專利名稱：無毛nod scid小鼠的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本公開內(nèi)容概括而言涉及生物醫(yī)學(xué)研究。更具體地，本公開內(nèi)容涉及具有用于生物醫(yī)學(xué)研究的遺傳優(yōu)勢(shì)的小鼠。 背景和簡(jiǎn)述
在小鼠和大鼠中有數(shù)以百計(jì)的病理學(xué)突變體，其中的許多是為了生物醫(yī)學(xué)研究的目的。突變小鼠通常用于專門的研究和開發(fā)項(xiàng)目。突變小鼠可用遠(yuǎn)交或近交遺傳背景維持，其性質(zhì)賦予遺傳優(yōu)勢(shì)或劣勢(shì)。例如,遠(yuǎn)交HsdCpb:NMRI背景下的無胸腺裸基因產(chǎn)生相對(duì)強(qiáng)壯的動(dòng)物，而在具有BALB/cOlaHsd背景下的小鼠中相同突變產(chǎn)生不太強(qiáng)壯的動(dòng)物。Prkdcscid為編碼DNA活化蛋白激酶(Prkdc)催化亞基的基因的突變，導(dǎo)致重度聯(lián)合免疫缺陷(scid)(綜述見Bosma和Carroll，1991)。其為常染色體隱性突變，由于產(chǎn)生B和T細(xì)胞受體所必需的可變、多樣和連接的(VDJ)重組酶系統(tǒng)缺陷使B細(xì)胞和T細(xì)胞祖細(xì)胞分化中斷。Prkdc突變的小鼠缺乏Thy-I陽性樹突表皮細(xì)胞。與裸鼠不同的是，
突變小鼠具有胸腺和淋巴結(jié)。非肥胖糖尿病(NOD)小鼠為I型糖尿病動(dòng)物模型，其顯示對(duì)自身免疫性T細(xì)胞介導(dǎo)的胰島素依賴性糖尿病(IDDM)自發(fā)發(fā)生的易感性。NOD品系和相關(guān)品系由Makino及其同事在日本Aburahi的Shionogi研究實(shí)驗(yàn)室開發(fā)，并且在1980年首次報(bào)道(Makino等，1980)。此外，NOD品系通常特征在于自然殺傷(NK)細(xì)胞功能缺陷、骨髓發(fā)育和功能以及抗原呈遞細(xì)胞(APC)分化和功能缺陷、抑制溶血補(bǔ)體的經(jīng)典和替代途徑的C5缺陷(Greiner等，1998)。攜帶/突變的小鼠品系雖然顯示B和T細(xì)胞功能缺乏，但表現(xiàn)出正常水平的NK細(xì)胞、溶血補(bǔ)體和骨髓功能。此外，隨小鼠變老各種背景品系的突變體產(chǎn)生低水平的免疫球蛋白和功能性T細(xì)胞，這一現(xiàn)象被稱為“滲漏(leakiness)”。這些先天免疫性質(zhì)對(duì)某些研究應(yīng)用，特別是人腫瘤細(xì)胞系的移入是不利的。Prkdcscid突變已經(jīng)由C. B-17背景轉(zhuǎn)移至糖尿病易感的非肥胖性糖尿病(NOD)背景，被稱為NOD scid.與通常的NOD小鼠不同的是，自身免疫性糖尿病并非由于T細(xì)胞功能缺乏而發(fā)生。NOD scid小鼠的特征進(jìn)一步在于NK細(xì)胞功能缺陷、巨噬細(xì)胞缺陷和可檢測(cè)的溶血補(bǔ)體缺乏(Greiner等，1998)。此外，與多種遺傳背景下的其它scid小鼠相比，由VDJ重組酶活性的不完全阻斷(其導(dǎo)致殘留B和T細(xì)胞活性)引起的純合scid小鼠的“滲漏”表型在本模型中被抑制。這些特征對(duì)涉及移植細(xì)胞的長(zhǎng)期生長(zhǎng)的研究是有利的。例如，人細(xì)胞系例如PC-3、DU145以及⑶-34陽性干細(xì)胞可在NOD scid小鼠中有效地長(zhǎng)期生長(zhǎng)，但在NK細(xì)胞功能、巨噬細(xì)胞和循環(huán)補(bǔ)體(其可影響腫瘤生長(zhǎng)或人干細(xì)胞移入)正常的其它scid小鼠中不能。NOD scid小鼠的免疫概況使其可用于腫瘤學(xué)、免疫學(xué)、血液學(xué)、HIV病理學(xué)和其它領(lǐng)域的生物醫(yī)學(xué)研究。盡管適合多數(shù)應(yīng)用，但NOD scid小鼠顯示的一些特征可對(duì)某些研究目的不利。例如，NOD scid小鼠具有白化毛的完全皮毛，因此在接種細(xì)胞前須將毛刮去，隨后的腫瘤顯示和成像比無毛模型困難。此外，甚至在刮去有 毛小鼠的毛后，也殘留毛囊，這可產(chǎn)生自身熒光，干擾使用生物發(fā)光和熒光報(bào)告物的成像研究。與裸鼠不同，無毛純合突變體缺乏毛囊(Lyon等，1996)，因此消除了其它異種移植模型中出現(xiàn)的毛囊自身熒光。本文描述了 NOD SCid小鼠的改進(jìn)，其如下進(jìn)行JfNOD scid小鼠與攜帶無毛基因(Nr)突變的小鼠雜交并與NOD scid遺傳背景回交得到無毛NOD scid小鼠品系。本文公開的無毛NOD scid小鼠對(duì)異種移植、自發(fā)性腫瘤、癌細(xì)胞腫瘤發(fā)生、腫瘤血管發(fā)生、腫瘤轉(zhuǎn)移潛能、腫瘤抑制治療、致癌調(diào)控、腫瘤成像和人干細(xì)胞移入的研究尤其有利?？紤]下述多個(gè)實(shí)施方案
I)非肥胖糖尿病(NOD)背景下具有B細(xì)胞、T細(xì)胞、NK細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和補(bǔ)體缺陷的無毛、免疫缺陷小鼠。2)條款I(lǐng)的小鼠，其中所述小鼠為等位基因純合的。3)條款2的小鼠,其中所述/ 士/c等位基因?yàn)?Prkdccld) 04)條款1-3中任一項(xiàng)的小鼠，其中所述小鼠為I等位基因純合的。5)條款4的小鼠，其中所述汝等位基因?yàn)锳r (Jirhr)06)條款1-5中任一項(xiàng)的小鼠，其中所述非肥胖糖尿病背景為NOD. QMl-Prkdcscid。7)條款1-5中任一項(xiàng)的小鼠，其中非肥胖糖尿病背景為NOD. Cmi-Prkdcscid/NCrHsd08)條款1-7中任一項(xiàng)的無毛小鼠，進(jìn)一步具有樹突細(xì)胞缺陷，其中所述樹突細(xì)胞缺陷為與相同背景的非無毛免疫缺陷小鼠相比樹突細(xì)胞的數(shù)目減少。9)生產(chǎn)非肥胖糖尿病(NOD)背景下無毛、免疫缺陷小鼠的方法，所述方法包括
(a)將等位基因純合的NODscid小鼠品系與/Zr等位基因純合的第二小鼠品系雜交，以產(chǎn)生I等位基因和等位基因均雜合的子代；
(b)將步驟(a)產(chǎn)生的雜合子代與NODscid小鼠互交；
(c)選擇步驟(b)中等位基因純合并具有更類似于NODscid的基因型的后代；
(d)將步驟(c)中選擇的后代與/Zr等位基因純合或雜合的小鼠雜交。10)條款9的方法,其中所述等位基因?yàn)?Prkdcscld)。11)條款9-10中任一項(xiàng)的方法，其中所述I等位基因?yàn)锳r Qlrhr)。12)條款9-11中任一項(xiàng)的方法，其中使用以下方法對(duì)步驟(a)產(chǎn)生的子代進(jìn)行基因型分析
單核苷酸多態(tài)性等位基因鑒別(discrimination)、聚合酶鏈反應(yīng)和單核苷酸多態(tài)性概況分析(profiling)。13)條款9-12中任一項(xiàng)的方法，其中步驟(a)和(b)的NOD scid小鼠為N0D.CBHtdTMcsW 小鼠。14)條款9-12中任一項(xiàng)的方法，其中步驟(a)和(b)的NOD scid小鼠為N0D.CB17-Prkdcscid/}\CrWsd-PrkcIcSCId 小鼠。
15)條款9-14中任一項(xiàng)的方法，其中步驟(a)的第二小鼠品系為MF_l_Ar小鼠。附圖簡(jiǎn)述
圖I顯示雄性和雌性NOD scid和Hr NOD scid小鼠的腸系膜淋巴結(jié)(上部)和脾(下部)的組織切片。圖2顯示⑶49b的流式細(xì)胞術(shù)(FACS)結(jié)果的點(diǎn)圖。象限中的數(shù)字為平均百分比。圖3顯示⑶Ilc的流式細(xì)胞術(shù)(FACS)結(jié)果的點(diǎn)圖。象限中的數(shù)字為平均百分比。圖4顯示⑶3e和⑶49b的流式細(xì)胞術(shù)(FACS)結(jié)果的點(diǎn)圖。象限中的數(shù)字為平均百分比。圖5顯示⑶3e和⑶49b的流式細(xì)胞術(shù)(FACS)結(jié)果的點(diǎn)圖。象限中的數(shù)字為平均百分比。圖6顯示⑶3e和⑶8 α的流式細(xì)胞術(shù)(FACS)結(jié)果的點(diǎn)圖。象限中的數(shù)字為平均百分比。圖7顯示⑶49b的流式細(xì)胞術(shù)(FACS)結(jié)果的點(diǎn)圖。象限中的數(shù)字為平均百分比。圖8顯示⑶49b的流式細(xì)胞術(shù)(FACS)結(jié)果的點(diǎn)圖。象限中的數(shù)字為平均百分比。圖9顯示從異種移植入Hr NOD scid小鼠中的人套細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞系JEK0-1的腫瘤發(fā)生。

圖10顯示從異種移植入無胸腺裸鼠中的人套細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞系JEK0-1的腫瘤發(fā) 生。圖11顯示從異種移植入無全身照射的Hr NOD scid小鼠中的人大細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞系KARPAS-299的腫瘤發(fā)生。發(fā)明詳述
盡管本發(fā)明可以有各種修飾和替代形式，但本文將詳細(xì)描述特定實(shí)施方案。然而，應(yīng)理解的是，其無意將本發(fā)明限制在所描述的特定形式，恰恰相反，意圖是涵蓋落入本發(fā)明范圍的所有修飾、等同物和替代方案。說明書全文中使用的以下術(shù)語意欲具有下列含義
如本文所使用的，短語“更類似于NOD scid”指在特定的世代中具有比同代其它小鼠更類似NOD scid品系的基因型的小鼠。其可例如，通過單核苷酸多態(tài)性分析定量。本文公開了無毛NOD scid小鼠的生產(chǎn)。無毛NOD scid小鼠對(duì)于利用異種移植、自發(fā)性腫瘤、癌細(xì)胞腫瘤發(fā)生、腫瘤血管發(fā)生、腫瘤轉(zhuǎn)移潛能、腫瘤抑制治療、致癌調(diào)控、腫瘤成像和人干細(xì)胞移入的生物醫(yī)學(xué)研究和開發(fā)實(shí)驗(yàn)尤其有利。NOD scid 小鼠
突變已經(jīng)從C.B-17背景轉(zhuǎn)移至糖尿病易感的非肥胖糖尿病(NOD)背景，被稱為NOD scid。NOD scid突變小鼠由國(guó)家癌癥研究所(National Cancer Institute),Frederick, Maryland 于 2004 從國(guó)立衛(wèi)生研究院(National Institutes of Health),Bethesda, Maryland接收。NOD scid具有影響T細(xì)胞和B細(xì)胞發(fā)育的重度聯(lián)合免疫缺陷(scid).與典型NOD小鼠不同的是，自身免疫性糖尿病不因?yàn)門細(xì)胞功能缺乏而發(fā)生。NODscid小鼠的特征進(jìn)一步在于具有NK細(xì)胞功能缺陷、巨噬細(xì)胞缺陷以及無循環(huán)補(bǔ)體。NODscid小鼠對(duì)機(jī)會(huì)致病菌易感，并且具有隨年齡增加的胸腺淋巴瘤發(fā)病率。無毛(Hr)小鼠純合的Qir/hr)小鼠具有正常的皮毛，直至約10天齡，此時(shí)開始脫毛。盡管稀疏的毛生長(zhǎng)以每月一次的間隔出現(xiàn)，但小鼠在5-6周齡時(shí)基本為無毛的。完整的毛從毛囊消失(Crew和Mirskaia，1931)。觸須重復(fù)脫落，并且隨年齡增長(zhǎng)變得更加異常。無毛基因?yàn)榧谞钕偌に貞?yīng)答基因和甲狀腺激素受體的輔阻遏物，介導(dǎo)甲狀腺激素在腦和皮膚的作用(Potter等，2001)。這些小鼠的趾甲往往長(zhǎng)而彎曲。一般而言，維持無毛小鼠不需要特殊的飼養(yǎng)程序。除了偶爾的皮膚膿腫，其對(duì)感染的易感性通常不增加。然而，無毛小鼠確實(shí)有輕度免疫缺陷，可能是由于T-輔助細(xì)胞缺陷(Reske-Kunz等，1979)。與A/>々小鼠相比,Ar/fer具有高白血病發(fā)病率(Heiniger等，1974)并伴隨免疫缺陷和受損的移植物抗宿主(GVH)反應(yīng)(L’Anson和Gasser，1973)。無毛小鼠中缺陷的免疫功能與淋巴瘤發(fā)生的關(guān)聯(lián)可由于該突變體對(duì)同源淋巴瘤細(xì)胞和純化小鼠白血病病毒(MuLV)的免疫反應(yīng)降低(Johnson和Meier，1981)。此外，已證明該突變體的脾T細(xì)胞對(duì)I區(qū)同種異體抗原的增殖反應(yīng)降低(Morrissey等，1980)。此夕卜，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在脾中Ly-I+和Ly-123+ T細(xì)胞的正常比例反轉(zhuǎn)(Reske-Kunz等，1979)。·從組織病理學(xué)上看，從約14天開始無毛小鼠毛管上部的復(fù)層上皮角化過度。杵狀毛(Hair club)形成是異常的，且內(nèi)部根鞘在毛干末端部分周圍聚結(jié)，使毛鞘下部不能隨杵狀毛上升而上升，進(jìn)而滯留在真皮。胞囊從兩個(gè)源頭發(fā)育，即角化過度的毛管上部和滯留在真皮的異常毛囊的鞘(Fraser，1946 ;Mann，1971)。Fukui等，1975描述了無毛小鼠中的腎小球變化。無毛小鼠可生育，但大多數(shù)雌性不能很好地哺乳其幼仔。最有效的繁育系統(tǒng)使用純合的突變體雄性和雜合的雌性(ILAR，1989)。NK細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和補(bǔ)體功能的存在可影響腫瘤細(xì)胞植入后的初期腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移擴(kuò)散。各種造血癌細(xì)胞系在不同動(dòng)物模型中的腫瘤生長(zhǎng)速率的比較研究顯示在B細(xì)胞、T細(xì)胞、NK細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和補(bǔ)體缺陷的模型中獲得較好的生長(zhǎng)速率，如在無毛NOD scid小鼠模型中出現(xiàn)的。此外，相對(duì)于其它原位小鼠模型，無毛NOD scid小鼠具有高轉(zhuǎn)移潛能。無毛NOD scid小鼠是異種移植和人源化研究的有用模型，并且與其它遺傳背景的scid突變體相比具有遺傳和表型優(yōu)勢(shì)。在一個(gè)實(shí)施方案中，公開了非肥胖糖尿病(NOD)背景的無毛、免疫缺陷小鼠。該無毛免疫缺陷小鼠具有B細(xì)胞、T細(xì)胞、NK細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和補(bǔ)體缺陷。此外，該無毛免疫缺陷小鼠出人意料地具有樹突細(xì)胞缺陷，其中與有毛的NOD scid小鼠相比，無毛NOD scid小鼠的樹突細(xì)胞數(shù)目減少。樹突細(xì)胞的減少導(dǎo)致更大程度的免疫缺陷，其對(duì)于涉及異種移植、自發(fā)性腫瘤、癌細(xì)胞腫瘤發(fā)生、腫瘤血管發(fā)生、腫瘤轉(zhuǎn)移潛能、腫瘤抑制治療、致癌調(diào)控、腫瘤成像和人干細(xì)胞移入的實(shí)驗(yàn)可為有利的。
實(shí)施例實(shí)施例選擇育種以生產(chǎn)無毛NOD scid小鼠
按照表I所示繁育小鼠。概括來說，其步驟如下(突變等位基因的存在用符號(hào)+表示)步驟⑴用純合的NOD scid {Prkdc +/+)小鼠繁育純合的無毛(/Zr勹小鼠。優(yōu)選/Zr小鼠為雄性，這是因?yàn)镠r雌性可顯示較差的母性特征。步驟I產(chǎn)生的Fl小鼠全部為雜合的-,Hr+/_。步驟(2):選擇NOD scid雜合雄性，將其與NOD scid Prkdc +/+純合雌性回交。N2小鼠為基因型的混合。通過PCR檢測(cè)后代中/Zr基因的存在情況，通過單核苷酸多態(tài)性等位基因鑒別檢測(cè)后代中基因的存在情況，通過單核苷酸多態(tài)性概況分析檢測(cè)后代中NOD scid遺傳背景。步驟(3):選擇具有至少80. 8% NOD scid遺傳背景并且純合(Prkdc +/+)和 雜合(Jlr +/1的雄性和雌性，相應(yīng)地用NOD scid雄性或雌性繁育它們。步驟⑷通過PCR檢測(cè)后代中汝基因的存在情況，通過單核苷酸多態(tài)性概況分析檢測(cè)后代中NOD scid遺傳背景。選擇具有至少94% NOD scid遺傳背景并且/^知/c純合(PrAdc +/+)和雜合Qir +/1的雄性和雌性，相應(yīng)地用NOD scid雄性或雌性繁育它們。步驟(5):通過PCR檢測(cè)后代中I基因的存在情況，通過單核苷酸多態(tài)性概況分析檢測(cè)后代中NOD scid遺傳背景。選擇具有至少99% NOD scid遺傳背景并且/^知/c純合 (PrAdc +/+)和雜合Qir +/1的雄性和雌性，相應(yīng)地用NOD scid雄性或雌性繁育它們。步驟(6):通過PCR檢測(cè)后代中I基因的存在情況，通過單核苷酸多態(tài)性概況分析檢測(cè)后代中NOD scid遺傳背景。選擇具有基本上100% NOD scid遺傳背景并且純合{Prkdc +/+)和雜合Qlr +勺的雄性和雌性，相應(yīng)地用NOD scid雄性或雌性繁育它們。步驟(7):繁育步驟6得到的小鼠以建立無毛NOD scid群體。Prkdc叛令(Prkdc+/+)和汝純合(Jlr +/+)的雄性可用純合(Prkdc +/+)和汝純合Qir +/+)或雜合Qir+/1的雌性繁育。表I :生產(chǎn)無毛NOD scid小鼠的繁育圖解
權(quán)利要求
1.非肥胖糖尿病(NOD)背景下的無毛、免疫缺陷小鼠，其具有B細(xì)胞、T細(xì)胞、NK細(xì)胞、巨 噬細(xì)胞和補(bǔ)體缺陷。
2.權(quán)利要求I的小鼠，其中所述小鼠為等位基因純合的。
3.權(quán)利要求2的小鼠，其中所述等位基因?yàn)閟cid(Prkdccld)。
4.權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的小鼠，其中所述小鼠為/Zr等位基因純合的。
5.權(quán)利要求4的小鼠，其中所述I等位基因?yàn)锳rQirhr).
6.權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的小鼠，其中所述非肥胖糖尿病背景為NOD.QMl-Prkdcscid。
7.權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的無毛小鼠，進(jìn)一步具有樹突細(xì)胞缺陷，其中所述樹突細(xì)胞缺陷為與相同背景而非無毛的免疫缺陷小鼠相比樹突細(xì)胞的數(shù)目減少。
8.生產(chǎn)非肥胖糖尿病(NOD)背景下的無毛、免疫缺陷小鼠的方法，所述方法包括 (a)將等位基因純合的NODscid小鼠品系與/Zr等位基因純合的第二小鼠品系雜交，以產(chǎn)生I等位基因和等位基因均雜合的子代； (b)將步驟(a)產(chǎn)生的雜合子代與NODscid小鼠互交；(c)選擇步驟(b)中等位基因純合并具有更類似于NODscid的基因型的后代； (d)將步驟(c)中選擇的后代與/Zr等位基因純合或雜合的小鼠雜交。
9.權(quán)利要求8的方法，其中所述等位基因?yàn)閟cid(Prkdcscld)。
10.權(quán)利要求8-9中任一項(xiàng)的方法，其中所述I等位基因?yàn)锳rQirhr)。
11.權(quán)利要求8-10中任一項(xiàng)的方法，其中使用選自以下的方法對(duì)步驟(a)產(chǎn)生的子代進(jìn)行基因型分析 單核苷酸多態(tài)性等位基因鑒別、聚合酶鏈反應(yīng)和單核苷酸多態(tài)性概況分析。
12.權(quán)利要求8-11中任一項(xiàng)的方法，其中步驟(a)和(b)的NODscid小鼠為N0D.CBHtdTMcsW 小鼠。
13.權(quán)利要求8-12中任一項(xiàng)的方法，其中步驟(a)的第二小鼠品系為MF-I-Ar小鼠。
全文摘要
本文公開了非肥胖糖尿病(NOD)背景下的無毛、免疫缺陷小鼠及其生產(chǎn)方法。所述小鼠為無毛的，并且具有多重免疫缺陷，包括B細(xì)胞和T細(xì)胞缺陷，以及受損的巨噬細(xì)胞和補(bǔ)體功能。所述小鼠還在免疫系統(tǒng)的自然殺傷細(xì)胞和樹突細(xì)胞中具有進(jìn)一步的缺陷。所述小鼠可用于生物醫(yī)學(xué)研究，例如涉及異種移植、自發(fā)性腫瘤、癌細(xì)胞腫瘤發(fā)生、腫瘤血管發(fā)生、腫瘤轉(zhuǎn)移潛能、腫瘤抑制治療、致癌調(diào)控和腫瘤成像的研究。
文檔編號(hào)C12N15/00GK102971420SQ201180029157
公開日2013年3月13日 申請(qǐng)日期2011年4月14日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月14日
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