專利名稱：用原核表達產(chǎn)物處理水稻根組織誘導(dǎo)其產(chǎn)生胼胝質(zhì)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用原核表達產(chǎn)物處理水稻根組織誘導(dǎo)其產(chǎn)生胼胝質(zhì)的方法，具體涉及一種用稻瘟病菌效應(yīng)蛋白基因的原核表達產(chǎn)物處理水稻根組織誘導(dǎo)其產(chǎn)生胼胝質(zhì)的方法，屬于植物保護和生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
植物與其病原菌共同進化了上百萬年，自然選擇促使植物產(chǎn)生了各種各樣的識別和抗性機制來防止和限制病原菌侵染。植物進化的同時也促使病原菌基因進化以適應(yīng)或抵抗植物防御反應(yīng)使其侵染寄主達到致病的最終目的。寄主-病原菌進化的結(jié)果使病原菌參與進化的基因多樣化，特別是編碼病原菌效應(yīng)蛋白的基因。盡管效應(yīng)蛋白被認為是對植物致病，但在一些植物品種里，效應(yīng)蛋白也能被抗性蛋白識別，引發(fā)寄主細胞程序化死亡即HR 反應(yīng)。因此，病原菌效應(yīng)蛋白具有誘導(dǎo)植物致病和防御反應(yīng)的雙重作用。稻癌病菌效應(yīng)蛋白基因PWL1、PWL2、AVR-Pita, ACEU AVRs, AVR-Pia, AVR-Pii 和 AVR-Pik/km/kp已經(jīng)被克隆鑒定，除PWLl、PWL2和ACEl外，其余效應(yīng)蛋白基因均特異性地與相應(yīng)抗性基因發(fā)生互作。在它們與水稻發(fā)生特異性非親和互作時能快速地引發(fā)寄主細胞HR 反應(yīng)。此外，對稻瘟病菌侵染早期的基因也研究得較多，諸如識別疏水信號的MPG1、PTHll 基因，進行信號傳遞的CPKA，MACK MAGB, PMKl, MST7和MSTll等基因，參與黑色素合成的 ALBl、BUFl和RSYl基因，附著胞膨壓形成的PTH2基因，侵入栓形成的PLSl、MST12，MPSl、 GASU PDEU CYPl等基因。以上涉及到的稻瘟病菌效應(yīng)蛋白基因大都是稻瘟病菌侵染過程中表達的基因，都是致病基因，也涉及引起寄主細胞HR反應(yīng)的無毒基因。而很少涉及能夠引發(fā)水稻基本防御反應(yīng)產(chǎn)生的效應(yīng)蛋白基因的報道。我們從預(yù)測的分泌蛋白基因中，發(fā)現(xiàn)了一個表達產(chǎn)物能夠在水稻葉片上引起壞死斑的基因，通過RT-PCR檢測，表明其在稻瘟病菌侵染水稻24h時的表達量達到最高，其表達量變化特征表明該基因主要在侵染前期大量表達，能夠作為稻瘟病菌侵染前期引發(fā)寄主基本防御反應(yīng)研究的候選基因。目前，研究病原菌侵染初期引發(fā)寄主基本防御反應(yīng)的方法主要涉及寄主細胞活性氧測定、基本防御反應(yīng)相關(guān)基因表達譜分析和寄主葉片胼胝質(zhì)產(chǎn)生觀察等方法。而對利用病原菌效應(yīng)蛋白基因的原核表達產(chǎn)物純化后處理水稻根組織觀察胼胝質(zhì)產(chǎn)生的方法很少見報道。而且觀察葉片產(chǎn)生胼胝質(zhì)時容易受到葉片本身自發(fā)熒光的干擾，而植物根組織本身自發(fā)熒光較葉片少，對觀察根組織產(chǎn)生胼胝質(zhì)的影響很小?，F(xiàn)在還沒有一種直接利用基因的原核表達產(chǎn)物體外檢測稻瘟病菌效應(yīng)蛋白誘導(dǎo)寄主根組織產(chǎn)生胼胝質(zhì)，以快速鑒定效應(yīng)蛋白基因是否引發(fā)寄主基本防御反應(yīng)的方法的報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)之不足，而提供一種快速、簡便、準確的用稻瘟病菌效應(yīng)蛋白基因的原核表達產(chǎn)物處理水稻根組織誘導(dǎo)其產(chǎn)生胼胝質(zhì)的方法。本發(fā)明的技術(shù)方案是保持現(xiàn)有原核表達產(chǎn)物表達純化及胼胝質(zhì)觀察方法不變，包括原核表達技術(shù)、蛋白純化技術(shù)、所用熒光顯微鏡的激發(fā)光和發(fā)射光波長范圍、苯胺藍染色方法均與常規(guī)相同，其特征是用稻瘟病菌效應(yīng)蛋白基因的原核表達產(chǎn)物，按照l.Omg/ ml 10. Omg/ml濃度處理抗病水稻品種日本晴根組織1 后苯胺藍染色，熒光顯微鏡直接觀察胼胝質(zhì)形成。本發(fā)明的有益效果在于1、方法簡便、準確、快速。2、利用純化的效應(yīng)蛋白基因的原核表達產(chǎn)物處理水稻根組織，通過熒光顯微鏡觀察根組織胼胝質(zhì)產(chǎn)生，能直接定性地獲得水稻基本防御反應(yīng)產(chǎn)生的情況。3、苯胺藍直接對水稻根進行染色，且熒光顯微鏡觀察根組織胼胝質(zhì)形成時能有效地避免較多自發(fā)熒光干擾。
具體實施方案實施例一1. Omg/ml的融合蛋白處理水稻根組織12h，苯胺藍染色后直接觀察胼胝質(zhì)形成情況。將稻瘟病菌效應(yīng)蛋白基因表達產(chǎn)物于4°C離心機離心收集菌體，用新鮮配制的緩沖液(20mM Tris-HCl, ρΗ7· 4 ；200mM NaCl ； ImM EDTA ； IOmM β -巰基乙醇)懸浮菌體。在冰水浴上進行超生破碎細胞后離心收集上清。處理是將該基因的原核表達產(chǎn)物純化后按照1. Omg/ml的濃度處理抗病水稻品種日本晴的根組織12h，苯胺藍直接染色進行胼胝質(zhì)觀察。對照是將該基因的原核表達產(chǎn)物純化后按照1. Omg/ml的濃度處理感病水稻品種麗江新團黑谷根組織12h，苯胺藍直接染色進行胼胝質(zhì)觀察。結(jié)果見表1。表1效應(yīng)蛋白基因的原核表達產(chǎn)物處理水稻品種根組織后胼胝質(zhì)觀察
類別蛋白濃度(mg/ml)根組織胼胝質(zhì)形成情況處理1. O根組織出現(xiàn)了少量胼胝質(zhì)對照1. O根組織沒有出現(xiàn)胼胝質(zhì)實施例二10. Omg/ml的融合蛋白處理水稻根組織12h，苯胺藍染色后直接觀察胼胝質(zhì)形成情況。將稻瘟病菌效應(yīng)蛋白基因表達產(chǎn)物于4°C離心機離心收集菌體，用新鮮配制的緩沖液(20mM Tris-HCl, ρΗ7· 4 ；200mM NaCl ； ImM EDTA ； IOmM β-巰基乙醇)懸浮菌體。在冰水浴上進行超生破碎細胞后離心收集上清。處理是將該基因的原核表達產(chǎn)物純化后按照 10. Omg/ml的濃度處理抗病水稻品種日本晴的根組織12h，苯胺藍直接染色進行胼胝質(zhì)觀察。對照是將該基因的原核表達產(chǎn)物純化后按照10. Omg/ml的濃度處理感病水稻品種麗江新團黑谷根組織12h，苯胺藍直接染色進行胼胝質(zhì)觀察。結(jié)果見表2。表2效應(yīng)蛋白基因的原核表達產(chǎn)物處理水稻品種根組織后胼胝質(zhì)觀察
權(quán)利要求
1. 一種用原核表達產(chǎn)物處理水稻根組織誘導(dǎo)其產(chǎn)生胼胝質(zhì)的方法，包括原核表達技術(shù)、蛋白純化技術(shù)、所用熒光顯微鏡的激發(fā)光和發(fā)射光波長范圍、苯胺藍染色方法；其特征在于用稻瘟病菌效應(yīng)蛋白基因的原核表達產(chǎn)物，按照1. Omg/ml 10. Omg/ml濃度處理抗病水稻品種日本晴根組織1 后苯胺藍染色，熒光顯微鏡直接觀察胼胝質(zhì)情況。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用稻瘟病菌效應(yīng)蛋白基因的原核表達產(chǎn)物處理水稻根組織誘導(dǎo)其產(chǎn)生胼胝質(zhì)的方法，屬于植物保護和生物技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明是在現(xiàn)有技術(shù)上的改進，包括與常規(guī)方法相同的原核表達技術(shù)、蛋白純化技術(shù)、所用熒光顯微鏡的激發(fā)光和發(fā)射光波長范圍、苯胺藍染色方法，其特征是用稻瘟病菌效應(yīng)蛋白基因的原核表達產(chǎn)物，1.0mg/ml～10.0mg/ml濃度處理抗病水稻品種日本晴根組織12h后苯胺藍染色，熒光顯微鏡直接觀察胼胝質(zhì)形成。本發(fā)明方法簡便、準確、快速；能有效地避免較多自發(fā)熒光干擾，能直接定性地獲得水稻基本防御反應(yīng)產(chǎn)生的情況。
文檔編號C12N5/04GK102559575SQ20111045832
公開日2012年7月11日 申請日期2011年12月31日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月31日
發(fā)明者劉林, 施竹鳳, 朱有勇, 李成云, 楊靜, 王凱 申請人:云南農(nóng)業(yè)大學