專利名稱：蛋白酪氨酸磷酸酶ptpn12表達(dá)純化及晶體結(jié)構(gòu)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及對蛋白酪氨酸磷酸酶PTPN12進(jìn)行基因工程改造以獲得在大腸桿菌中的高效表達(dá)、純化和結(jié)晶的方法，以及蛋白酪氨酸磷酸酶PTPN12第I位到第301位氨基酸的三維晶體結(jié)構(gòu)。
背景技術(shù)：
2011年《CELL》上發(fā)表了美國哈佛大學(xué)醫(yī)學(xué)院與哈爾濱醫(yī)科大學(xué)專家關(guān)于蛋白酪氨酸磷酸酶PTPN12為新型抑癌基因的研究結(jié)果。研究發(fā)現(xiàn)，PTPN12表達(dá)水平降低會引起正常細(xì)胞惡性生長，在PTPN12表達(dá)受到抑制時，乳腺癌的促癌基因EGFR受體家族的絡(luò)氨酸磷酸化顯著增強(qiáng)，而EGFR受體家族正是經(jīng)過一系列絡(luò)氨酸磷酸化而被激活，從而產(chǎn)生促細(xì)胞癌變效應(yīng)；PTPN12過量表達(dá)則可對惡性細(xì)胞生長有一定抑制效果。研究人員經(jīng)過進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，PTPN12在多種三陰型乳腺癌細(xì)胞系有功能缺失性基因突變。在60%的臨床三陰型乳腺癌患者標(biāo)本病理切片中，P·TPN12蛋白表達(dá)低下。這些臨床病例研究結(jié)果進(jìn)一步支持PTPN12在三陰型乳腺癌的發(fā)生進(jìn)展過程中占有重要地位。PTPN12蛋白為新型抑癌基因的最新研究成果引起了國際腫瘤界的普遍關(guān)注。PTPN12屬于蛋白酪氨酸磷酸酶家族。蛋白酪氨酸磷酸酶在人類基因組中主要由90個基因表達(dá)，分為4個家族。蛋白酪氨酸殘基的磷酸化作用對于調(diào)節(jié)生理應(yīng)答程起著重要作用，例如細(xì)胞增殖和分化、細(xì)胞遷移、免疫細(xì)胞活化和凋亡等。因此，如果細(xì)胞中的酪氨酸酸化作用失調(diào)會引起嚴(yán)重的后果，包括可能會引起體免疫、非正常代謝應(yīng)答和細(xì)胞轉(zhuǎn)化
坐寸ο蛋白酪氨酸磷酸酶PTPN12由PTPN12基因編碼，包含780個氨基酸殘基，分子量大小約為88kDa，其N端為磷酸酶結(jié)構(gòu)域，介導(dǎo)催化活性，具有高度的保守性；C端為非酶活性結(jié)構(gòu)域，富含脯氨酸、谷氨酸、絲氨酸和蘇氨酸殘基，又稱為PEST序列，主要介導(dǎo)PTPN12與底物蛋白質(zhì)的相互結(jié)合。PTPN12作為一種重要的胞內(nèi)蛋白酪氨酸磷酸酶蛋白，已經(jīng)有不少研究者對其進(jìn)行了功能上的研究。首先，PTPNl2通過與FAK，P130Cas, paxillin等底物相互作用調(diào)控細(xì)胞的粘附，遷移和細(xì)胞間的連接。其次，PTPN12負(fù)性調(diào)控淋巴細(xì)胞的活化。PTPN12在多種組織細(xì)胞中廣泛表達(dá)，如心、肺、腎、脾、胸腺以及胎盤，而在胸腺和脾中表達(dá)甚高，PTPNl2在不同組織中的表達(dá)量差異預(yù)示其應(yīng)參與免疫細(xì)胞活性調(diào)節(jié)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個方面，提供了一種將蛋白酪氨酸磷酸酶PTPN12進(jìn)行基因工程改造，以提高其在大腸桿菌中能夠得到高效表達(dá)、在常溫(攝氏37±5°C)下可以較長時間穩(wěn)定保持磷酸酶活性的蛋白的方法。本發(fā)明優(yōu)選使用大腸桿菌的原核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)(但不排除其他的表達(dá)系統(tǒng)，如在其他細(xì)菌或者其他的真核生物細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá))，對以上所述基因整合至IJ pET-28a載體中進(jìn)行表達(dá)，以HIS標(biāo)簽融合蛋白的方式進(jìn)行表達(dá)，并用于蛋白質(zhì)結(jié)晶的方法。本發(fā)明述及在大腸桿菌中高效獲得蛋白酪氨酸磷酸酶PTPN12的表達(dá)方法。
優(yōu)選地，本發(fā)明將蛋白酪氨酸磷酸酶PTPN12進(jìn)行了基因工程改造，將PTPN12全長基因進(jìn)行了截短的研究，提供了一個可以在大腸桿菌中高效表達(dá)的方法，該方法包括了氨基端約I 15位氨基酸至約301 315位氨基酸的編碼基因，更優(yōu)選包括約I位至301位
氨基酸。第二個方面，本發(fā)明提供了一種純化蛋白酪氨酸磷酸酶PTPN12的方法。將基因工程方法改造過以后的PTPN12基因連接于帶有標(biāo)簽的表達(dá)性質(zhì)粒載體中，轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)、純化。優(yōu)選地，其中所述的標(biāo)簽選自GST、Flag-tag、Myc-tag、MBP-tag> His-tag、特異性抗體；所述載體含有選擇性標(biāo)記基因。所述與特異標(biāo)簽識別的方法是通過親和層析柱進(jìn)行，所述分離純化蛋白的方法是進(jìn)一步用凝膠過濾和離子交換層析等方法分離純化PTPN12蛋白；用凝膠電泳的方法確定蛋白質(zhì)的純度。第三個方面，本發(fā)明提供了一種結(jié)晶上述得到的PTPN12蛋白的方法，所述的方法包括:將PTPN12蛋白濃縮至5-10mg/ml，在4_30攝氏度下用氣相擴(kuò)散法篩選晶體生長條件。第四個方面，本發(fā)明提供了衍射性能良好的PTPN12蛋白質(zhì)晶體。第五個方面，本發(fā)明提 供了 PTPN12蛋白的三維結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)描述了 PTPN12蛋白二級結(jié)構(gòu)組成、肽鏈走向、組織模式以及三維分子構(gòu)造。其中針對PTPN12蛋白晶體進(jìn)行X射線晶體衍射，得到上述晶體衍射數(shù)據(jù)，用所述的蛋白質(zhì)晶體的衍射數(shù)據(jù)進(jìn)一步通過結(jié)構(gòu)解析，構(gòu)建PTPN12蛋白的三維結(jié)構(gòu)。在一具體的實(shí)施方式中，提供了 PTPN12蛋白晶體三維結(jié)構(gòu)，其中PTPN12蛋白為蛋白氨基端部分(1-301個氨基酸)，其中所述的晶體三維結(jié)構(gòu)中的原子具有表一中所列的至少一部分的原子坐標(biāo)、或者任何與該坐標(biāo)中至少40%的氨基酸殘基的主鏈碳骨架原子三維坐標(biāo)的平均根方差(average root mean square deviation (RMSD))小于或等于1.7埃的結(jié)構(gòu)。優(yōu)選地，其中所述的PTPN12蛋白晶體具有C2的空間群，晶胞參數(shù)為約:a = 136埃，b = 41 埃，c = 75 埃，α = Y = 90。，β = 116。。在一個具體實(shí)施方案中，整個PTPN12的蛋白結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)出典型的α+β的結(jié)構(gòu)模式。其核心部分由8個反平行的β折疊構(gòu)成β片層，7個α螺旋圍繞在β片層的兩側(cè)。具體而言，核心β片層包括β折疊1，即包含從第91位的Ala到第94位的Ile所包含的氨基酸區(qū)段，β折疊2，即包含從第102位的Ala到第106位的Thr所包含的氨基酸區(qū)段，β折疊3，即包含從第128位的Ile到第131位的Met所包含的氨基酸區(qū)段，β折疊4，即包含從第155位的Ile到第157位的Phe所包含的氨基酸區(qū)段，β折疊5，即包含從第160位的Phe到第170位的Arg所包含的氨基酸區(qū)段，β折疊6,即包含從第173位的Tyr到第182位的Phe所包含的氨基酸區(qū)段，β折疊7，即包含從第185位的Glu到第194位的Tyr所包含的氨基酸區(qū)段，β折疊8，即包含從第227位的Ile到第230位的His所包含的氨基酸區(qū)段。分布在β片層兩側(cè)的α螺旋包括α螺旋1，即包含從第3位的Gln到第18位的Lys所包含的氨基酸區(qū)段，α螺旋2，即包含從第27位的Aln到第43位的Arg所包含的氨基酸區(qū)段，α螺旋4，即包含從第212位的Met到第219位的Tyr所包含的氨基酸區(qū)段，α螺旋5，即包含從第236位的Gly到第253位的Ala所包含的氨基酸區(qū)段，α螺旋6，即包含從第262位的Val到第272位的Gln所包含的氨基酸區(qū)段，α螺旋7，即包含從第280位的Lys到第300位的Leu所包含的氨基酸區(qū)段，以及α螺旋3，即包含從第114位的Val到第124位的Tyr所包含的氨基酸區(qū)段。其中，α螺旋1、α螺旋2、α螺旋4、α螺旋5、α螺旋6和α螺旋7分布在中心β片層的一側(cè)，而α螺旋3分布在中心β片層的另一側(cè)。第六方面，本發(fā)明提供了蛋白酪氨酸磷酸酶ΡΤΡΝ12的晶體三維結(jié)構(gòu)在設(shè)計和篩選用于治療與ΡΤΡΝ12表達(dá)異常引起的疾病的各種多肽，蛋白質(zhì)、無機(jī)或有機(jī)化合物、抗體或免疫結(jié)合物中的應(yīng)用，包括:根據(jù)蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)坐標(biāo)，通過計算機(jī)模擬來設(shè)計結(jié)合在蛋白酪氨酸磷酸酶PTPNl2活性口袋的多肽、蛋白質(zhì)、無機(jī)或有機(jī)化合物、抗體或免疫結(jié)合物分子。第七方面，本發(fā)明提供了基于蛋白酪氨酸磷酸酶ΡΤΡΝ12蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)，探索其功能的方法，包括:通 過蛋白結(jié)晶方法獲得蛋白酪氨酸磷酸酶ΡΤΡΝ12的晶體，或者獲得蛋白酪氨酸磷酸酶ΡΤΡΝ12蛋白質(zhì)晶體的三維結(jié)構(gòu)坐標(biāo)，其中所述三維結(jié)構(gòu)包括任何與該坐標(biāo)中至少含有40%氨基酸殘基的主鏈碳骨架原子三維坐標(biāo)的平均根方差小于等于1.7埃的結(jié)構(gòu)；進(jìn)行生化實(shí)驗(yàn)分析驗(yàn)證基于結(jié)構(gòu)的預(yù)測理論。


圖1為ΡΤΡΝ12與PTP家族其它的催化部位氨基酸的序列比對，包括3種ΡΤΡΝ12蛋白家族的同源蛋白。這一對比結(jié)果表明，ΡΤΡΝ12具有與其他PTP蛋白的催化部位相似的高度保守氨基酸殘基。圖中用標(biāo)記出來的氨基酸表示保守性的。在說明書及權(quán)利要求書中具體的氨基酸位置均是以ΡΤΡΝ12的序只說明的。圖2:為蛋白酪氨酸磷酸酶ΡΤΡΝ12的三維結(jié)構(gòu)圖。具體為蛋白酪氨酸磷酸酶ΡΤΡΝ12的結(jié)構(gòu)飄帶圖的俯視圖，其中β折疊用黃色顯示，α螺旋用紅得顯示，ΡΤΡΝ12蛋白的活性中心的原子用藍(lán)色顯示，磷酸根用粉紅色球狀顯示。在說明書以及權(quán)力要求書中具體的氨基酸位置均是以圖2為例說明的。圖3:蛋白酪氨酸磷酸酶ΡΤΡΝ12的結(jié)構(gòu)飄帶圖的俯視圖，具體為圖1沿Y軸旋轉(zhuǎn)180°。其中β折疊用黃色顯示，α螺旋用紅得顯示，ΡΤΡΝ12蛋白的活性中心的原子用藍(lán)色顯示，磷酸根用粉紅色球狀顯示。圖4:ΡΤΡΝ12蛋白的活性中心存在一個磷酸根的穩(wěn)定性結(jié)合圖解。具體而言，PTPNl2的活性中心包括P型柔性區(qū)域(Ρ-loop區(qū)域)，即包括從第230位的His到第237位Arg，即H230CSAGCGR237區(qū)域，而一個磷酸根通過氫鍵與這些氨基酸主鏈上N氮原子相互作用，穩(wěn)定性結(jié)合在這里。具體的實(shí)施方式本發(fā)明人提供了一種將蛋白酪氨酸磷酸酶PTPN12進(jìn)行基因工程改造，以提高其在大腸桿菌中能夠得到高效表達(dá)、在常溫(攝氏37±5°C)下可以較長時間穩(wěn)定保持內(nèi)酰胺酶活性的蛋白的方法。通過X射線衍射晶體學(xué)方法解析了蛋白酪氨酸磷酸酶PTPN12三維晶體結(jié)構(gòu)。PTPNl2蛋白的表達(dá)純化方法:來源于人源PTPNl2基因，其編碼的蛋白質(zhì)序列為:PTPN12蛋白質(zhì)序列
MEQVEILRKFIQRVQAMKSPDHNGEDNFARDFMRLRRLSTKYRTEKIYPTATGEKEENVKKNRYKDILPFDHSRVKLTLKTPSQDSDYINANFIKGVYGPKAYVATQGPLANTVIDFWRMIWEYNVVIIVMACREFEMGRKKCERYWPLYGEDPITFAPFKISCEDEQARTDYFIRTLLLEFQNESRRLYQFHYVNWPDHDVPSSFDSILDMISLMRKYQEHEDVPICIHCSAGCGRTGAICAIDYTWNLLKAGKIPEEFNVFNLIQEMRTQRHSAVQTKEQYELVHRAIAQLFEKQLQLY-即Met Glu Gln Val Glu lie Leu Arg Lys Phe lie Gln Arg Val Gln Ala Met LysSer Pro Asp His Asn Gly Glu Asp Asn Phe Ala Arg Asp Phe Met Arg Leu Arg Arg LueGer Thr Lys Tyr Arg Thr Glu Lys lie Tyr Pro Thr Ala Thr Gly Glu Lys Glu GluAsn Val Lys Lys Asn Arg Tyr Lys Asp lie Leu Pro Phe Asp His Ser Arg Val Lys LeuThr Leu Lys Thr Pro Ser Gln Asp Ser Asp Thr lie Asn Ala Asn Phe lie Iys Gly ValThr Gly Pro Lys Gla Tyr Val Gla Thr Gln Gly Pro Leu Gla Asn Thr Val lie Asp PheTrp Arg Met lie Trp Glu Tyr Asn Val Val lie lie Val Met Gla Cys Arg Glu Phe GluMet Gly Arg Lys Lys Cys Glu Arg Tyr Trp Pro Leu Gly Glu Asp Pro lie Thr Phe LysGla Pro Phe Lys lie Ser Cys Glu Asp Glu Gln Gla Arg Thr Asp Tyr Phe lie Arg ThrLeu Leu Leu Glu Phe Gln Asn Glu Ser Arg Arg Leu Tyr Gln Phe His Tyr Val Asn TrpPro Asp His Asp Val Pro Ser Ser Phe Asp Ser lie Leu Asp Met lie Ser Leu Met ArgLys Tyr Gln Glu His Glu Asp Val Pro lie Cys lie His Cys Ser Gla Gly Cys Gly ArgThr Gly Gla lie Cys Gla lie Asp Tyr Thr Trp Asn Leu Leu Lys Gla Gly Lys lie ProGlu Glu Phe Asn Val Phe Asn Leu lie Gln Glu Met Arg Thr Gln Arg His Ser Gla ValGln Thr Lys Glu Gln Tyr Glu Leu Val His Arg Gla lie Gla Gln Leu Phe Glu Lys GlnLeu Gln Leu Tyr通過分子克隆技術(shù)將 PTPN12基因進(jìn)行克隆，克隆到pET_28a載體(GE)上，以便進(jìn)一步表達(dá)蛋白。將改造后的PTPN12基因克隆到pET-28a載體(GE)上表達(dá)氨基末端融合6XHis tag的融合蛋白(His-PTPN12)，將克隆的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21(DE3)中，在BL21 (DE3)中使用濃度為0.1mM的IPTG (異丙基-β -D硫代半乳糖苷)誘導(dǎo)大腸桿菌表達(dá)蛋白，具體參見實(shí)施例1實(shí)施例1改造蛋白酪氨酸磷酸酶ΡΤΡΝ12，用于大腸桿菌表達(dá)的方法本發(fā)明人初期嘗試將ΡΤΡΝ12蛋白進(jìn)行全長表達(dá)，歷經(jīng)在不同表達(dá)載體pGEX，pET等，以及不同表達(dá)菌株，如BL21(DE3)，BL21plys, C41等上的嘗試，均不能得到高純度蛋白。暗示著需要對NDM-1的基因進(jìn)行基因水平上的改造。經(jīng)過設(shè)計PCR擴(kuò)增引物，構(gòu)建了從PTPN12蛋白的羧基端開始，逐個刪除氨基酸的大量單克隆，得到了一個能夠大量表達(dá)純化和結(jié)晶的構(gòu)建，即為PTPNUMet1-Tyr3tllPTPNl2在大腸桿菌中的表汰鈍化通過分子克隆技術(shù)將PTPN12的N端(第I至301氨基酸)克隆到pET_28a載體(GE)上，其克隆位點(diǎn)是NheI及Xhol。將克隆的含有PTPN12基因的表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌的BL21(DE3)中，進(jìn)行蛋白的表達(dá)，從而使細(xì)菌可以表達(dá)蛋白N端(氣基端)連接有6XHis標(biāo)簽的融合蛋白。將構(gòu)建好的融合蛋白表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入BL21(DE3)中后，先在37度使用5mL的LB培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)，大約12小時后，轉(zhuǎn)接到800mL的LB培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)，再在37度下在搖瓶中培養(yǎng)至OD為0.4-0.6左右，大約為四小時，隨后降低培養(yǎng)溫度至16度，然后加入0.1mM的IPTG (異丙基-β-D硫代半乳糖苷)進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，大約16-20小時后通過離心收集細(xì)菌，用于純化。將離心收集的表達(dá)菌用含有約50mM Mes (pH6.5), 300MmNaCiamM DTT的緩沖液中懸浮，使用低溫超高壓細(xì)胞破碎儀(廣州聚能生物科技有限公司)裂解細(xì)胞，通過離心分離出不溶性沉淀，將高速離心(約16，OOOrmp)后獲得的上清通過Ni S印harose親和柱(GE)來初步分離純化PTPN12蛋白。目的蛋白就可以結(jié)合到親和柱上，但同時有雜蛋白也會由于非特異性結(jié)合結(jié)合到N1-NTA親和柱上，可以通過梯度咪唑洗脫來除去部分雜蛋白，經(jīng)過反復(fù)的實(shí)驗(yàn)摸索后，分別用含有50mM咪唑蛋白buffer和IOOmM咪唑蛋白buffer洗去一部分雜蛋白，親和作用結(jié)合到NI介質(zhì)上的目的蛋白純度可以達(dá)到80%,用300mM咪唑?qū)⒛康牡鞍紫疵撓聛?濃縮至Iml左右,換成蛋白buffer使用凝膠排阻層析(GE)和離子交換層析(GE)進(jìn)一步純化出PTPN12蛋白，純度一般可以達(dá)到99%以上。通過以上步驟純化的蛋白使用濃縮管濃縮至7mg/mL用于結(jié)晶實(shí)驗(yàn)。實(shí)施例2蛋白酪氨酸磷酸酶PTPN12的結(jié)晶及優(yōu)化:將用以上方法表達(dá)純化好的蛋白酪氨酸磷酸酶PTPN12濃縮至濃度約為5-lOmg/mL,用氣相懸滴法，使用結(jié)晶試劑(來自Hampton Research等公司的Screen Kitl/I1、Index等試劑盒)篩選晶體生長條件。經(jīng)過初步篩選，本發(fā)明人在結(jié)晶試劑條件下獲得了初始晶體。通過進(jìn)一步優(yōu)化，其中，在使用40mM KH2P04, 20% (v/w)Glycerine, and 30%(v/w)PEG 8000的條件下獲得了分辨率約為2.5埃左右的晶體，并進(jìn)而收集相應(yīng)的X射線衍射數(shù)據(jù)。實(shí)施例3蛋白酪氨酸磷酸酶PTPN12的晶體結(jié)構(gòu)PTPNl2的晶體在溫度為100K的液態(tài)氮?dú)獗Ｗo(hù)下，波長為0.97929埃的X光下收集到一套最高分辨率為2.6埃的晶體數(shù)據(jù)，利用HK2000 (Otwinowski 1997)處理數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)晶體為C2空間群，在每一個不對稱單元中都有一個單體，馬休斯系數(shù)VM為2.78人3/Da,對應(yīng)的溶劑含量為55.8%，復(fù)合物的結(jié)構(gòu)以PTPN22 (H)B ID:3H2X)的結(jié)構(gòu)作為初始搜索模型，通過PHASER進(jìn)行解析，在COOT里重新人工搭建模型，用PHENIX進(jìn)行初步的修正。在隨后的位置修正中，限制條件被放寬，依據(jù)Rfree的進(jìn)行溶劑校正，通過PR0CHECK證明了其幾何模型，在σΑ計算的Fo-Fc電子密度圖中，溶劑分子位于合理的峰上，最后的修正數(shù)據(jù)的模型是通過PYMOL計算展示出來的。實(shí)施例4PTPNl2的三維結(jié)構(gòu)
我們使用實(shí)施例3中的方法、軟件，完成了對ΡΤΡΝ12的結(jié)構(gòu)解析工作，使用軟件COOT、pymol,進(jìn)一步分析PTPN12的二級結(jié)構(gòu)組成、肽鏈走向、組織模式以及三維分子構(gòu)造。我們發(fā)現(xiàn)PTPN12蛋白在整體上呈現(xiàn)出典型的α+β的結(jié)構(gòu)模式。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可知，與其中所述晶體三維結(jié)構(gòu)中的原子具有表I中所列的至少40%的原子坐標(biāo)，或者PTPNl2蛋白的晶體三維結(jié)構(gòu)中至少40%氨基酸的主鏈碳骨架的原子結(jié)構(gòu)坐標(biāo)與表I中的坐標(biāo)的平均根方差小于或等于1.5埃的原子坐標(biāo)，均可被認(rèn)為與3D蛋白具有雷同結(jié)構(gòu)。
具體而言，PTPN12核心部分由8個反平行的β折疊構(gòu)成β片層，7個α螺旋圍繞在β片層的兩側(cè)。具體而言，核心β片層包括β折疊1，即包含從第91位的Ala到第94位的Ile所包含的氨基酸區(qū)段，β折疊2，即包含從第102位的Ala到第106位的Thr所包含的氨基酸區(qū)段，β折疊3，即包含從第128位的Ile到第131位的Met所包含的氨基酸區(qū)段，β折疊4，即包含從第155位的Ile到第157位的Phe所包含的氨基酸區(qū)段，β折疊5，即包含從第160位的Phe到第170位的Arg所包含的氨基酸區(qū)段，β折疊6，即包含從第173位的Tyr到第182位的Phe所包含的氨基酸區(qū)段，β折疊7，即包含從第185位的Glu到第194位的Tyr所包含的氨基酸區(qū)段，β折疊8，即包含從第227位的Ile到第230位的His所包含的氨基酸區(qū)段。分布在β片層兩側(cè)的α螺旋包括α螺旋1，即包含從第3位的Gln到第18位的Lys所包含的氨基酸區(qū)段，α螺旋2，即包含從第27位的Aln到第43位的Arg所包含的氨基酸區(qū)段，α螺旋4，即包含從第212位的Met到第219位的Tyr所包含的氨基酸區(qū)段，α螺旋5，即包含從第236位的Gly到第253位的Ala所包含的氨基酸區(qū)段，α螺旋6，即包含從第262位的Val到第272位的Gln所包含的氨基酸區(qū)段，α螺旋7，即包含從第280位的Lys到第300位的Leu所包含的氨基酸區(qū)段，以及α螺旋3，即包含從第114位的Val到第124位的Tyr所包含的氨基酸區(qū)段。其中，α螺旋1、α螺旋2、α螺旋4、α螺旋5、α螺旋6和α螺旋7分布在中心β片層的一側(cè)，而α螺旋3分布在中心β片層的另一側(cè)。此外在整個ΡΤΡΝ12的結(jié)構(gòu)中，我們發(fā)現(xiàn)在蛋白的活性中心存在一個磷酸根的穩(wěn)定性結(jié)合。具體而言，PTPN 12的活性中心包括P型柔性區(qū)域(Ρ-loop區(qū)域)，即包括從第230位的His到第237位Arg，即H230CSAGCGR237區(qū)域，而一個磷酸根通過氫鍵與這些氨基酸主鏈上N氮原子相互作用，穩(wěn)定性結(jié)合在這里。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表I單分子的PTPN12的N端結(jié)構(gòu)域原子坐標(biāo)群如下:注釋坐標(biāo)創(chuàng)建日期:2011年11月22日，編輯日期:2011年12月5日。注釋高分辨率范圍(埃):2.4
注釋低分辨率范圍(埃):50
權(quán)利要求
1.一種蛋白酪氨酸磷酸酶PTPN12晶體結(jié)構(gòu)，其中，所述的PTPN12為所述蛋白酪氨酸磷酸酶PTPN12的N端結(jié)構(gòu)域，從第I位到301位氨基酸共301位氨基酸的編碼基因。其中所述晶體三維結(jié)構(gòu)中的原子具有表I中所列的至少一部分的原子坐標(biāo)、或者任何與該坐標(biāo)中至少40%氨基酸殘基的主鏈碳骨架原子三維坐標(biāo)的平均根方差小于等于1.7埃的結(jié)構(gòu)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蛋白酪氨酸磷酸酶PTPN12的晶體結(jié)構(gòu)，其中，所述蛋白酪氨酸磷酸酶PTPN12為所述蛋白酪氨酸磷酸酶PTPN12全長蛋白序列的從I位氨基酸至301位氨基酸的編碼基因，即為Metl-Tyr301，以下所用編號均依據(jù)于此。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的PTPN12蛋白的晶體結(jié)構(gòu)，其中所述的晶體具有優(yōu)選的，其中所述的PTPN12的晶體具有C2的空間群，晶胞參數(shù)約為:a = 136埃，b = 41埃，c = 75埃，α = Y = 90°，β = 116° .
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的整個PTPN12的蛋白結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)出典型的α+β的結(jié)構(gòu)模式。其核心部分由8個反平行的β折疊構(gòu)成β片層，7個α螺旋圍繞在β片層的兩側(cè)。具體而言，核心β片層包括β折疊1，即包含從第91位的Ala到第94位的Ile所包含的氨基酸區(qū)段，β折疊2，即包含從第102位的Ala到第106位的Thr所包含的氨基酸區(qū)段，β折疊3，即包含從第128位的Ile到第131位的Met所包含的氨基酸區(qū)段，β折疊4，即包含從第155位的Ile到第157位的Phe所包含的氨基酸區(qū)段，β折疊5，即包含從第160位的Phe到第170位的Arg所包含的氨基酸區(qū)段，β折疊6，即包含從第173位的Tyr到第182位的Phe所包含的氨基酸區(qū)段，β折疊7，即包含從第185位的Glu到第194位的Tyr所包含的氨基酸區(qū)段，β折疊8，即包含從第227位的Ile到第230位的His所包含的氨基酸區(qū)段。分布在β片層兩側(cè)的α螺旋包括α螺旋1，即包含從第3位的Gln到第18位的Lys所包含的氨基酸區(qū)段，α螺旋2，即包含從第27位的Aln到第43位的Arg所包含的氨基酸區(qū)段，α螺旋4，即包含從第212位的Met到第219位的Tyr所包含的氨基酸區(qū)段，α螺旋5，即包含從第236位 的Gly到第253位的Ala所包含的氨基酸區(qū)段，α螺旋6，即包含從第262位的Val到第272位的Gln所包含的氨基酸區(qū)段，α螺旋7，即包含從第280位的Lys到第300位的Leu所包含的氨基酸區(qū)段，以及α螺旋3，即包含從第114位的Val到第124位的Tyr所包含的氨基酸區(qū)段。其中，α螺旋1、α螺旋2、α螺旋4、α螺旋5、α螺旋6和α螺旋7分布在中心β片層的一側(cè)，而α螺旋3分布在中心β片層的另一側(cè)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-3所述的ΡΤΡΝ12蛋白的晶體結(jié)構(gòu)，蛋白的活性中心存在一個磷酸根的穩(wěn)定性結(jié)合。具體而言，ΡΤΡΝ12的活性中心包括P型柔性區(qū)域(Ρ-loop區(qū)域)，即包括從第 230 位的 His 到第 237 位 Arg,即 H230CSAGCGR237 區(qū)域。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5所述的ΡΤΡΝ12蛋白的晶體結(jié)構(gòu)，其中蛋白的活性中心存在一個磷酸根的穩(wěn)定性結(jié)合，ΡΤΡΝ12晶體結(jié)構(gòu)及活性中心的發(fā)現(xiàn)為其功能的發(fā)掘與闡釋提供了理論指導(dǎo)依據(jù)，也為設(shè)計和篩選可能的抑制劑奠定了理論基礎(chǔ)。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)所述的蛋白酪氨酸磷酸酶ΡΤΡΝ12的晶體三維結(jié)構(gòu)在其功能研究、設(shè)計和篩選可能的抑制劑方面的應(yīng)用，包括: 根據(jù)蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)，通過計算機(jī)模擬來尋找可能的特定的活性位點(diǎn)或者結(jié)合口袋； 根據(jù)蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)，通過找到的可能的特定的活性位點(diǎn)或者結(jié)合口袋，找尋可能的底物類型，進(jìn)行生化實(shí)驗(yàn)，并將可能的特定的活性位點(diǎn)或者結(jié)合口袋中的氨基酸突變，驗(yàn)證突變的效果； 將根據(jù)蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)，結(jié)合上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，進(jìn)行體內(nèi)天然底物類型的發(fā)掘，并將之?dāng)U展到與所述的蛋白酪氨酸磷酸酶PTPN12序列相似性在至少30%的其他病毒種屬，進(jìn)而分析和總結(jié)。
8.一種純化PTPN12蛋白的方法，將權(quán)利I要求所述的PTPN12的基因連接于帶有標(biāo)簽的表達(dá)性質(zhì)粒載體中，轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)、純化。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中所述的標(biāo)簽選自GST、Flag-tag、Myc_tag、MBP-tag、His-tag、特異性抗體,所述載體含有選擇性標(biāo)記基因。
10.一種結(jié)晶前述權(quán)利要求中任何一項(xiàng)所述的PTPN12蛋白的方法，所述的方法包括:將PTPN12蛋白濃縮至5-10mg/mL，在4-30攝氏度下用氣相擴(kuò)散法篩選晶體生長條件。
11.一種衍射性能良好的根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的蛋白酪氨酸磷酸酶PTPNl2蛋白 質(zhì)晶體。
全文摘要
本發(fā)明提供一種蛋白酪氨酸磷酸酶PTPN12蛋白晶體三維結(jié)構(gòu)，所述的PTPN12為所述蛋白酪氨酸磷酸酶PTPN12的N端結(jié)構(gòu)域，從第1位到301位氨基酸共301位氨基酸的編碼基因。其中所述晶體三維結(jié)構(gòu)中的原子具有表1中所列的至少一部分的原子坐標(biāo)、或者任何與該坐標(biāo)中至少40％氨基酸殘基的主鏈碳骨架原子三維坐標(biāo)的平均根方差小于等于1.7埃的結(jié)構(gòu)。本發(fā)明還提供對蛋白酪氨酸磷酸酶PTPN12蛋白的表達(dá)、純化和結(jié)晶的方法；以及晶體結(jié)構(gòu)在功能研究、潛在藥物篩選及藥物設(shè)計方面的理論指導(dǎo)意義和應(yīng)用。
文檔編號C12N15/70GK103184200SQ20111045008
公開日2013年7月3日 申請日期2011年12月29日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月29日
發(fā)明者饒子和, 楊誠, 周紅剛, 王麗君, 張穎, 董輝, 王中玲, 常振英, 姚偉利 申請人:天津市國際生物醫(yī)藥聯(lián)合研究院有限公司