣泛的植株啟動子，其以引用方式并入本文。例如，核酸可與組成型的、組織優(yōu)選的、病原體誘導(dǎo)的或者其他的啟動子相結(jié)合以在植株中表達。此類組成型啟動子包括例如，Rsyn7啟動子和在WO 99/43838和美國專利6，072，050中公開的其他組成型啟動子的核心啟動子J^LCaMV 35S啟動子(Odell等人(1985)Nature313 =810-812);稻肌動蛋白啟動子(McElroy 等人(1990)Plant Cell 2:163-171);泛素啟動子(Christensen 等人(1989) Plant Mol. Biol. 12 :619-632 和 Christensen 等人(1992)Plant Mol. Biol. , 18 :675-689) ;pEMU(Last 等人(1991) Theor. Appl. Genet. 81 :581-588)；MAS(Velten 等人(1984)EMBO J. 3 :2723-2730) ;ALS 啟動子(美國專利 5，659，026)等。其他組成型啟動子包括例如，美國專利5，608，149 ;5，608，144 ;5，604，121 ;5，569，597 ；5，466，785 ;5，399，680 ;5，268，463 ;5，608，142 ;和 6，177，611。由誘導(dǎo)型啟動子，特別是由病原體誘導(dǎo)型啟動子表達基因有時可以是有益的。這樣的啟動子包括源自發(fā)病機理相關(guān)蛋白(PR蛋白)的那些，其是在被病原體感染后誘導(dǎo)的，所述蛋白是例如，PR蛋白質(zhì)、SAR蛋白質(zhì)、β-1，3-葡聚糖酶、殼多糖酶等。參見例如，Redolfi 等人(1983) Neth. J. Plant Pathol. 89 :245-254 ;Uknes 等人(1992) Plant Cell 4 645-656 ;以及 Van Loon (1985)PlantMol. Virol. 4 111-1160 還參見 WO 99/43819，其以引用方式并入本文。受關(guān)注的是在病原體感染處或在其附近導(dǎo)致蛋白質(zhì)局部表達的啟動子。參見例如，Marineau 等人(1987)Plant Mol. Biol. 9 :335-342 ;Matton 等人(1989)MolecularPlant-Microbe Interactions 2 :325-331 ;Somsisch 等人(1986)Proc. Natl. Acad. Sci.USA 83 :2427-2430 ；Somsisch 等人(1988)Mol. Gen. Genet. 2 :93-98 ；以及 Yang(1996)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:14972-14977。也參見 Chen 等人(1996)Plant J. 10 955-966 ;Zhang 等人(1994)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 :2507-2511 ;Warner 等人(1993)Plant J. 3 :191-201 ；Siebertz 等人(1989)Plant Cell I :961-968 ;美國專利5，750，386(線蟲類-可誘導(dǎo)的)；以及其中所引用的參考文獻。特別關(guān)注的是針對玉米PRms基因的誘導(dǎo)型啟動子,其表達是由病原體串珠鐮孢菌(Fusarium moniliforme)誘導(dǎo)的(參見例如 Cordero 等人(1992) Physiol. Mol. Plant Path. 41 189-200)。此外，在病原體發(fā)現(xiàn)經(jīng)由傷口或昆蟲損害而進入植株的入口時，傷口誘導(dǎo)型啟動子可用于本發(fā)明實施方案的構(gòu)建。這樣的傷口誘導(dǎo)型啟動子包括馬鈴薯蛋白酶抑制劑(pin II)基因(Ryan(1990)Ann. Rev. Phytopath. 28 :425-449 ;Duan 等人(1996)NatureBiotechnology 14 :494-498) ；wunl 和 wun2,美國專利 5, 428, 148 ；winl 和 win2 (Stanford等人(1989)Mol. Gen. Genet. 215 :200-208);系統(tǒng)素(systemin)(McGurl 等人(1992)Science225 :1570-1573) ;WIP1(Rohmeier 等人(1993)Plant Mol. Biol. 22 :783-792 ；Eckelkamp 等人(1993)FEBS Letters 323 :73-76) ;MPI 基因(Corderok 等人(1994)PlantJ. 6 (2) :141-150);等，其以引用方式并入本文。化學(xué)調(diào)節(jié)的啟動子可用于通過施用外來化學(xué)調(diào)節(jié)劑來調(diào)節(jié)基因在植株中的表達。根據(jù)這一目標(biāo)，啟動子可以是化學(xué)誘導(dǎo)型啟動子，其中施用化學(xué)物質(zhì)來誘導(dǎo)基因表達，或化學(xué)抑制型啟動子，其中施用化學(xué)物質(zhì)來抑制基因表達。化學(xué)誘導(dǎo)型啟動子是本領(lǐng)域已知的， 并且包括且不限于玉米Ιπ2-2啟動子，其是通過苯磺酰胺除草劑安全劑來激活的，玉米GST啟動子，其是通過用作芽前除草劑的疏水親電性化合物而激活的，以及煙草PR-Ia啟動子，其是通過水楊酸激活的。所關(guān)注的其他化學(xué)調(diào)節(jié)的啟動子包括留類化合物反應(yīng)性啟動子(參見例如，Schena 等人(1991)Proc. Natl. Acad. Sci. USA88 :10421-10425 和 McNellis 等人(1998)Plant J. 14(2) :247-257中的糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)型啟動子)，以及四環(huán)素誘導(dǎo)型和四環(huán)素抑制型啟動子(參見例如，Gatz等人(1991)Mol. Gen. Genet 227 :229_237，以及美國專利5，814，618和5，789，156)，它們以引用方式并入本文。組織優(yōu)選的啟動子可用于將本發(fā)明實施方案的多核苷酸增強的表達定位于特定植株組織內(nèi)。例如，組織優(yōu)選的啟動子可被用于在一種植株組織中表達一種多肽，其中在所述組織處疾病抗性尤其重要，所述組織例如根、莖或葉。組織優(yōu)選的啟動子包括Yamamoto等人(1997)Plant J. 12(2) :255-265 ;Kawamata 等人(1997)Plant Cell Physiol. 38(7)792-803 ；Hansen 等人(1997)Mol. Gen Genet. 254(3) :337-343 ;Russell 等人(1997)Transgenic Res. 6(2) :157-168 ;Rinehart 等人(1996)PlantPhysiol. 112(3) :1331-1341 ；Van Camp 等人(1996) Plant Physiol. 112 (2) :525-535 ;Canevascini 等人(1996) PlantPhysiol. 112(2) :513-524 ;Yamamoto 等人(1994)Plant Cell Physiol. 35(5) :773-778;Lam(1994)Results ProbI. Cell Differ. 20 :181-196 ；0rozco 等人(1993)PlantMolBiol. 23(6) :1129-1138 ；Matsuoka 等人(1993) Proc Natl. Acad. Sci. USA 90(20)9586-9590 ;以及 Guevara-Garcia 等人(1993)Plant J. 4(3) :495_505。如果需要的話，可修飾這樣的啟動子以進行弱表達。維管組織優(yōu)選的啟動子是本領(lǐng)域已知的，并且包括那些選擇性地在例如木質(zhì)部和韌皮部的組織中驅(qū)動蛋白質(zhì)表達的啟動子。維管組織優(yōu)選的啟動子包括且不限于，黑櫻桃(Prunus serotina)野黑櫻苷水解酶基因啟動子(參見例如，國際公布WO 03/006651)，以及見于美國專利申請10/109,488中的那些啟動子。莖優(yōu)選的啟動子可用于驅(qū)動本發(fā)明實施方案的多肽的表達。示例性的莖優(yōu)選的啟動子包括玉米MS8-15基因啟動子(參見例如，美國專利5，986，174和國際公布WO98/00533)，以及見于 Graham 等人(1997)PlantMol Biol33(4) :729-735 中的那些啟動子。
葉優(yōu)選的啟動子是本領(lǐng)域已知的。參見例如，Yamamoto等人(1997) PlantJ. 12(2) :255-265 ；Kwon 等人(1994)Plant Physiol. 105 :357-67 ;Yamamoto 等人(1994)Plant Cell Physiol. 35(5) :773-778 ;Gotor 等人(1993)Plant J. 3 :509-18 ；Orozco 等人(1993) Plant Mol. Biol. 23(6) :1129-1138 ;以及 Matsuoka 等人(1993) Proc. Natl. Acad.Sci. USA90(20) :9586_9590。根優(yōu)選的啟動子是已知的，并且可以選自文獻中記載的很多啟動子或者從不同相容物種中重新分離的啟動子。參見例如Hire等人(1992)PlantMol. Biol. 20(2)207-218 (大豆根特異性谷氨酸胺合酶基因);KeIIer和Baumgartner (1991)Plant Cell3(10) :1051-1061(法國菜豆的GRP I. 8基因的根特異性控制元件);Sanger等人(1990)Plant Mol. Biol. 14 (3) :433-443 (根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)的甘露氨酸合酶(MAS)基因的根特異性啟動子)；以及Miao等人(1991)Plant Cell 3(1)11-22(編碼胞質(zhì)谷氨酰胺合成酶(GS)的全長cDNA克隆，其在大豆的根和根瘤中表達)。也參見Bogusz等人(1990)Plant Cell2(7) :633_641，其中描述了兩種根特異性啟動子， 它們是從來自固氮非豆科(nonlegume)Parasponia andersonii以及相關(guān)非固氮非豆科(nonlegume)山麻黃(Trema tomentosa)的血紅蛋白基因分離的。將這些基因的啟動子與β-葡糖醛酸酶報道基因連接，并且導(dǎo)入非豆科的煙草(Nicotiana tabacum)和豆科的百脈根(Lotus corniculatus)內(nèi)，在這兩種情況下,都保持了根特異性啟動子活性。Leach和Aoyagi (1991)描述了他們對于發(fā)根農(nóng)桿菌(Agrobacterium rhizogenes)的高度表達的rolC和rolD根誘導(dǎo)基因的啟動子的分析(參見Plant Science (Limerick) 79 (I) :69-76)。他們推斷，增強子和組織特異性DNA決定子在這些啟動子中解離。Teeri等人(1989)使用與IacZ的基因融合以表明編碼章魚堿合酶的農(nóng)桿菌屬(Agrobacterium)菌T-DNA基因在根尖的表皮中具有特別活性，以及TR2'基因在完整植株中是根特異性的，并且受葉組織中的傷害的刺激，這是用來與殺蟲或殺幼蟲基因一起使用的特別期望的特征組合(參見EMBOJ. 8 (2) :343-350)。與nptll (新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶II)融合的TRl'基因表現(xiàn)出類似特征。另外的根優(yōu)選的啟動子包括WEN0D-GRP3基因啟動子(Kuster等人(1995)Plant Mol.Biol. 29(4) :759-772);以及 rolB 啟動子(Capana 等人(1994)Plant Mol. Biol. 25(4)681-691。也參見美國專利 5，837，876 ;5，750，386 ;5，633，363 ;5，459，252 ;5，401，836 ；5，110，732 ;和 5，023，179?！胺N子優(yōu)選的”啟動子包括“種子特異性的”啟動子(那些在種子發(fā)芽期間有活性的啟動子，如種子貯藏蛋白啟動子)以及“種子發(fā)芽”啟動子(那些在種子發(fā)芽期間有活性的啟動子)。參見Thompson等人(1989) BioEssays 10 :108,該文獻以引用方式并入本文。此類種子優(yōu)選的啟動子包括且不限于Ciml (細胞分裂素誘導(dǎo)的信使);cZ19Bl (玉米19kDa蛋白);miIps (肌醇-I-磷酸合成酶)(參見WO 00/11177和美國專利6，225，529 ;其以引用方式并入本文)。Y -玉米醇溶蛋白基因啟動子(Ga_a-zein)為優(yōu)選的胚乳特異性啟動子。Glob-I為優(yōu)選的胚芽特異性啟動子。就雙子葉植株而言，種子特異性的啟動子包括且不限于菜豆β -菜豆蛋白、napin、β -伴球蛋白、大豆凝集素、十字花科蛋白(cruciferin)等的啟動子。就雙子葉植株而言，種子特異性的啟動子包括且不限于玉米15kDa玉米醇溶蛋白、22kDa玉米醇溶蛋白、27kDa玉米醇溶蛋白、g_玉米醇溶蛋白、糯質(zhì)基因(waxy)、超甜基因I (shrunken I)、超甜基因2 (shrunken2)、球蛋白I等的啟動子。另參見WO 00/12733，其中公開了來自endl和end2基因的種子優(yōu)選的啟動子；它們以引用方式并入本文。在細胞宿主中促進基因表達的附加序列的修改形式是已知的。這些序列包括消除編碼偽聚腺苷酸化信號的序列、外顯子-內(nèi)含子接合位點信號的序列、轉(zhuǎn)座子樣重復(fù)序列、和其他此類對基因表達不利的特征明顯的序列。就一個給定的細胞宿主而言，可以將所述序列的G-C含量調(diào)節(jié)至平均水平，所述平均水平通過參考宿主細胞中表達的已知基因進行計算。當(dāng)可能的時候，修飾所述序列以避免經(jīng)推測可能發(fā)生的mRNA發(fā)夾二級結(jié)構(gòu)。表達盒可附加地包含5'前導(dǎo)序列。此類前導(dǎo)序列能夠促進翻譯。翻譯前導(dǎo)序列是本領(lǐng)域已知的并且包括小核糖核酸病毒前導(dǎo)序列，例如EMCV前導(dǎo)序列(腦心肌炎5'非編碼區(qū))(Elroy-Stein 等人(1989)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:6126-6130);馬鈴薯Y病毒前導(dǎo)序列，例如，TEV前導(dǎo)序列(煙草蝕紋病毒)(Gallie等人(1995) Gene 165(2)233-238)、MDMV前導(dǎo)序列(玉米矮小花葉病毒)、以及人免疫球蛋白重鏈結(jié)合蛋白(BiP)(Macejak等人(1991)Nature 353:90-94);非翻譯前導(dǎo)序列，來自苜?；ㄈ~病毒的外殼蛋白 mRNA(AMV RNA 4) (Jobling 等人(1987)Nature 325:622-625);煙草花葉病毒前導(dǎo)序列(TMV) (Gallie 等人(1989)Molecular Biology of RNA,編輯 Cech (Liss, New York),`第237-256頁);和玉米褪綠斑駁病毒前導(dǎo)序列(MCMV) (Lommel等人(1991) Virology 81 382-385)。也參見 Della-Cioppa 等人(1987)PlantPhysiol. 84 :965_968。也能利用促進翻譯的其他已知方法，例如內(nèi)含子等。在制備表達盒的過程中，可操作多個DNA片段以在正確方向上，以及，如果適當(dāng)?shù)脑?，在正確閱讀框中提供DNA序列。為了這一目的，可使用銜接子或連接子以接合DNA片段，或者使用其他操作方法提供方便的限制性位點以移除冗余DNA、移除限制性位點等。為了這一目的，可使用體外誘變、引物修復(fù)、限制性酶切、退火、再取代，例如轉(zhuǎn)換和顛換。表達盒也可包含選擇性標(biāo)記基因，用于選擇轉(zhuǎn)化過的細胞。利用選擇性標(biāo)記基因以選擇轉(zhuǎn)化過的細胞或組織。標(biāo)記基因包括編碼抗生素抗性的基因，例如那些編碼新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶II(NEO)和潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(HPT)的基因，以及賦予除草化合物抗性的基因，除草化合物如草胺磷銨、溴苯腈、咪唑啉酮類和2，4_ 二氯苯氧乙酸(2，4-D)。附加的可選擇的標(biāo)記包括表型標(biāo)記，例如半乳糖苷酶和熒光蛋白如綠色熒光蛋白(GFP)(Su 等人(2004)Biotechno IBioeng 85 :610-9 和 Fetter 等人(2004)PlantCell 16 215-28)、藍綠色熒光蛋白(CYP) (Bolte 等人(2004) J. CellScience 117 :943-54 和 Kato 等人(2002)Plant Physiol 129 :913-42)、以及黃色熒光蛋白(來自 Evrogen 的 PhiYFP ，參見Bolte等人(2004) J. CellScience 117:943-54)。關(guān)于附加的選擇性標(biāo)記，一般參見 Yarranton(1992)Curr. Opin. Biotech. 3 :506-511 ；Christopherson 等人(1992)Proc.Natl. Acad. Sci. USA 89 :6314-6318 ;Yao 等人(1992)Cell 71 :63-72 ；Reznikoff (1992)Mol. Microbiol. 6 :2419-2422 ;Barkley 等人(1980) The Operon,第 177-220 頁；Hu 等人(1987)Cell 48 :555-566 ;Brown 等人(1987)Cell49:603-612 ;Figge 等人(1988)Cell52 :713-722 ；Deuschle 等人(1989)Proc. Natl. Acad. Aci. USA 86 :5400-5404 ；Fuerst等人(1989)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 :2549-2553 ;Deuschle 等人(1990)Science
248:480-483 ；Gossen (1993)博士學(xué)位論文，University of Heidelberg ;Reines 等人(1993)Proc. Natl. Acad. Sci. USA90 :1917-1921 ；Labow 等人(1990)Mol. Cell. Biol. 10 3343-3356 ；Zambretti 等人(1992)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 :3952-3956 ;Baim 等人(1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88 :5072-5076 ;Wyborski 等人(1991) Nucleic AcdsRes. 19 :4647-4653 ；Hillenand-ffissman(1989)Topics Mol. Struc. Biol. 10 :143-162 ；Degenkolb 等人(1991)Antimicrob. Agents Chemother. 35 :1591-1595 ;Kleinschnidt等人(1988)Biochemistry 27 :1094-1104 ;Bonin(1993)博士學(xué)位論文，University ofHeidelberg ;Gossen 等人(1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA89 :5547-5551 ;01iva 等人(1992)Antimicrob. Agents Chemother. 36 :913-919 ；Hlavka 等人(1985)Handbook ofExperimental Pharmacology,第 78 卷(Springer-Verlag, Berlin) ；Gill 等人(1988)Nature 334:721-724。此類公開以引用方式并入本文。上文的選擇性標(biāo)記基因列表并不意味著受限制。本發(fā)明實施方案中可使用任何選擇性標(biāo)記基因。在某些實施方案中，該實施方案的核酸序列可以與受關(guān)注的多核苷酸序列的任何組合堆疊以產(chǎn)生具有所需表型的植株?？梢酝ㄟ^基因在DNA構(gòu)建體內(nèi)的組合，或者通過將包含所述抗性基因座的品系與包含所述組合的另一品系雜交實現(xiàn)這種堆積。例如，所述實 施方案的多核苷酸可以與該實施方案的任何其它多核苷酸或其它基因進行堆疊。生成的組合也可包括受關(guān)注的多核苷酸的多個拷貝中的任何一個。所述實施方案的多核苷酸也可與任何其它基因或基因組合發(fā)生堆疊以產(chǎn)生具有多種所期望的性狀組合的植株，包括且不限于動物飼料所需的特性，如高油基因(例如美國專利6，232，529);平衡氨基酸(例如硫素(hordothionins)(美國專利 5，990，389 ;5，885，801 ;5，885，802 ;和 5，703，409);大麥高賴氨酸(Williamson 等人(1987)Eur. J. Biochem. 165 :99-106 ;和冊 98/20122);和高甲硫氨酸蛋白(Pedersen 等人(1986) J. Biol. Chem. 261 :6279 ;Kirihara 等人(1988)Gene 71 359 JPMusumura等人(1989)Plant Mol. Biol. 12 :123));提高的消化性(例如修飾的忙藏蛋白質(zhì)(美國專利申請序列10/053，410，提交于2001年11月7日)；和硫氧還蛋白(美國專利申請序列10/005，429，提交于2001年12月3日))，上述公開以引用方式并入本文。本發(fā)明實施方案的多核苷酸也能夠與關(guān)于昆蟲、疾病或除草劑抗性的期望性狀堆積(例如，蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis)毒性蛋白(美國專利5，366，892 ；5, 747, 450 ；5，737，514 ;5723，756 ;5，593，881 ；Geiser 等人(1986)Gene 48 :109);凝集素(Van Damme等人(1994)Plant Mol. Biol. 24 :825);伏馬菌素脫毒(fumonisin detoxification)基因(美國專利公開5，792，931);無毒性和抗病性基因(Jones等人(1994) Science 266 :789 ；Martin 等人(1993) Science 262 :1432 ;Mindrinos 等人(1994) Cell 78 :1089);導(dǎo)致除草劑抗性的乙酰乳酸合酶(ALS)突變體，如S4和/或Hra突變體；谷氨酰胺合酶抑制劑，如草胺膦或basta(例如bar基因)；和草甘膦抗性(EPSPS基因、GAT基因如那些公開于美國專利申請公布US2004/0082770、W002/36782和W003/092360中的基因);和產(chǎn)品的加工或處理所期望的性狀，例如高油(例如，美國專利6，232，529);改性油(例如脂肪酸去飽和酶基因(美國專利5，952，544 ；W0 94/11516));改性淀粉(例如ADPG焦磷酸化酶(AGPase)、淀粉合酶(SS)、淀粉支鏈化酶(SBE)和淀粉去支鏈化酶(SDBE));和聚合物或生物塑料(例如，美國專利5. 602, 321 ； β -酮硫解酶、聚輕基丁酯合酶和乙酰乙酰-CoA還原酶(Schubert等人(1988) J. Bacteriol. 170 :5837-5847)，有利于表達聚羥基鏈烷酸酯(PHA))，其公開以引用方式并入本文。也可以將所述實施方案的多核苷酸與提供農(nóng)學(xué)性狀的多核苷酸組合，所述農(nóng)學(xué)性狀例如雄性不育(例如，參見美國專利5. 583，210)、秸桿強度、開花時間、或轉(zhuǎn)化技術(shù)性狀如細胞周期調(diào)節(jié)或基因打靶(例如WO 99/61619 ；W0 00/17364 ;W099/25821)，上述公開以引用方式并入本文。可通過任何方法產(chǎn)生這些堆疊的組合，包括且不限于通過任何常規(guī)方法或TopCrossk方法的雜交育種植株，或者基因轉(zhuǎn)化。如果所述特性通過遺傳轉(zhuǎn)化植株堆疊，則受關(guān)注的多核苷酸序列可在任何時間以任何順序進行組合。例如，可將包括一種或多種所需特性的轉(zhuǎn)基因植株用作靶，通過后續(xù)的轉(zhuǎn)化導(dǎo)入更多特性?？梢杂霉厕D(zhuǎn)化規(guī)程將特性與受關(guān)注的多核苷酸同時導(dǎo)入，所述多核苷酸由轉(zhuǎn)化盒的任何組合提供。例如，加入將導(dǎo)入兩個序列，可將兩個序列包含在分離的轉(zhuǎn)化盒中(反式)或包含在相同轉(zhuǎn)化盒中(順式)?？赏ㄟ^相同啟動子或不同啟動子促進序列表達。在某些情況下，可能期望導(dǎo)入將抑制受關(guān)注的多核苷酸表達的轉(zhuǎn)化盒。這可以與其它抑制盒或過表達盒的任何組合組合使用以在植株中生成所需特性組合。本發(fā)明實施方案的方法可以涉及但不限于將多肽或多核苷酸引入植株。“引入”旨在表示使所述多核苷酸出現(xiàn)在所述植株中。在一些實施方案中，多核苷酸將以使所述序列能夠進入植株的細胞內(nèi)部的方式存在，包括其向植株基因組可能的插入。所述實施方案的方法不依賴于將序列導(dǎo)入植株的特定方法，只要使多核苷酸進入植株的至少一個細胞的內(nèi)`部即可。用于將多核苷酸導(dǎo)入植株的方法是本領(lǐng)域已知的，包括且不限于穩(wěn)定轉(zhuǎn)化方法、瞬時轉(zhuǎn)化方法和病毒介導(dǎo)的方法。“轉(zhuǎn)化”是指將核酸片段轉(zhuǎn)入宿主生物的基因組中，導(dǎo)致基因穩(wěn)定遺傳。含有轉(zhuǎn)化核酸片段的宿主生物被稱為“轉(zhuǎn)基因”生物體?！八拗骷毎敝钢亟MDNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化至其中的細胞，可包括酵母細胞、細菌細胞和植株細胞。植株轉(zhuǎn)化方法的實例包括農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化(De Blaere等人，1987，Meth. 143 :277)和微粒加速的或者“基因槍”轉(zhuǎn)化技術(shù)(Klein等人，1987，Nature (London) 327 :70-73 ;美國專利 4，945，050)，等等?！胺€(wěn)定轉(zhuǎn)化”旨在表示將核苷酸構(gòu)建體導(dǎo)入植株并整合進植株基因組中，并且能夠由其后代繼承。“瞬時轉(zhuǎn)化”或“瞬時表達”旨在表示多核苷酸被引入植株并且不整合進該植株的基因組中或者多肽被引入植株中。轉(zhuǎn)化規(guī)程以及用于將多肽或多核苷酸序列導(dǎo)入植株內(nèi)的規(guī)程可以根據(jù)被作為轉(zhuǎn)化目標(biāo)的植株或植株細胞的類型，例如單子葉植株或雙子葉植株而改變。將多肽和多核苷酸導(dǎo)入植株細胞的合適方法包括顯微注射(Crossway等人(1986)Biotechniques 4 320-334)、電穿孔(Riggs 等人(1986)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83 :5602-5606)、農(nóng)桿菌屬(Agrobacterium-)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化(美國專利5，563，055和5，981，840)、直接的基因轉(zhuǎn)移(Paszkowski 等人(1984)EMBO J. 3 :2717-2722)、以及微粒加速(參見例如 Sanford等人，美國專利 4，945，050 ;5，879，918 ;5，886，244 ；和 5，932，782 ；Tomes 等人(1995)Plant Cell, Tissue, and Organ Culture !Fundamental Methods, 編輯 Gamborg 和Phillips(Springer-Verlag, Berlin) ；McCabe 等人(1988)Biotechnology 6:923-926)；以及 Lecltransformation (WO 00/28058)。也參見 Weissinger 等人(1988) Ann. Rev.Genet. 22 :421-477 ；Sanford 等人(1987)Particulate Science andTechnology 5:27-37 (洋蔥);Christou 等人(1988) Plant Physiol. 87 :671-674 (大豆)；McCabe 等人(1988) Bio/Technology 6 :923-926 (大豆);Finer 和McMullen (1991) In Vitro Cell Dev.Biol. 27P :175-182 (大豆)；Singh 等人(1998) Theor. Appl. Genet. 96 :319-324 (大豆)；Datta 等人(1990) Biotechnology8 :736-740 (水稻)；Klein 等人(1988) Proc. Natl. Acad.Sci. USA 85 :4305-4309(玉米)；Klein 等人(1988)Biotechnology 6 :559-563 (玉米)；美國專利 5，240，855 ；5, 322，783 和 5，324，646 ；Klein 等人(1988) Plant Physiol. 91 440-444 (玉米)；Fromm 等人(1990) Biotechnology 8 :833-839(玉米)；Hooykaas_VanSlogteren 等人(1984) Nature (London) 311 :763-764 ;美國專利 5，736，369 (谷物)；Bytebier 等人(1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 :5345-5349 (百合科)；De Wet 等人(1985) The Experimental Manipulation of OvuleTissues,編輯 Chapman 等人(Longman,New York),第 197-209 頁(花粉)；Kaeppler 等人(1990) Plant Cell Reports 9 :415-418和 Kaeppler 等人(1992) Theor. Appl. Genet. 84 :560-566 (頸須介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化);D' Halluin等人(1992)Plant Cell 4 :1495-1505(電穿孔)；Li 等人(1993)Plant CellReports 12 250-255 以及 Christou 和 Ford(1995)Annals of Botany 75 :407-413(水稻);0sjoda等人(1996)Nature Biotechnology 14 :745-750(經(jīng)由根癌農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)的玉米)；所有這些文獻以引用方式并入本文。用于在植株基因組的特定位置定向插入多核苷酸的方法是本領(lǐng)域中已知的。在一個實施方案中，多核苷酸在所期望的基因組位置的插入利用位點特異性重組系統(tǒng)實現(xiàn)。參 見例如 W099/25821、W099/25854、W099/25840、W099/25855 和 W099/25853，它們均以引用方式并入本文。簡而言之，所述實施方案的多核苷酸被包含在轉(zhuǎn)移盒中，兩側(cè)與兩個不同的重組位點相連。所述轉(zhuǎn)移盒被導(dǎo)入植株中，所述植株的基因組中已穩(wěn)定地整合了兩側(cè)與兩個不同的重組位點相連的靶位點，所述重組位點對應(yīng)于所述轉(zhuǎn)移盒中的位點。提供了適當(dāng)?shù)闹亟M酶，并且所述轉(zhuǎn)移盒被整合至所述靶位點。受關(guān)注的多核苷酸從而被整合至所述植株基因組的特定染色體位置。已經(jīng)被轉(zhuǎn)化的細胞可根據(jù)常規(guī)方法生長為植株。參見例如McCormick等人(1986)Plant Cell Reports5 :81_84。然后可培養(yǎng)這些植株,并用相同的或不同的轉(zhuǎn)化過的植株進行授粉，具有所期望表型特征的組成型表達的所得到的子代被鑒定?？梢陨L兩代或多代以保證所希望的表型特征的表達穩(wěn)定地保持和遺傳，然后收獲種子以保證所希望的表型特征的表達已經(jīng)實現(xiàn)。以這種方式，所述實施方案提供了轉(zhuǎn)化的種子(也稱為“轉(zhuǎn)基因種子”)，所述轉(zhuǎn)化的種子具有穩(wěn)定地整合至其基因組中的所述實施方案的核苷酸構(gòu)建體，例如所述實施方案的表達盒。如本文所用，術(shù)語“植株”可以是整個植株、其任意的部分、或者來源于植株的細胞或組織培養(yǎng)物。因此，術(shù)語“植株”可指代以下任何一種材料整個植株、植株的部分或器官(包括但不限于胚芽、花粉、胚珠、種子、葉、花、枝、果實、果仁、穗、穗軸、殼、莖、根、根尖、花粉囊等等)、植株組織、植株細胞、植株原生質(zhì)體、可從其再生出玉米植株的植株細胞組織培養(yǎng)物、植株愈傷組織、植株叢和植株種子。植株細胞是植株的細胞，其或者直接取自種子或植株，或者源自取自植株的細胞的培養(yǎng)物。谷物旨在表示商業(yè)化種植者出于栽培或繁殖物種之外的目的生產(chǎn)的成熟種子。再生植株的子代、變體和突變體也包括在本發(fā)明實施方案的范圍內(nèi)，前提條件是這些部分包含導(dǎo)入的多核苷酸。本發(fā)明的實施方案可被用于賦予或增強植株病原真菌抗性，或者使植株免受病原真菌攻擊傷害，所述植株尤其是玉米(Zea mays)。其將保護植株的不同部分免受病原體攻擊傷害，所述部分包括且不限于莖、穗、葉、根和雄穗。
在詳述本發(fā)明之前，應(yīng)當(dāng)了解本發(fā)明不受特定實施方案的限制。也應(yīng)當(dāng)了解本文所用的術(shù)語僅是為了描述特定實施方案，而不旨在進行限制。當(dāng)在本文和所附權(quán)利要求中使用時，除非內(nèi)容清楚地表明，單數(shù)和單數(shù)形式的術(shù)語包括復(fù)數(shù)指代。因此，例如術(shù)語“植株”也包括多個植株；取決于上下文，使用的術(shù)語“植株”也可包括該植株遺傳相似或相同的子代；使用的術(shù)語“核酸”任選地包括該核酸分子的多個拷貝；
實施例提供以下實施例以示出所述權(quán)利要求，但本發(fā)明不受以下實施例的限制。應(yīng)當(dāng)理解本文所述的實施例和實施方案僅用于例證性的目的，并且本領(lǐng)域的技術(shù)人員將認識到在不脫離本發(fā)明精神或所附權(quán)利要求范圍的情況下可改變多種試劑或參數(shù)。實施例I玉米大斑病感染的基因分型 能夠以I至9分標(biāo)度就玉米大斑病(NLB)對玉米植株進行評估，其中1_3的分數(shù)表示“易感的”，4-6的分數(shù)表示“中等的”，7-9的分數(shù)表示“抗性的”。圖3中圖示的評分能夠被用作指南，重點是穗上方的病變。通過檢查雪茄狀或船形的側(cè)面平滑的病變和/或通過將樣品送至診斷實驗室以確認病原體的身份，能夠?qū)⒉∽兇_認為由玉米大斑病感染導(dǎo)致。在開花后二至四周，能夠從一些已知的易感品系獲得分數(shù)，然后與它們歷史記錄的評分比較。如果已知的易感品系被評分為比它們歷史記錄的分數(shù)高至少兩分，則將測試組中的品系的評分延遲，從而允許病害發(fā)展至感染的標(biāo)準(zhǔn)狀態(tài)。評分期僅能被延長至植株衰老之前。因此，如果在4-5周后分數(shù)依然過高，則病害的壓力不足以進行有效的評分。如果在從開花后2-4周直到植株衰老之前期間，來自已知的易感品系的分數(shù)確與它們的歷史記錄分數(shù)關(guān)聯(lián)，能夠用圖3中的評分圖表作為指南試驗性地對測試的品系評分。實施例2來自PH26N (HtBC)的8號染色體NLB抗件QTL的精細作圖群體發(fā)育和初始的QTL作圖非適應(yīng)性的熱帶的專有玉米近交系PH26N被鑒定為玉米大斑病(NLB)抗性的來源。為了有利于與玉米大斑病抗性關(guān)聯(lián)的一種或多種QTL的檢測，以PH26N作為供體和以PH581作為輪回親本，構(gòu)建了 228個品系的雙單倍體BC3群體。如實施例I中所述進行了病害篩選，鑒定了對NLB小種O和I以及可能的其他的具有高水平抗性的多個品系。選擇了一種表現(xiàn)出NLB抗性的雙單倍體品系。將該品系再次與PH581回交，所得到的子代自交。然后就NLB抗性對所得到的730個品系的BC4S1群體進行基因分型。本文中被稱為HtBC的QTL被作圖至染色體8上的區(qū)段5中的SNP標(biāo)記PHM13395-27 (129. 7cM)和 PHM4677-11 (131. 9cM)之間 2. 2cM 的區(qū)間(SNP 標(biāo)記的信息參見表4)。從上述BC4S1群體，對129株植株進行了選擇、基因分型，然后通過子代測試就NLB抗性進行了表型分型。這導(dǎo)致了對以標(biāo)記PHM13395-27(129. 7cM)和PHM3418-12 (130. 6cM)限定的O. 9cM區(qū)間內(nèi)的13個重組體的鑒定(SNP標(biāo)記的信息參見表4)。在獲得附加的重組體以有利于精細作圖的嘗試中，所述QTL區(qū)間雜合的118個來自所述BC4S1群體的品系被選擇并自交，并且種植了子代種子。從BC4S2群體，種植了 2477株植株并進行了基因分型，372株植株被選擇并自交。來自所選擇的品系的種子被成排種植；對植株進行了基因分型；并就NLB抗性對各排進行了評分。結(jié)果是在相同的O. 9cM QTL區(qū)間內(nèi)鑒定了 73個附加的重組體?？傆嬭b定了待用于附加的作圖的86個重組品系。CAPS標(biāo)記的開發(fā)和精細作圖使用上述86個重組品系和一組新的標(biāo)記進一步限定了 HtBC QTL區(qū)間。由于缺少來自PH26N或PH581的基因組序列，B73被用作參考基因組以開發(fā)新的標(biāo)記。從測序的該區(qū)域內(nèi)的B73BAC和BAC末端鑒定了所述QTL區(qū)間內(nèi)的低拷貝的和基因的序列，其得自玉米基因組測序計劃，并被用作酶切擴增多態(tài)性位點(CAPS)標(biāo)記開發(fā)的靶標(biāo)。使用 Primer3(Rozen 和 Skaletsky(2000)Primer3 on the Wffff for general users andfor biologistprogrammers. , Krawetz S, Misener S(編輯)Bioinformatics MethodsandProtocols Methods in Molecular Biology. Humana Press, Totowa, NJ,第 365-386頁)從靶基因座設(shè)計了標(biāo)記引物，并使用Gentra PUREGENE. RTM方法(Qiagen)從親本品系PH26N和PH581提取了 DNA樣品。使用下文的設(shè)定和參數(shù)(表IA和1B)獲得了 PCR產(chǎn)物，并使用標(biāo)準(zhǔn)的 ExoSAP-IT. RTM 規(guī)程(USB-Cleveland，OH，USA)進行了純化。在 ABI 3730 毛`細管測序儀(Applied Biosystems)上使用 ABI BigDye V3. ITerminator 試劑進行了 DNA測序。在Sequencher (GeneCodes)中比對了所得到的序列，并就產(chǎn)生易于辨識的CAPS標(biāo)記的來源于SNP或插入/缺失(INDEL)的限制性位點多態(tài)性進行了分析。來自重組品系的DNA樣品在PCR反應(yīng)中被用作模板，PCR產(chǎn)物被用于CAPS標(biāo)記測試(表2)使用標(biāo)準(zhǔn)的凝膠電泳，以溴化乙錠染色，對所得到的多態(tài)性片段進行了測定?？傆嬮_發(fā)了十四個能夠區(qū)分PH581來源的基因型與PH26N來源的基因型的新的CAPS標(biāo)記(表3)。表IA PCR 設(shè)定
反應(yīng)混合物
樣品DNA2ul
Hot StarTaq Master Mix ( Qiagen )5ulddH20Iul
正向引物(IOuM).5ul
反向引物(IOuM ).5ul
IOul總體積表IB PCR 參數(shù)
步驟溫度時間循環(huán)數(shù)
預(yù)變性95C15分鐘 IX
變性95C30秒
退火55C或60C* 60秒
延伸72CI分鐘40X
最終延伸 72C10分鐘 IX表2 CAPS fair3,測試PCR產(chǎn)物9ul
限制性酶Iul
緩沖液1.5ul
ddH203.5ul
15ul總體積
權(quán)利要求
1.選擇具有增強的玉米大斑病抗性的玉米植株的方法，所述方法包括 a.在所述玉米植株中檢測與單倍型連鎖并關(guān)聯(lián)的第一標(biāo)記等位基因，所述單倍型選自 1.在NLB17_A處的PH26N單倍型， ii在NLB17_E處的PH26N單倍型， iii.在NLB17_3處的PH26N單倍型， iv.在NLB18_A處的PH26N單倍型， V.在NLB18_E處的PH26N單倍型， vi.在NLB18_A處的PH99N單倍型，或 vii.在NLB18_E處的PH99N單倍型；以及 b.選擇具有所述第一標(biāo)記等位基因的所述玉米植株。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其中所述第一標(biāo)記等位基因以20cM的距離與所述單倍型連鎖。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其中所述第一標(biāo)記等位基因以IcM的距離與所述單倍型連鎖。
4.選擇具有增強的玉米大斑病抗性的玉米植株的方法，所述方法包括 a.在所述玉米植株中檢測單倍型，所述單倍型選自 i.在NLB17_A處的PH26N單倍型， ii.在NLB17_E處的PH26N單倍型， iii.在NLB17_3處的PH26N單倍型， iv.在NLB18_A處的PH26N單倍型， V.在NLB18_E處的PH26N單倍型， vi.在NLB18_A處的PH99N單倍型，或 vii.在NLB18_E處的PH99N單倍型；以及 b.選擇具有所述單倍型的所述玉米植株。
5.鑒定表現(xiàn)出增強的玉米大斑病抗性的玉米植株的方法，所述方法包括在所述玉米植株的種質(zhì)中檢測標(biāo)記基因座的等位基因，其中 a.所述標(biāo)記基因座是PHM2798、b0302Hl、b0611N13、2717_3、2717_4、108Π6_2、31004、pco642297_3、bl09. m6、PHM18979、b0507L21、2_2、156K16、b0318il3、PHM4757、PHM13395-27、PHM4677-11、PHM3418-12、PHM15992-3、NLB5A、NLB3A、PHM4582、9gl3_3、K、6_7、6_8、N、R、S、U、PHM4757、PHM2817-26、PHM7446-6、PHM13395-16、NLB17_A、NLB17_E、NLB17_3、NLB18_A、或 NLB18_E ;并且 b.所述等位基因與增強的玉米大斑病抗性關(guān)聯(lián)。
6.鑒定表現(xiàn)出增強的玉米大斑病抗性的玉米植株的方法，所述方法包括在所述玉米植株的種質(zhì)中檢測在一個或多個標(biāo)記基因座處包含等位基因的單倍型，其中 a.所述一個或多個標(biāo)記基因座位于染色體區(qū)間內(nèi)，所述染色體區(qū)間包含并且兩側(cè)為 i.標(biāo)記PHM4582和R;或 ii.6_8和R ;并且 b.所述單倍型與增強的玉米大斑病抗性關(guān)聯(lián)。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中所述單倍型是在NLB17_A處的PH26N單倍型，在NLB17_E處的PH26N單倍型，在NLB17_3處的PH26N單倍型，在NLB18_A處的PH26N單倍型，在NLB18_E處的PH26N單倍型，在NLB18_A處的PH99N單倍型，或在NLB18_E處的PH99N單倍型。
8.選擇表現(xiàn)出增強的玉米大斑病抗性的玉米植株的方法，所述方法包括 a.獲得第一玉米植株，所述第一玉米植株在其基因組內(nèi)包含 i.在NLB17_A處的PH26N單倍型， ii.在NLB17_E處的PH26N單倍型， iii.在NLB17_3處的PH26N單倍型， iv.在NLB18_A處的PH26N單倍型， V.在NLB18_E處的PH26N單倍型， vi.在NLB18_A處的PH99N單倍型，或 vii.在NLB18_E處的PH99N單倍型； b.將所述第一玉米植株與第二玉米植株雜交； c.針對所述等位基因評估子代植株；以及 d.選擇具有所述等位基因的子代植株。
9.通過權(quán)利要求5-7的方法中的任一種鑒定的玉米植株。
10.通過權(quán)利要求1-4和8的方法中的任一種選擇的玉米植株。
全文摘要
本發(fā)明涉及鑒定和選擇具有增強的玉米大斑病抗性的玉米植株的方法和組合物。通過本發(fā)明的方法產(chǎn)生的玉米植株也是本發(fā)明的特征。
文檔編號C12Q1/68GK102958349SQ201180030980
公開日2013年3月6日 申請日期2011年6月24日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月25日
發(fā)明者B.李, W.A.威爾遜 申請人:納幕爾杜邦公司